9 Toksicitet

Menadion fremmer den hepatiske biosyntese af blodkoagulationsfaktorer. Menadions kræftfremkaldende potentiale blev bestemt ved hjælp af en DC-polarografimetode i strengt vandfri N,N-dimethylformamid (DMF) i nærværelse af alfa-liponsyre. Superoxidaniondannelsen blev målt efter inkubation af lunge-, lever- og nyremikrosomer fra rotter med menadion. Menadions genotoksiske potentiale blev undersøgt ved hjælp af uplanlagt DNA-syntese (UDS) og alkaliske elutionsassays. Parameteren for menadions potentielle kræftfremkaldende virkning på alfa var 0,0025, hvilket indikerer, at menadion ikke har nogen kræftfremkaldende aktivitet. Der blev dannet superoxidanioner på en koncentrations- og tidsafhængig måde, når menadion blev inkuberet med mikrosomer. I de pattedyrceller (A 549), der blev anvendt til alkalisk eluering og UDS-analyser, var menadion cytotoksisk ved koncentrationer på over 20 nmol/mL. Brugen af S9-mix (metabolisk aktivering) fraktioner mindskede menadions cytotoksicitet. I koncentrationsområdet over 20 nmol/mL var menadion genotoksisk i UDS-testen i fravær af metabolisk aktivering. Ved tilstedeværelse af metabolisk aktivering blev den menadioninducerede DNA-skade og -reparation stærkt reduceret. Behandling af A 549 lungeceller med 4-nitrokinolin-N-oxid (NQO) forårsagede en betydelig dannelse af DNA-enkeltstrengsbrud både i fravær og i tilstedeværelse af metabolisk aktivering. Behandling af A 549-lungeceller med menadion forårsagede dannelse af DNA-enkeltstrengsbrud i fravær af S9-blanding. Ved tilstedeværelse af metabolisk aktivering forårsagede menadion ingen signifikant dannelse af DNA-strengbrud. Menadion-induceret DNA-reparation i A 549-celler var koncentrations-, tids- og temperaturafhængig. Måling af uplanlagt DNA-syntese (reparation) efter behandling med NQO og menadion gav stærke UDS-reaktioner i fravær af S9-mix. Samlet set tyder resultaterne af disse undersøgelser på, at NQO og menadion har et mutagent potentiale. Disse resultater tyder på, at menadion gennemgår redoxcykler med dannelse af reaktive oxygenarter, der forårsager DNA-skader og reparation uden at have et kræftfremkaldende potentiale .

Oxidativ stress er blevet impliceret som en mekanisme for en række forskellige former for leverskader. Selv om reaktive oxygenarter (ROS) kan beskadige cellulære makromolekyler direkte, kan oxidantinduceret celledød skyldes redoxvirkninger på signaltransduktionsveje. For at forstå mekanismerne for hepatocytdød som følge af oxidativ stress blev funktionerne af de mitogen-aktiverede proteinkinaser (MAPK’er) bestemt under oxidantinduceret hepatocytskade fra menadion. Der blev fastsat lave, ikke-toksiske og høje toksiske koncentrationer af superoxidgeneratoren menadion i rottehepatocytcellelinjen RALA255-10G. Døden fra menadion blev blokeret af katalase og ebselen, hvilket indikerer, at døden var sekundær til oxidantgenerering og ikke arylering. Behandling med en ikke-toksisk menadionkoncentration resulterede i en kortvarig aktivering af ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK). Behandling med en giftig menadionkoncentration medførte derimod en langvarig aktivering af både ERK og JNK. Kemisk hæmning af ERK-funktionen gjorde RALA-hepatocytter følsomme over for død fra tidligere ikke-toksiske menadionkoncentrationer i forbindelse med vedvarende JNK-aktivering. Adenoviral ekspression af et dominant-negativt protein for c-Jun, et downstream-substrat for JNK, blokerede død efter menadion. Den pro-apoptotiske virkning af c-Jun blev ikke formidlet gennem den mitokondrielle dødsvej. Det kan konkluderes, at RALA-hepatocytternes modstandsdygtighed over for oxidantinduceret død fra menadion er afhængig af ERK, mens celledøden formidles af AP-1-aktivering. Disse resultater identificerer signalveje, der kan være terapeutiske mål i forbindelse med forebyggelse eller behandling af oxidantinduceret leverskade.

Menadion-katalyseret H2O2-produktion af levedygtige celler var proportional med antallet af levedygtige celler, og analysen af denne H2O2-produktion blev anvendt til cytotoksicitetstest af 17 stoffer, som blev anvendt til international validering af proceduren med faste doser som et alternativ til den klassiske LD(50)-test. De testede stoffers cytotoksicitet blev observeret 4 timer efter inkubation med dyreceller, og levedygtigheden blev bestemt i løbet af 10 minutter i henhold til menadion-katalyseret H2O2-produktionsassay. IC(50) for hvert stof, der kræves for 50 % hæmning af menadion-katalyseret H2O2produktion, var ens for HepG2-, HuH-6KK-, HUVE-, Vero-, Intestine 407-, NIH/3T3- og Neuro-2a-celler. Tolv stoffer, tre stoffer og to stoffer viste en forskel på henholdsvis en, to og tre ordener i størrelsesordenen mellem LD(50) og IC(50). Disse resultater viser, at menadion-katalyseret H2O2produktionsassay er nyttigt til hurtig påvisning af giftige forbindelser med basal cytotoksicitet, der er fælles for forskellige celler, men er uegnet til påvisning af organspecifikke giftige forbindelser .

Den forhøjelse af intracellulær Ca2 + i forskellige væv som følge af oxidativ stress induceret af menadion er veldokumenteret. Forhøjelse af Ca2 +-niveauet i blodplader resulterer i aggregering af blodpladerne. For at teste hypotesen om, at menadion-inducerede Ca2 +-forhøjelser kan spille en rolle i en trombocytaggregation, har vi undersøgt effekten af menadion på aggregering af trombocytter isoleret fra hunrotter. Behandling med menadion til PRP, som viste sig at være et passende system, viste sig at fremkalde dosisafhængige turbiditetsændringer af trombocytter på op til 60% .