9 Toxizität

Menadion fördert die hepatische Biosynthese von Blutgerinnungsfaktoren. Das karzinogene Potential von Menadion wurde durch eine DC-Polarographie-Methode in streng wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) in Gegenwart von Alpha-Liponsäure bestimmt. Die Bildung von Superoxidanionen wurde nach Inkubation von Rattenlunge, Leber und Nierenmikrosomen mit Menadion gemessen. Das genotoxische Potenzial von Menadion wurde mit Hilfe der ungeplanten DNA-Synthese (UDS) und des alkalischen Elutionstests untersucht. Der Parameter für die potenzielle Karzinogenität von Menadion gegenüber Alpha betrug 0,0025, was darauf hindeutet, dass Menadion keine karzinogene Wirkung hat. Bei der Inkubation von Menadion mit Mikrosomen wurden konzentrations- und zeitabhängig Superoxidanionen gebildet. In den Säugetierzellen (A 549), die für die alkalische Elution und die UDS-Tests verwendet wurden, war Menadion bei Konzentrationen über 20 nmol/ml zytotoxisch. Die Verwendung von S9-Mischfraktionen (Stoffwechselaktivierung) verringerte die Zytotoxizität von Menadion. Im Konzentrationsbereich von über 20 nmol/mL war Menadion im UDS-Test ohne Stoffwechselaktivierung genotoxisch. Bei Vorhandensein einer Stoffwechselaktivierung waren die durch Menadion induzierten DNA-Schäden und die Reparatur stark reduziert. Die Behandlung von A 549-Lungenzellen mit 4-Nitrochinolin-N-oxid (NQO) führte sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit einer Stoffwechselaktivierung zu einer signifikanten Bildung von DNA-Einzelstrangbrüchen. Die Behandlung von A 549-Lungenzellen mit Menadion führte zur Bildung von DNA-Einzelstrangbrüchen in Abwesenheit von S9-Mix. In Anwesenheit von Stoffwechselaktivierung verursachte Menadion keine signifikante Bildung von DNA-Strangbrüchen. Die Menadion-induzierte DNA-Reparatur in A 549-Zellen war konzentrations-, zeit- und temperaturabhängig. Die Messung der ungeplanten DNA-Synthese (UDS) nach der Behandlung mit NQO und Menadion ergab starke UDS-Reaktionen in Abwesenheit von S9-Mix. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Studien auf das mutagene Potenzial von NQO und Menadion hin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Menadion einem Redox-Zyklus unterliegt, bei dem reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden, die DNA-Schäden und -Reparaturen verursachen, ohne ein karzinogenes Potenzial zu besitzen.

Oxidativer Stress wurde als Mechanismus für eine Vielzahl von Formen der Leberschädigung in Betracht gezogen. Obwohl reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zelluläre Makromoleküle direkt schädigen können, kann der oxidativ induzierte Zelltod durch Redoxeffekte auf Signaltransduktionswege verursacht werden. Um die Mechanismen des Hepatozytentods durch oxidativen Stress zu verstehen, wurden die Funktionen der mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) während der oxidant-induzierten Hepatozytenschädigung durch Menadion bestimmt. Niedrige, ungiftige und hohe toxische Konzentrationen des Superoxid-Generators Menadion wurden in der Rattenhepatozyten-Zelllinie RALA255-10G nachgewiesen. Der durch Menadion hervorgerufene Tod wurde durch Katalase und Ebselen blockiert, was darauf hindeutet, dass der Tod auf die Erzeugung von Oxidantien und nicht auf Arylierung zurückzuführen ist. Die Behandlung mit einer ungiftigen Menadionkonzentration führte zu einer kurzen Aktivierung der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK). Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit einer toxischen Menadion-Konzentration zu einer verlängerten Aktivierung sowohl der ERK als auch der JNK. Die chemische Hemmung der ERK-Funktion sensibilisierte RALA-Hepatozyten für den Tod durch zuvor ungiftige Menadion-Konzentrationen in Verbindung mit einer anhaltenden JNK-Aktivierung. Die adenovirale Expression eines dominant-negativen Proteins für c-Jun, einem nachgeschalteten Substrat für JNK, blockierte den Tod durch Menadion. Die pro-apoptotische Wirkung von c-Jun wurde nicht über den mitochondrialen Todesweg vermittelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Resistenz von RALA-Hepatozyten gegenüber dem durch Menadion ausgelösten oxidativen Tod von ERK abhängt, während der Zelltod durch die Aktivierung von AP-1 vermittelt wird. Diese Ergebnisse zeigen Signalwege auf, die therapeutische Ziele bei der Vorbeugung oder Behandlung von Oxidationsmittel-induzierten Leberschäden sein könnten.

Die durch Menadion katalysierte H2O2-Produktion durch lebensfähige Zellen war proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen, und der Test dieser H2O2-Produktion wurde für den Zytotoxizitätstest von 17 Substanzen verwendet, die für die internationale Validierung des Festdosisverfahrens als Alternative zum klassischen LD(50)-Test eingesetzt wurden. Die Zytotoxizität der getesteten Substanzen wurde 4 Stunden nach der Inkubation mit tierischen Zellen beobachtet, und die Lebensfähigkeit wurde innerhalb von 10 Minuten nach dem Assay zur menadionkatalysierten H2O2-Produktion bestimmt. Der IC(50) jeder Substanz, der für eine 50%ige Hemmung der menadionkatalysierten H2O2-Produktion erforderlich ist, war bei den Zellen HepG2, HuH-6KK, HUVE, Vero, Intestine 407, NIH/3T3 und Neuro-2a ähnlich. Zwölf Substanzen, drei Substanzen und zwei Substanzen zeigten einen Unterschied von einer, zwei bzw. drei Größenordnungen zwischen LD(50) und IC(50). Diese Ergebnisse zeigen, dass der durch Menadion katalysierte H2O2-Produktionstest für den schnellen Nachweis toxischer Verbindungen mit einer für verschiedene Zellen gemeinsamen basalen Zytotoxizität geeignet ist, jedoch nicht für den Nachweis organspezifischer toxischer Verbindungen.

Die Erhöhung des intrazellulären Ca2 + in verschiedenen Geweben durch den von Menadion induzierten oxidativen Stress ist gut dokumentiert. Die Erhöhung des Ca2 +-Spiegels in den Blutplättchen führt zu einer Aggregation der Blutplättchen. Um die Hypothese zu testen, dass Menadion-induzierte Ca2 +-Erhöhungen eine Rolle bei der Thrombozytenaggregation spielen können, haben wir die Wirkung von Menadion auf die Aggregation von aus weiblichen Ratten isolierten Thrombozyten untersucht. Die Behandlung mit Menadion in PRP, das sich als adäquates System erwies, schien dosisabhängige Trübungsänderungen der Thrombozyten von bis zu 60 % zu induzieren.