9 Tossicità
Il menadione promuove la biosintesi epatica dei fattori di coagulazione del sangue. Il potenziale cancerogeno del menadione è stato determinato con un metodo di polarografia DC in N,N-dimetilformammide (DMF) rigorosamente anidra in presenza di acido alfa-lipoico. La formazione di anioni superossido è stata misurata dopo l’incubazione di microsomi di polmone, fegato e rene di ratto con il menadione. Il potenziale genotossico del menadione è stato studiato utilizzando la sintesi non programmata del DNA (UDS) e i test di eluizione alcalina. Il parametro della potenziale carcinogenicità del menadione all’alfa è stato di 0,0025, indicando nessuna attività carcinogenica del menadione. L’anione superossido è stato generato in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo quando il menadione è stato incubato con i microsomi. Nelle cellule di mammifero (A 549) utilizzate per l’eluizione alcalina e i saggi UDS, il menadione era citotossico a concentrazioni superiori a 20 nmol/mL. L’uso delle frazioni S9 mix (attivazione metabolica) ha diminuito la citotossicità del menadione. Nell’intervallo di concentrazione superiore a 20 nmol/mL il menadione era genotossico nel test UDS in assenza di attivazione metabolica. In presenza di attivazione metabolica il danno al DNA indotto dal menadione e la riparazione erano notevolmente ridotti. Il trattamento delle cellule polmonari A 549 con 4-nitrochinolina-N-ossido (NQO) ha causato una significativa formazione di rotture del singolo filamento di DNA sia in assenza che in presenza di attivazione metabolica. Il trattamento delle cellule polmonari A 549 con menadione ha causato la formazione di rotture del singolo filamento di DNA in assenza della miscela S9. In presenza di attivazione metabolica il menadione non ha causato alcuna formazione significativa di rotture del filamento di DNA. La riparazione del DNA indotta dal menadione nelle cellule A 549 era dipendente dalla concentrazione, dal tempo e dalla temperatura. La misurazione della sintesi non programmata del DNA (UDS) (riparazione) dopo il trattamento con NQO e menadione ha dato forti risposte UDS in assenza di S9 mix. Presi insieme, i risultati di questi studi suggeriscono il potenziale mutageno di NQO e menadione. Questi risultati indicano che il menadione subisce un ciclo redox con formazione di specie reattive dell’ossigeno che causano danni al DNA e riparazione senza avere un potenziale cancerogeno.
Lo stress ossidativo è stato implicato come meccanismo per una varietà di forme di danno epatico. Anche se le specie reattive dell’ossigeno (ROS) possono danneggiare direttamente le macromolecole cellulari, la morte cellulare indotta dagli ossidanti può derivare da effetti redox sulle vie di trasduzione del segnale. Per comprendere i meccanismi della morte degli epatociti da stress ossidativo, sono state determinate le funzioni delle protein chinasi attivate da mitogeno (MAPK) durante la lesione degli epatociti indotta dall’ossidante dal menadione. Concentrazioni basse, non tossiche ed elevate del generatore di superossido menadione sono state stabilite nella linea cellulare di epatociti di ratto RALA255-10G. La morte da menadione è stata bloccata da catalasi e ebselen, indicando che la morte era secondaria alla generazione di ossidanti e non all’arilazione. Il trattamento con una concentrazione di menadione non tossico ha provocato una breve attivazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) e della chinasi N-terminale c-Jun (JNK). Al contrario, il trattamento con una concentrazione tossica di menadione ha indotto un’attivazione prolungata sia di ERK che di JNK. L’inibizione chimica della funzione ERK ha sensibilizzato gli epatociti RALA alla morte da concentrazioni di menadione precedentemente non tossiche in associazione con l’attivazione sostenuta di JNK. L’espressione adenovirale di una proteina dominante-negativa per c-Jun, un substrato a valle di JNK, ha bloccato la morte da menadione. L’effetto pro-apoptotico di c-Jun non è stato mediato attraverso la via della morte mitocondriale. In conclusione, la resistenza degli epatociti RALA alla morte indotta dagli ossidanti del menadione dipende da ERK, mentre la morte cellulare è mediata dall’attivazione di AP-1. Questi risultati identificano le vie di segnalazione che possono essere obiettivi terapeutici nella prevenzione o nel trattamento delle lesioni epatiche indotte dall’ossidante.
La produzione di H2O2 catalizzata dal menadione da parte delle cellule vitali era proporzionale al numero di cellule vitali, e il saggio di questa produzione di H2O2 è stato applicato al test di citotossicità di 17 sostanze che sono state utilizzate per la convalida internazionale della procedura a dose fissa come alternativa al classico test LD(50). La citotossicità delle sostanze testate è stata osservata 4 ore dopo l’incubazione con cellule animali, e la vitalità è stata determinata in 10 minuti secondo il saggio di produzione di H2O2 catalizzata dal menadione. L’IC(50) di ogni sostanza richiesta per l’inibizione del 50% della produzione di H2O2 catalizzata dal menadione era simile tra le cellule HepG2, HuH-6KK, HUVE, Vero, Intestino 407, NIH/3T3 e Neuro-2a. Dodici sostanze, tre sostanze e due sostanze hanno mostrato la differenza di uno, due e tre ordini di grandezza tra LD(50) e IC(50), rispettivamente. Questi risultati mostrano che il saggio di produzione di H2O2 catalizzata dal menadione è utile per il rilevamento rapido di composti tossici che hanno la citotossicità basale comune a varie cellule, ma non è adatto per il rilevamento di composti tossici specifici dell’organo.
L’aumento del Ca2 + intracellulare in vari tessuti attraverso lo stress ossidativo indotto dal menadione è stato ben documentato. L’aumento del livello di Ca2+ nelle piastrine provoca l’aggregazione delle piastrine. Per testare l’ipotesi che gli aumenti di Ca2 + indotti dal menadione possano avere un ruolo nell’aggregazione delle piastrine, abbiamo studiato l’effetto del menadione sull’aggregazione delle piastrine isolate da ratti femmina. Il trattamento con menadione a PRP, che si è rivelato un sistema adeguato, sembrava indurre cambiamenti di torbidità dose-dipendenti delle piastrine fino al 60%.