Introduzione: Reazione della lattato deidrogenasi

La riduzione del piruvato a lattato, catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH; piruvato + NADH + H+ ⇌ lattato + NAD+) nel citosol di molte cellule, è stata considerata un “vicolo cieco” metabolico (Luft, 2001; Quistorff e Grunnet, 2011a), o forse più giustamente, un cul de sac metabolico (Barros, 2013), perché il lattato può rientrare nella rete metabolica solo attraverso il piruvato. Nei mammiferi, la reazione LDH è anche considerata “quasi in equilibrio” (Spriet et al., 2000; Quistorff e Grunnet, 2011a,b), il che significa che la reazione è regolata principalmente dalle concentrazioni dei suoi reagenti e prodotti, piuttosto che da mezzi più sofisticati di regolazione allosterica o modifica covalente (Crabtree e Newsholme, 1978). Poiché l’equilibrio per la reazione LDH si trova molto a destra (cioè, la formazione di lattato favorita) (Williamson et al., 1967), indipendentemente dalla isoforma LDH (Quistorff e Grunnet, 2011a,b), l’implicazione potrebbe essere che LDH raramente favorisce la reazione inversa (cioè, l’ossidazione del lattato) in vivo. Infatti, il rapporto massa-azione (/) necessario per un’apprezzabile ossidazione del lattato dovrebbe superare la costante di equilibrio della LDH. Tuttavia, l’evidenza sperimentale smentisce sempre di più qualsiasi nozione che la LDH operi in modo unidirezionale in vivo, e sostiene che il lattato serve come un importante carburante metabolico per molti tessuti, compresi quelli scheletrici (Brooks et al., 1991; Bergman et al, 1999; Donovan e Pagliassotti, 2000) e muscolo cardiaco (Gertz et al., 1988; Chatham et al., 2001), fegato (Skilleter e Kun, 1972; Kline et al., 1986) e cervello (Schurr et al., 1988; Bouzier-Sore et al., 2006; Wyss et al., 2011; Funfschilling et al., 2012; rivisto in Barros, 2013). Lo scopo della presente prospettiva è quello di avanzare un modello in cui il lattato è centrale per la navetta di substrato energetico tra il citosol (glicolisi) e i mitocondri (fosforilazione ossidativa). I componenti di tale concetto sono stati dimostrati nel cuore (Safer et al., 1971) e nel muscolo scheletrico (Schantz, 1986), sono stati successivamente estesi a una prospettiva di navetta del lattato (Stainsby e Brooks, 1990; Brooks et al., 1999) e ampiamente rivisti (Gladden, 2004) e nuovamente commentati (Gladden, 2007). Il concetto è particolarmente sostenuto da recenti ricerche in cellule neuronali (Gellerich et al., 2012, 2013; Rueda et al., 2014). Mentre il concetto delineato nella presente prospettiva non è nuovo, di per sé (Safer et al, 1971), un’apparente mancanza di riconoscimento convenzionale o di accettazione dei suoi fondamenti teorici merita ulteriore attenzione.

La navetta malato-aspartato

A causa dell’impermeabilità della membrana mitocondriale interna a NAD+ e NADH, il NADH generato dalla glicolisi in condizioni aerobiche dipende dal trasferimento indiretto di equivalenti riducenti nei mitocondri attraverso la navetta malato-aspartato (MAS) e la navetta glicerolo-fosfato. Queste navette sono anche pensate per rigenerare il NAD+ citosolico necessario per sostenere il flusso glicolitico alla reazione della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi che richiede NAD+. È stato dimostrato che la MAS è il mezzo predominante con cui questo avviene nella maggior parte dei tessuti ossidativi, e sembra costituire la principale navetta di NADH nei neuroni maturi (Kauppinen et al., 1987; Ramos et al., 2003; Contreras e Satrustegui, 2009; Gellerich et al., 2012). È anche ben stabilito che in condizioni di aumento della domanda di energia cellulare e/o di aumento del flusso glicolitico (ad esempio, durante l’esercizio fisico intenso), così come l’ipossia, la concentrazione di lattato aumenterà poiché la reazione LDH facilita l’aumento dei tassi di rigenerazione del NAD+ citosolico (Robergs et al., 2004). Nel cervello, tuttavia, l’aumento della concentrazione di lattato in circolazione (ad esempio, come durante l’esercizio) si traduce in un aumento dello smaltimento del lattato nel cervello (Quistorff et al., 2008; van Hall et al., 2009; Boumezbeur et al., 2010; Dienel, 2012). È stato anche suggerito che l’aumentata attività della LDH (e, a sua volta, la produzione di lattato) compensi semplicemente l’incapacità del MAS di tenere il passo con la domanda citosolica di NAD+ (Schantz, 1986). Nei neuroni, l’attivazione del Ca+2 della MAS e del ciclo TCA sono competitive, in modo tale che livelli più bassi di Ca+2 stimolano l’attività della MAS attivando il trasportatore glutammato/aspartato (Contreras e Satrustegui, 2009), mentre concentrazioni più alte di Ca+2 attivano l’α-chetoglutarato deidrogenasi nella matrice mitocondriale, limitando l’α-chetoglutarato disponibile per la MAS (Contreras e Satrustegui, 2009). È anche possibile che il lattato si formi continuamente nel citosol, indipendentemente dallo stato metabolico, e che il lattato ossidato nei mitocondri sia accoppiato alla MAS. Nei mitocondri cardiaci isolati, per esempio, il MAS mostra una capacità in eccesso, suggerendo che l’attività del MAS da sola è sufficiente a mantenere la rigenerazione citosolica del NAD+ (Digerness e Reddy, 1976). Perché, allora, a riposo e in condizioni completamente aerobiche, dovrebbe essere prodotto lattato durante la glicolisi, se tutto il piruvato dovrebbe andare ai mitocondri per la fosforilazione ossidativa, e il MAS dovrebbe rigenerare sufficiente NAD+?

Glicolisi (an)aerobica convenzionale

La comparsa e la scomparsa del lattato durante i vari stati metabolici è stato un argomento di molte congetture storiche, controversie e curiosità. Ci sono state molte revisioni della letteratura che esaminano il metabolismo del lattato, a cui i lettori possono essere indirizzati. Alcune delle più recenti includono (Cruz et al., 2012; Dienel, 2012; Kitaoka et al., 2012; Doherty e Cleveland, 2013; Newington et al., 2013; Brooks, 2014; Schurr, 2014; Todd, 2014). Purtroppo, molti libri di testo contemporanei usano ancora il destino metabolico del piruvato per distinguere due tipi di glicolisi: aerobica (cioè che richiede ossigeno) e anaerobica (cioè senza ossigeno). In presenza di ossigeno, è stato detto, il piruvato procederà verso i mitocondri per incontrare la sua fine metabolica attraverso la fosforilazione ossidativa, il cui risultato netto è la risintesi mitocondriale di ATP e il consumo di ossigeno (cioè, la respirazione) (Voet et al., 2011). Al contrario, quando l’ossigeno è limitante, il piruvato viene ridotto a lattato nel citosol dalla LDH, ossidando il suo cofattore NADH nel processo (Voet et al., 2011). Un problema con questo costrutto tradizionale è che non si concilia bene con alcune osservazioni scientifiche ricorrenti. Per esempio, è ben stabilito che il lattato è prodotto, e consumato, in condizioni completamente aerobiche. Infatti, in individui sani e normotossici a riposo nello stato post-sbornia, ci si può aspettare che circa 50 μmol-min-1 di lattato siano rilasciati dal solo cervello (van Hall et al., 2009; van Hall, 2010). Chiaramente, il lattato è più di un metabolita di scarto della glicolisi anaerobica; piuttosto, lo shuttling del lattato in tutto l’organismo fornisce una prospettiva utile in cui interpretare l’osservazione sperimentale.

Il concetto di shuttle del lattato

Sono stati avanzati due concetti di shuttle del lattato che descrivono il movimento e l’utilizzo del lattato all’interno e tra le cellule (Brooks, 1998). L’ipotesi della navetta intracellulare del lattato postula che il lattato formato durante la glicolisi possa essere continuamente utilizzato come fonte di energia all’interno della stessa cellula (Brooks, 1998). La navetta intercellulare o cellula-cellula del lattato coinvolge il lattato generato ed esportato da una cellula per essere assunto e utilizzato da un’altra cellula (Brooks, 1998). La navetta cellula-cellula di lattato ha guadagnato l’accettazione generale; i dettagli più fini della navetta intracellulare di lattato continuano ad essere studiati, tuttavia. Recentemente, abbiamo dimostrato sia un’associazione fisica che funzionale di LDH con i mitocondri nel muscolo scheletrico (Elustondo et al., 2013). Utilizzando la microscopia confocale a scansione laser, abbiamo confermato la colocalizzazione della LDH con le proteine di membrana mitocondriali nel muscolo scheletrico di ratto. Abbiamo scoperto che i mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche di ratto permeabilizzate con saponina ossidavano il lattato in presenza di NAD+, malato e ADP (Elustondo et al., 2013); questo è stato trovato in modo simile da un altro gruppo in fibre umane (Jacobs et al., 2013). Il piruvato è stato poi trasportato nei mitocondri dove è stato ulteriormente ossidato dalla piruvato deidrogenasi (PDH), quindi dal ciclo TCA, con equivalenti riducenti che stimolano la respirazione (Elustondo et al., 2013; Jacobs et al., 2013). Siamo stati in grado di inibire la respirazione con soli 5μM di alfa-ciano-idrossicinnamato, un inibitore del trasporto mitocondriale del piruvato, sostenendo ulteriormente che il piruvato, ma non il lattato viene trasportato nella matrice mitocondriale. Questi risultati sostengono che la LDH è strategicamente posizionata per interagire funzionalmente con i mitocondri e suggeriscono che l’ossidazione del lattato avviene vicino alla superficie esterna della membrana mitocondriale interna. Come potrebbe funzionare una navetta intracellulare del lattato in una cellula intatta? Torniamo al MAS.

In vivo, il NAD+ citosolico potrebbe, in teoria, essere rigenerato dalla malato deidrogenasi fuori dalla matrice mitocondriale, come parte del MAS. La letteratura fornisce alcune informazioni sui diversi tessuti e sulle loro attività di shuttling mitocondriale. Nel cervello, il MAS è stato considerato il sistema di shuttle più importante per portare il NADH citosolico nei mitocondri (McKenna et al., 2006, e relativi riferimenti); al contrario, lo shuttle glicerolo-fosfato sembra essere di minore importanza (Nguyen et al., 2003). Infatti, l’intima associazione della MAS e la biosintesi del neurotrasmettitore glutammato è stata riportata (Palaiologos et al., 1988). Le attività pubblicate della MAS misurate nei mitocondri isolati dal cervello di ratto sono dell’ordine di 26,7 nmol-min-1-mg-1 (Pardo et al., 2006). Nei sinaptosomi, l’inibizione farmacologica del MAS risulta in una diminuzione pronunciata (50%) dell’ossidazione del lattato (McKenna et al., 1993), sostenendo il modello illustrato nella Figura 1. La produzione intracerebrale di lattato dal glucosio marcato con 13C supporta ulteriormente la nozione che il lattato è un importante carburante per i neuroni (Sampol et al., 2013).

Si noti che il MAS può avere i suoi limiti. Ad alti carichi di lavoro cardiaci, è stato dimostrato che il trasportatore α-chetoglutarato/malato della membrana mitocondriale interna non può competere con la matrice α-chetoglutarato deidrogenasi per il loro substrato condiviso, l’α-chetoglutarato (O’Donnell et al., 2004). Questo si traduce in un effetto limitante per il MAS e il suo trasferimento di NADH nei mitocondri. L’effetto netto di questa limitazione al MAS sarebbe un aumento della concentrazione citosolica di lattato, poiché la rigenerazione di NAD+ attraverso la reazione LDH aiuterebbe a preservare il NAD+/NADH omeostatico, anche in presenza di ossigeno adeguato. Infatti, questo è il classico fenomeno osservato durante un esercizio particolarmente faticoso, dove il lattato può accumularsi nel sangue, nonostante un’adeguata disponibilità di ossigeno.

Compartimentalizzazione intracellulare di LDH: lezioni dalla navetta della fosfocreatina

La nozione di fare la spola tra i mitocondri e il citosol per soddisfare le richieste energetiche della cellula utilizzando enzimi quasi in equilibrio non è certamente nuova. La navetta fosfocreatina (PCr) coinvolge distinte isoforme di creatina chinasi (CK) mitocondriali e citosoliche per trasportare essenzialmente fosfato “ad alta energia” dai mitocondri al citosol. Come la reazione LDH, la reazione CK (fosfocreatina + ADP + H+ ⇌ creatina + ATP), è considerata “quasi in equilibrio”, favorendo la risintesi dell’ATP. Tuttavia, l’evidenza sperimentale dimostra che nelle cellule miocardiche, solo la CK citosolica è effettivamente all’equilibrio, o quasi (rivista in Joubert et al., 2004). La CK mitocondriale, invece, localizzata nello spazio intermembrana, è spostata dall’equilibrio, favorendo la risintesi netta della PCr. Per analogia, si pensa che due popolazioni distinte di LDH siano coinvolte nella navetta intracellulare del lattato: citosolica e mitocondriale. L’LDH citosolico sarebbe all’equilibrio o vicino all’equilibrio, mentre l’LDH mitocondriale sarebbe spostato dall’equilibrio. L’LDH citosolico favorirebbe la produzione netta di lattato, mentre l’LDH mitocondriale favorirebbe l’ossidazione del lattato. E proprio come l’adenina nucleotide translocase (ANT), che trasporta ADP nella matrice attraverso la membrana mitocondriale interna in cambio di ATP, facilita lo spostamento dall’equilibrio per il CK mitocondriale nello spazio intermembrana, così anche il trasportatore di piruvato trasporterebbe continuamente piruvato, spostando la reazione LDH mitocondriale dall’equilibrio (Figura 1). Una tale navetta del lattato trarrebbe vantaggio dalla localizzazione della LDH nello spazio intermembrana vicino alla membrana mitocondriale interna, legata all’esterno della membrana mitocondriale esterna nei siti di contatto della membrana mitocondriale esterna e interna, o entrambi. Se l’ossidazione intracellulare del lattato deve avvenire nei mitocondri attraverso la compartimentazione, come con la navetta PCr, la localizzazione cellulare della LDH in, presso o intorno ai mitocondri sarebbe una caratteristica saliente.

Compartimentalizzazione intercellulare del metabolismo del lattato: la navetta lattato astrociti-neuroni

Un corpo ricco e crescente di ricerca neuroenergetica supporta anche l’esistenza di un metabolismo compartimentato del lattato tra cellule cerebrali vicine, vale a dire astrociti e neuroni (recensione in Pellerin e Magistretti, 2012). Una variante della navetta intercellulare del lattato in generale (Brooks, 2009), la navetta lattato astrociti-neuroni (Pellerin e Magistretti, 2012) si basa sull’idea che gli astrociti sono prevalentemente glicolitici, mentre i neuroni sono più ossidativi (Bouzier-Sore e Pellerin, 2013 e riferimenti ivi). Utilizzando un approccio di modellazione metabolica, è stato sostenuto che un maggiore flusso metabolico attraverso PDH e le navette mitocondriali NADH nei neuroni rispetto agli astrociti detta necessariamente il rilascio netto di lattato da parte degli astrociti e l’ossidazione da parte dei neuroni (Neves et al., 2012), sostenendo molte osservazioni sperimentali (rivisto in Bouzier-Sore e Pellerin, 2013). Come accennato in precedenza, il MAS costituisce la principale navetta mitocondriale NADH nei neuroni maturi (Kauppinen et al., 1987; Ramos et al., 2003; Contreras e Satrustegui, 2009; Gellerich et al., 2012). Quindi, una caratteristica importante del neurone consumatore di lattato potrebbe essere la sua elevata attività MAS (Neves et al., 2012). È il momento di una navetta lattato-malato-aspartato? C’è un ulteriore supporto teorico per un modello in cui il lattato serve come equivalente riducente?

Rigenerazione del NAD+ citosolico

L’ossidazione del lattato al mitocondrio dà un ulteriore senso alla glicolisi aerobica, permettendo la rigenerazione del NAD+ citosolico da parte della LDH citosolica. Infatti, l’evidenza in cellule coltivate indica un rapporto lattato/piruvato altamente labile che varia per preservare il NAD+/NADH omeostatico (Sun et al., 2012). Questo sarebbe vantaggioso per la cellula per una serie di ragioni. In primo luogo, fornirebbe un mezzo immediato con cui rigenerare NAD+ localmente (cioè, nel citosol, dove avviene la glicolisi); la maggiore diffusibilità relativa del lattato (peso molecolare = 89,07 g/mol) rispetto al NAD+ (peso molecolare = 663,43 g/mol) significa che il lattato può diffondere facilmente dalla cellula in condizioni di aumento del flusso glicolitico (ad esempio, esercizio intenso, stress ipossico), mentre viene anche diretto verso i mitocondri. Durante i periodi di ridotta domanda di energia cellulare, la produzione continua di lattato durante tassi molto più bassi di flusso glicolitico sarebbe ancora utilizzato per mantenere omeostatico NAD + / NADH all’interno della cella, così come per continuare l’accoppiamento del lattato intracellulare shuttling al MAS.

Trasporto di protoni e trasporto mitocondriale di substrati

L’ossidazione del lattato nei mitocondri ha senso nella glicolisi aerobica perché la produzione di lattato nel citosol consuma effettivamente un protone (Robergs et al, 2004), che si pensa aiuti a mitigare l’acidosi metabolica associata all’aumento del turnover dell’ATP e agli alti tassi di glicolisi (Robergs et al., 2004). La concentrazione citosolica del lattato supera tipicamente quella del piruvato di almeno 10 volte, il che significa che il lattato, e non il piruvato, è il monocarbossilato predominante che entra nello spazio intermembrana dei mitocondri (Brooks et al., 1999). Ossidando il lattato nello spazio intermembrana mitocondriale, i protoni verrebbero rilasciati dove potrebbero contribuire alla componente ΔpH della forza motrice protonica mitocondriale attraverso la membrana interna (Santo-Domingo e Demaurex, 2012), e/o essere trasportati indirettamente nei mitocondri dal MAS. Come per il trasporto del fosfato inorganico e di alcuni altri substrati e ioni (Santo-Domingo e Demaurex, 2012), il trasporto mediato dal trasportatore del piruvato attraverso la membrana mitocondriale interna nei mitocondri del fegato di ratto sembra essere direttamente accoppiato al simporto protonico (o OH- antiport) (Papa et al., 1971; Halestrap, 1975). L’ossidazione del lattato vicino alla superficie esterna della membrana mitocondriale interna, che rilascia un protone, contribuirebbe al ΔpH e, a sua volta, al trasporto del piruvato nella matrice. Adiacente alla membrana mitocondriale interna, il rapporto massa azione LDH (cioè, concentrazioni di prodotti/concentrazioni di reazioni) potrebbe essere largamente facilitato dal “sanguinamento” del piruvato mentre viene continuamente trasportato attraverso la membrana mitocondriale interna impermeabile al lattato, così come una generosa rigenerazione di NAD+ da parte della malato deidrogenasi extra-matrice del MAS. In questo modello, il trasporto del piruvato attraverso la membrana mitocondriale interna influenzerebbe direttamente il tasso di ossidazione del lattato appena fuori dalla matrice. L’ossidazione del lattato nei mitocondri dovrebbe quindi essere regolata indirettamente dalla reazione PDH nella matrice. Questo sarebbe vantaggioso perché, a differenza della LDH, la PDH è altamente regolata attraverso l’allosteria e la modifica covalente. Come accennato, la modellazione prevede un’alta attività PDH per dettare il consumo di lattato neuronale in vivo (Neves et al., 2012); e l’alta attività PDH caratterizza anche i neuroni che consumano lattato in cultura (Halim et al., 2010).

Considerazioni metodologiche

Se l’ossidazione mitocondriale del lattato è funzionalmente legata all’attività del MAS, allora sarebbe importante includere componenti del MAS nelle analisi in vitro dell’ossidazione mitocondriale del lattato, come il malato stesso o l’ossalacetato. Il malato è la scelta più probabile, dato che è abitualmente incluso per stimolare la respirazione in vitro, dove viene trasportato nella matrice e ossidato dalla malato deidrogenasi mitocondriale in ossalacetato. Questo ossalacetato può poi condensare con l’acetil coA formato, per esempio, quando viene aggiunto piruvato. Includere il glutammato oltre al malato, permette il pieno funzionamento del MAS a livello della respirazione mitocondriale. Un aspetto importante, ma a volte trascurato, della valutazione appropriata dell’ossidazione mitocondriale del lattato è l’inclusione del NAD+ come cofattore necessario per la reazione LDH, e l’ADP come accettore di fosfato per stimolare la fosforilazione ossidativa (cioè la respirazione allo stato 3). Inoltre, la componente extra-matrice della MAS coinvolge la reazione della malato deidrogenasi: ossalacetato + NADH + H+ ⇌ malato + NAD+. I protocolli sperimentali che esaminano il consumo di ossigeno respiratorio nei mitocondri isolati dal muscolo utilizzando alte concentrazioni di malato (ad esempio, 4 mM; Rasmussen et al., 2002), possono favorire la reazione malato deidrogenasi in direzione inversa (cioè, ossidazione del malato e produzione di NADH + H+) quando aggiunto al campione mitocondriale in combinazione con NAD+. Infatti, la reversibilità della MAS è stata osservata in epatociti isolati (Berry, 1971) e in mitocondri con MAS ricostituita (Kunz e Davis, 1991). L’effetto netto di questa inversione MAS sulla respirazione sarebbe quello di ridurre il malato dall’entrare nei mitocondri, formando ossalacetato. Ancora più importante, l’inversione impedirebbe l’ossidazione del lattato a piruvato, e il successivo trasporto e ossidazione del piruvato nella matrice. Le soluzioni a queste barriere metodologiche per osservare l’ossidazione mitocondriale del lattato in vitro comportano l’inclusione di almeno un componente del MAS. Se si aggiunge il malato, la concentrazione appropriata dovrebbe essere determinata sperimentalmente. Includere ADP e NAD+ o NADH (ricordiamo che il MAS genererà NAD+ per la reazione LDH) è necessario anche per osservare un’apprezzabile ossidazione mitocondriale del lattato.

Sommario

Un lattato-MAS è l’interazione tra il lattato e le navette malato-aspartato per traslocare il potere riducente ai mitocondri, in particolare all’interno di cellule ossidative e metabolicamente attive.

Dichiarazione di conflitto di interessi

L’autore dichiara che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Molti ringraziamenti al Dr. Erich Gnaiger (Medical University of Innsbruck) e al Dr. George Brooks (University of California, Berkeley) per aver criticato le bozze precedenti di questo lavoro.