Introduction : Réaction de la lactate déshydrogénase

La réduction du pyruvate en lactate, catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH ; Pyruvate + NADH + H+ ⇌ Lactate + NAD+) dans le cytosol de nombreuses cellules, a été considérée comme un  » cul-de-sac  » métabolique (Luft, 2001 ; Quistorff et Grunnet, 2011a), ou peut-être plus justement, un cul de sac métabolique (Barros, 2013), car le lactate ne peut rejoindre le réseau métabolique que via le pyruvate. Chez les mammifères, la réaction de la LDH est également considérée comme étant « proche de l’équilibre » (Spriet et al., 2000 ; Quistorff et Grunnet, 2011a,b), ce qui signifie que la réaction est régulée principalement par les concentrations de ses réactifs et produits, plutôt que par des moyens plus sophistiqués de régulation allostérique ou de modification covalente (Crabtree et Newsholme, 1978). Étant donné que l’équilibre de la réaction de la LDH se situe loin vers la droite (c’est-à-dire que la formation de lactate est favorisée) (Williamson et al., 1967), quelle que soit l’isoforme de la LDH (Quistorff et Grunnet, 2011a,b), on pourrait en déduire que la LDH favorise rarement la réaction inverse (c’est-à-dire l’oxydation du lactate) in vivo. En effet, le rapport d’action de masse (/) nécessaire pour une oxydation appréciable du lactate devrait dépasser la constante d’équilibre de la LDH. Cependant, les preuves expérimentales démentent de plus en plus l’idée que la LDH fonctionne de manière unidirectionnelle in vivo, et soutiennent que le lactate sert de carburant métabolique important pour de nombreux tissus, y compris le squelette (Brooks et al., 1991 ; Bergman et al, 1999 ; Donovan et Pagliassotti, 2000) et le muscle cardiaque (Gertz et al., 1988 ; Chatham et al., 2001), le foie (Skilleter et Kun, 1972 ; Kline et al., 1986) et le cerveau (Schurr et al., 1988 ; Bouzier-Sore et al., 2006 ; Wyss et al., 2011 ; Funfschilling et al., 2012 ; revu dans Barros, 2013). L’objectif de la présente Perspective est de proposer un modèle dans lequel le lactate joue un rôle central dans le transfert de substrat énergétique entre le cytosol (glycolyse) et la mitochondrie (phosphorylation oxydative). Les composantes d’un tel concept ont été démontrées dans le cœur (Safer et al., 1971) et le muscle squelettique (Schantz, 1986), puis étendues à une perspective de navette du lactate (Stainsby et Brooks, 1990 ; Brooks et al., 1999) et revues de manière exhaustive (Gladden, 2004) et à nouveau commentées (Gladden, 2007). Le concept est particulièrement soutenu par des recherches récentes sur les cellules neuronales (Gellerich et al., 2012, 2013 ; Rueda et al., 2014). Bien que le concept décrit dans la présente Perspective ne soit pas nouveau en soi (Safer et al, 1971), un manque apparent de reconnaissance conventionnelle ou d’acceptation de ses fondements théoriques, justifie une attention supplémentaire.

La navette malate-aspartate

En raison de l’imperméabilité de la membrane mitochondriale interne au NAD+ et au NADH, le NADH généré par la glycolyse dans des conditions aérobies dépend du transfert indirect d’équivalents réducteurs dans les mitochondries via la navette malate-aspartate (MAS) et la navette glycérol-phosphate. On pense également que ces navettes régénèrent le NAD+ cytosolique nécessaire pour soutenir le flux glycolytique lors de la réaction de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase qui nécessite du NAD+. Il a été démontré que le MAS est le moyen prédominant par lequel cela se produit dans la plupart des tissus oxydés, et il semble constituer la principale navette de NADH dans les neurones matures (Kauppinen et al., 1987 ; Ramos et al., 2003 ; Contreras et Satrustegui, 2009 ; Gellerich et al., 2012). Il est également bien établi que dans des conditions d’augmentation de la demande d’énergie cellulaire et/ou du flux glycolytique (par exemple, lors d’un exercice intense), ainsi qu’en cas d’hypoxie, la concentration de lactate augmente car la réaction LDH facilite l’augmentation des taux de régénération du NAD+ cytosolique (Robergs et al., 2004). Dans le cerveau, cependant, l’augmentation de la concentration de lactate dans la circulation (par exemple, comme pendant l’exercice) entraîne une augmentation de l’élimination du lactate dans le cerveau (Quistorff et al., 2008 ; van Hall et al., 2009 ; Boumezbeur et al., 2010 ; Dienel, 2012). Il a également été suggéré que l’augmentation de l’activité de la LDH (et, à son tour, la production de lactate) compense simplement l’incapacité de la MAS à suivre le rythme de la demande cytosolique en NAD+ (Schantz, 1986). Dans les neurones, l’activation par le Ca+2 du MAS et du cycle TCA est compétitive, de sorte que de faibles niveaux de Ca+2 stimulent l’activité du MAS en activant le transporteur glutamate/aspartate (Contreras et Satrustegui, 2009), tandis que des concentrations plus élevées de Ca+2 activent l’α-cétoglutarate déshydrogénase dans la matrice mitochondriale, limitant l’α-cétoglutarate disponible pour le MAS (Contreras et Satrustegui, 2009). Il est également possible que le lactate soit formé en continu dans le cytosol, indépendamment de l’état métabolique, et que le lactate oxydé au niveau des mitochondries soit couplé au MAS. Dans les mitochondries cardiaques isolées, par exemple, le MAS présente une capacité excédentaire, ce qui suggère que l’activité du MAS est suffisante pour maintenir la régénération du NAD+ cytosolique (Digerness et Reddy, 1976). Pourquoi, alors, au repos et dans des conditions totalement aérobies, du lactate serait-il produit pendant la glycolyse, si tout le pyruvate devrait aller vers les mitochondries pour la phosphorylation oxydative, et si le MAS devrait régénérer suffisamment de NAD+ ?

Glycolyse (an)aérobie conventionnelle

L’apparition et la disparition du lactate pendant des états métaboliques variables a été un sujet de beaucoup de conjectures historiques, de controverses et d’intrigues. Il y a eu de nombreuses revues de la littérature examinant le métabolisme du lactate, vers lesquelles les lecteurs peuvent être dirigés. Parmi les plus récentes, citons (Cruz et al., 2012 ; Dienel, 2012 ; Kitaoka et al., 2012 ; Doherty et Cleveland, 2013 ; Newington et al., 2013 ; Brooks, 2014 ; Schurr, 2014 ; Todd, 2014). Malheureusement, de nombreux manuels contemporains utilisent encore le sort métabolique du pyruvate pour distinguer deux types de glycolyse : aérobie (c’est-à-dire nécessitant de l’oxygène) et anaérobie (c’est-à-dire sans oxygène). En présence d’oxygène, on a dit que le pyruvate se dirigeait vers les mitochondries pour y mourir métaboliquement par phosphorylation oxydative, le résultat net étant la resynthèse mitochondriale d’ATP et la consommation d’oxygène (c’est-à-dire la respiration) (Voet et al., 2011). À l’inverse, lorsque l’oxygène est limité, le pyruvate est réduit en lactate dans le cytosol par la LDH, oxydant son cofacteur NADH au cours du processus (Voet et al., 2011). Un problème avec cette construction traditionnelle est qu’elle ne se concilie pas bien avec certaines observations scientifiques récurrentes. Par exemple, il est bien établi que le lactate est produit, et consommé, dans des conditions totalement aérobies. En effet, chez des individus normoxiques en bonne santé, au repos dans un état postabsorptif, on peut s’attendre à ce qu’environ 50 μmol-min-1 de lactate soient libérés par le cerveau seul (van Hall et al., 2009 ; van Hall, 2010). Il est clair que le lactate est plus qu’un métabolite de déchets sans issue de la glycolyse anaérobie ; plutôt, la navette du lactate dans tout l’organisme fournit une perspective utile pour interpréter l’observation expérimentale.

Le concept de navette du lactate

Deux concepts de navette du lactate ont été avancés qui décrivent le mouvement et l’utilisation du lactate dans et entre les cellules (Brooks, 1998). L’hypothèse de la navette intracellulaire du lactate postule que le lactate formé pendant la glycolyse peut être continuellement utilisé comme source d’énergie à l’intérieur de la même cellule (Brooks, 1998). La navette intercellulaire ou cellule-cellule du lactate implique que le lactate généré et exporté d’une cellule est pris et utilisé par une autre cellule (Brooks, 1998). La navette lactate cellule-cellule est généralement acceptée, mais les détails plus fins de la navette lactate intracellulaire continuent d’être étudiés. Récemment, nous avons démontré une association à la fois physique et fonctionnelle de la LDH avec les mitochondries dans le muscle squelettique (Elustondo et al., 2013). En utilisant la microscopie confocale à balayage laser, nous avons confirmé la colocalisation de la LDH avec les protéines de la membrane mitochondriale dans le muscle squelettique du rat. Nous avons constaté que les mitochondries des fibres musculaires squelettiques de rats perméabilisées à la saponine oxydaient le lactate en présence de NAD+, de malate et d’ADP (Elustondo et al., 2013) ; un autre groupe a fait le même constat sur des fibres humaines (Jacobs et al., 2013). Le pyruvate est ensuite transporté dans les mitochondries où il est encore oxydé par la pyruvate déshydrogénase (PDH), puis par le cycle TCA, les équivalents réducteurs stimulant la respiration (Elustondo et al., 2013 ; Jacobs et al., 2013). Nous avons été en mesure d’inhiber la respiration avec seulement 5μM d’alpha-cyano-hydroxycinnamate, un inhibiteur du transport mitochondrial du pyruvate, ce qui confirme que le pyruvate, mais pas le lactate, est transporté dans la matrice mitochondriale. Ces résultats confirment que la LDH est stratégiquement positionnée pour interagir fonctionnellement avec les mitochondries, et suggèrent que l’oxydation du lactate se produit près de la surface externe de la membrane mitochondriale interne. Comment une navette intracellulaire de lactate pourrait-elle fonctionner dans une cellule intacte ? Revenons au MAS.

En vivo, le NAD+ cytosolique pourrait, en théorie, être régénéré par la malate déshydrogénase en dehors de la matrice mitochondriale, dans le cadre du MAS. La littérature donne un aperçu des différents tissus et de leurs activités de navette mitochondriale. Dans le cerveau, le MAS a été considéré comme le système de navette le plus important pour amener le NADH cytosolique dans les mitochondries (McKenna et al., 2006, et références) ; inversement, la navette glycérol-phosphate semble être de moindre importance (Nguyen et al., 2003). En effet, l’association intime du MAS et de la biosynthèse du glutamate, un neurotransmetteur, a été signalée (Palaiologos et al., 1988). Les activités publiées du MAS mesurées dans des mitochondries isolées du cerveau de rat sont de l’ordre de 26,7 nmol-min-1-mg-1 (Pardo et al., 2006). Dans les synaptosomes, l’inhibition pharmacologique du MAS entraîne une diminution prononcée (i.e. 50%) de l’oxydation du lactate (McKenna et al., 1993), soutenant le modèle illustré dans la Figure 1. La production intracérébrale de lactate à partir de glucose marqué au 13C soutient en outre l’idée que le lactate est un carburant important pour les neurones (Sampol et al., 2013).

Il faut noter que le MAS peut avoir ses limites. À des charges de travail cardiaques élevées, il a été démontré que le transporteur α-cétoglutarate/malate de la membrane mitochondriale interne ne peut pas rivaliser avec l’α-cétoglutarate déshydrogénase matricielle pour leur substrat partagé, l’α-cétoglutarate (O’Donnell et al., 2004). Il en résulte un effet limitant pour la MAS et son transfert de NADH dans les mitochondries. L’effet net de cette limitation du MAS serait une augmentation de la concentration de lactate cytosolique car la régénération du NAD+ par la réaction LDH aiderait à préserver le NAD+/NADH homéostatique, même en présence d’oxygène adéquat. En effet, c’est le phénomène classique observé lors d’un exercice particulièrement intense où le lactate peut s’accumuler dans le sang, malgré une disponibilité adéquate d’oxygène.

Cloisonnement intracellulaire de la LDH : leçons de la navette phosphocréatine

La notion de navette de composés entre la mitochondrie et le cytosol pour répondre aux demandes énergétiques de la cellule en utilisant des enzymes proches de l’équilibre n’est certainement pas nouvelle. La navette phosphocréatine (PCr) fait appel à des isoformes distinctes de créatine kinase (CK) mitochondriale et cytosolique pour transporter essentiellement le phosphate « haute énergie » de la mitochondrie au cytosol. Comme la réaction de la LDH, la réaction de la CK (phosphocréatine + ADP + H+ ⇌ créatine + ATP), est considérée comme étant « proche de l’équilibre », favorisant la resynthèse de l’ATP. Cependant, des preuves expérimentales démontrent que dans les cellules myocardiques, seule la CK cytosolique est réellement à l’équilibre, ou presque (revue dans Joubert et al., 2004). En revanche, la CK mitochondriale, localisée dans l’espace intermembranaire, n’est pas à l’équilibre, ce qui favorise la resynthèse nette de PCr. Par analogie, on pense que deux populations distinctes de LDH sont impliquées dans la navette intracellulaire du lactate : cytosolique et mitochondriale. La LDH cytosolique serait à l’équilibre ou proche de l’équilibre, tandis que la LDH mitochondriale serait déplacée de l’équilibre. La LDH cytosolique favoriserait la production nette de lactate, tandis que la LDH mitochondriale favoriserait l’oxydation du lactate. Et tout comme l’adénine nucléotide translocase (ANT), qui transporte l’ADP dans la matrice à travers la membrane mitochondriale interne en échange d’ATP, facilite le déplacement de l’équilibre pour le CK mitochondrial dans l’espace intermembranaire, le transporteur de pyruvate transporterait continuellement le pyruvate, déplaçant la réaction LDH mitochondriale de l’équilibre (Figure 1). Une telle navette de lactate bénéficierait de la localisation de la LDH dans l’espace intermembranaire près de la membrane mitochondriale interne, liée à l’extérieur de la membrane mitochondriale externe aux sites de contact de la membrane mitochondriale externe et interne, ou les deux. Si l’oxydation intracellulaire du lactate doit se produire au niveau des mitochondries par compartimentation, comme pour la navette PCr, la localisation cellulaire de la LDH dans, sur ou autour des mitochondries serait une caractéristique saillante.

Cloisonnement intercellulaire du métabolisme du lactate : la navette du lactate astrocyte-neuron

Un corpus riche et croissant de recherches neuroénergétiques soutient également l’existence d’un métabolisme du lactate compartimenté entre les cellules cérébrales voisines – à savoir, les astrocytes et les neurones (revue dans Pellerin et Magistretti, 2012). Une variante de la navette intercellulaire de lactate généralement (Brooks, 2009), la navette de lactate astrocyte-neurone (Pellerin et Magistretti, 2012) est basée sur l’idée que les astrocytes sont principalement glycolytiques, tandis que les neurones sont plus oxydatifs (Bouzier-Sore et Pellerin, 2013 et références). En utilisant une approche de modélisation métabolique, il a été soutenu qu’un flux métabolique plus important à travers la PDH et les navettes NADH mitochondriales dans les neurones par rapport aux astrocytes dicte nécessairement la libération nette de lactate par les astrocytes et l’oxydation par les neurones (Neves et al.2012), soutenant de nombreuses observations expérimentales (revues dans Bouzier-Sore et Pellerin, 2013). Comme mentionné précédemment, le MAS constitue la principale navette mitochondriale du NADH dans les neurones matures (Kauppinen et al., 1987 ; Ramos et al., 2003 ; Contreras et Satrustegui, 2009 ; Gellerich et al., 2012). Par conséquent, une caractéristique importante du neurone consommateur de lactate pourrait bien être son activité MAS élevée (Neves et al., 2012). L’heure est-elle venue d’une navette lactate-malate-aspartate ? Y a-t-il un soutien théorique supplémentaire pour un tel modèle dans lequel le lactate sert d’équivalent réducteur ?

Régénération du NAD+ cytosolique

L’oxydation du lactate au niveau de la mitochondrie donne encore plus de sens à la glycolyse aérobie en permettant la régénération du NAD+ cytosolique par la LDH cytosolique. En effet, les données recueillies sur des cellules en culture indiquent que le rapport lactate/pyruvate est très labile et qu’il varie pour préserver le rapport homéostatique NAD+/NADH (Sun et al., 2012). Cela serait avantageux pour la cellule pour un certain nombre de raisons. Premièrement, cela fournirait un moyen immédiat de régénérer le NAD+ localement (c’est-à-dire dans le cytosol, où se produit la glycolyse) ; la plus grande diffusabilité relative du lactate (poids moléculaire = 89,07 g/mol) par rapport au NAD+ (poids moléculaire = 663,43 g/mol) signifie que le lactate peut facilement diffuser hors de la cellule dans des conditions de flux glycolytique accru (par exemple, exercice intense, stress hypoxique), tout en étant dirigé vers les mitochondries. Pendant les périodes de demande d’énergie cellulaire réduite, la production continue de lactate pendant des taux beaucoup plus faibles de flux glycolytique serait encore utilisée pour maintenir le NAD+/NADH homéostatique à l’intérieur de la cellule, ainsi que pour le couplage continu de la navette de lactate intracellulaire au MAS.

Nutation des protons et transport mitochondrial des substrats

L’oxydation du lactate au niveau de la mitochondrie donne un sens à la glycolyse aérobie car la production de lactate dans le cytosol consomme effectivement un proton (Robergs et al, 2004), ce qui contribuerait à atténuer l’acidose métabolique associée à un renouvellement accru de l’ATP et à des taux élevés de glycolyse (Robergs et al., 2004). La concentration cytosolique de lactate dépasse généralement celle du pyruvate d’au moins 10 fois, ce qui signifie que le lactate, et non le pyruvate, est le monocarboxylate prédominant qui entre dans l’espace intermembranaire des mitochondries (Brooks et al., 1999). En oxydant le lactate dans l’espace intermembranaire mitochondrial, des protons seraient libérés où ils pourraient contribuer à la composante ΔpH de la force motrice protonique mitochondriale à travers la membrane interne (Santo-Domingo et Demaurex, 2012), et/ou être transportés indirectement dans la mitochondrie par le MAS. Comme pour le transport du phosphate inorganique et de certains autres substrats et ions (Santo-Domingo et Demaurex, 2012), le transport du pyruvate par les transporteurs à travers la membrane mitochondriale interne dans les mitochondries de foie de rat semble être directement couplé à un symport de protons (ou antiport OH-) (Papa et al., 1971 ; Halestrap, 1975). L’oxydation du lactate près de la surface externe de la membrane mitochondriale interne, qui libère un proton, contribuerait au ΔpH, et à son tour, au transport du pyruvate dans la matrice. Au voisinage de la membrane mitochondriale interne, le rapport d’action de masse de la LDH (c’est-à-dire les concentrations de produits/concentrations de réactions) pourrait être largement facilité par la « purge » du pyruvate lors de son transport continu à travers la membrane mitochondriale interne imperméable au lactate, ainsi que par une régénération généreuse de NAD+ par la malate déshydrogénase extra-matrice du MAS. Dans ce modèle, le transport du pyruvate à travers la membrane mitochondriale interne influencerait directement le taux d’oxydation du lactate juste à l’extérieur de la matrice. On s’attendrait donc à ce que l’oxydation du lactate au niveau des mitochondries soit régulée indirectement au niveau de la réaction PDH dans la matrice. Cela serait avantageux car, contrairement à la LDH, la PDH est fortement régulée par l’allostérie et la modification covalente. Comme mentionné, la modélisation prédit qu’une activité PDH élevée dicte la consommation de lactate neuronale in vivo (Neves et al., 2012) ; et une activité PDH élevée caractérise également les neurones consommateurs de lactate en culture (Halim et al…, 2010).

Considérations méthodologiques

Si l’oxydation mitochondriale du lactate est fonctionnellement liée à l’activité de la MAS, il serait alors important d’inclure des composants de la MAS dans les analyses in vitro de l’oxydation mitochondriale du lactate, comme le malate lui-même ou l’oxaloacétate. Le malate est le choix probable, car il est couramment inclus pour stimuler la respiration in vitro, où il est transporté dans la matrice et oxydé par la malate déshydrogénase mitochondriale en oxaloacétate. Cet oxaloacétate peut ensuite se condenser avec l’acétyl coA formé, par exemple, lorsque du pyruvate est ajouté. L’inclusion du glutamate en plus du malate, permet le fonctionnement complet du MAS au niveau de la respiration mitochondriale. Un aspect important, mais parfois négligé, de l’évaluation appropriée de l’oxydation mitochondriale du lactate est l’inclusion de NAD+ comme cofacteur requis pour la réaction LDH, et d’ADP comme accepteur de phosphate pour stimuler la phosphorylation oxydative (c’est-à-dire la respiration d’état 3). En outre, la composante extra-matricielle du MAS implique la réaction de la malate déshydrogénase : oxaloacétate + NADH + H+ ⇌ malate + NAD+. Les protocoles expérimentaux examinant la consommation d’oxygène respiratoire dans les mitochondries isolées du muscle en utilisant des concentrations élevées de malate (par exemple, 4 mM ; Rasmussen et al., 2002), peuvent favoriser la réaction de la malate déshydrogénase dans le sens inverse (c’est-à-dire l’oxydation du malate et la production de NADH + H+) lorsqu’elle est ajoutée à l’échantillon mitochondrial en combinaison avec du NAD+. En effet, la réversibilité de la MAS a été observée dans des hépatocytes isolés (Berry, 1971) et des mitochondries avec une MAS reconstituée (Kunz et Davis, 1991). L’effet net de cette inversion du MAS sur la respiration serait de réduire l’entrée du malate dans la mitochondrie, formant ainsi de l’oxaloacétate. Plus important encore, l’inversion empêcherait l’oxydation du lactate en pyruvate, puis le transport et l’oxydation du pyruvate dans la matrice. Les solutions à ces barrières méthodologiques pour observer l’oxydation mitochondriale du lactate in vitro impliquent d’inclure au moins un composant du MAS. Si l’on ajoute du malate, la concentration appropriée doit être déterminée expérimentalement. L’inclusion d’ADP et de NAD+ ou de NADH (rappelons que le MAS générera du NAD+ pour la réaction LDH) est également nécessaire pour observer une oxydation mitochondriale appréciable du lactate.

Résumé

Un lactate-MAS est l’interaction entre les navettes lactate et malate-aspartate pour transloquer le pouvoir réducteur vers les mitochondries, en particulier au sein des cellules oxydatives et métaboliquement actives.

Déclaration de conflit d’intérêts

L’auteur déclare que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Moyens remerciements au Dr Erich Gnaiger (Université médicale d’Innsbruck), et au Dr George Brooks (Université de Californie, Berkeley) pour avoir chacun critiqué des versions antérieures de ce travail.

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