9 Toxicity

Menadione は血液凝固因子の肝生合成を促進します。 メナジオンの発がん性は、α-リポ酸の存在下、厳密に無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中でDCポーラログラフィー法により測定されたものです。 ラット肺，肝臓および腎臓のミクロソームをメナジオンとインキュベートした後，スーパーオキシドアニオンの生成量を測定した． メナジオンの遺伝毒性は，非スケジュールDNA合成法（UDS）およびアルカリ溶出法を用いて検討した． αに対する発がん性のパラメータは0.0025であり，発がん性は認められなかった． メナジオンとミクロソームをインキュベートすると，濃度および時間依存的にスーパーオキサイドアニオンが生成された． アルカリ溶出試験およびUDS試験に用いた哺乳類細胞（A 549）では，メナジオンは20 nmol/mL以上の濃度で細胞毒性を示した． S9 mix（代謝活性化）画分を使用すると、メナジオンの細胞毒性は低下した。 20 nmol/mL以上の濃度範囲では，代謝活性化が行われていないUDS試験において，メナジオンが遺伝毒性を示した。 代謝活性化の存在下では、メナジオンが誘発するDNA損傷と修復は大幅に減少した。 4-ニトロキノリン-N-オキシド（NQO）でA 549肺細胞を処理すると、代謝活性化の非存在下および存在下の両方で、DNA一本鎖切断の著しい形成が見られた。 A549肺細胞をメナジオンで処理すると、S9 mixの非存在下でDNA一本鎖切断が形成された。 代謝活性化の存在下では、メナジオンによるDNA一本鎖切断の有意な形成は見られなかった。 A549細胞においてメナジオンが誘発するDNA修復は、濃度、時間、温度に依存した。 NQOとメナジオンで処理した後、予定外のDNA（UDS）合成（修復）を測定すると、S9 mixの非存在下で強いUDS応答が得られた。 これらの結果を総合すると、NQOとメナジオンの変異原性能が示唆される。 これらの結果は，メナジオンが酸化還元サイクルを起こして活性酸素種を形成し，発がん性を持たずにDNA損傷と修復を引き起こすことを示している． 活性酸素種は直接的に細胞高分子を損傷することもありますが、酸化ストレスによる細胞死はシグナル伝達経路への酸化還元作用に起因すると考えられています。 酸化ストレスによる肝細胞死のメカニズムを理解するために、メナジオンによる酸化剤誘発肝細胞障害時のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）の機能を決定した。 RALA255-10Gラット肝細胞株を用いて、低濃度、無毒性、高毒性濃度のスーパーオキシド発生物質メナジオンが確立された。 メナジオンによる死はカタラーゼとエブセレンによって阻止され、死はアリール化ではなく、酸化剤の生成による二次的なものであることが示された。 非毒性濃度のメナジオンで処理すると、extracellular signal-regulated kinase (ERK) とc-Jun N-terminal kinase (JNK) が短時間活性化されることがわかった。 一方、毒性のあるメナジオン濃度で処理すると、ERKとJNKの両方が長時間にわたって活性化された。 ERKの機能を化学的に阻害すると、RALA肝細胞はそれまで無毒であったメナジオン濃度による死に対して感作され、持続的なJNK活性化を伴うことがわかった。 JNKの下流基質であるc-Junのドミナントネガティブタンパク質をアデノウイルスで発現させると、メナジオンによる死が阻害された。 c-Junのアポトーシス促進作用は、ミトコンドリア死滅経路を介するものではなかった。 結論として、RALA肝細胞のメナジオンによる酸化剤誘導死に対する抵抗性はERKに依存し、細胞死はAP-1の活性化によって媒介される。 これらの知見は，酸化剤による肝障害の予防や治療において治療標的となりうるシグナル伝達経路を明らかにした．

メナジオン触媒による生細胞のH2O2生成は生細胞数に比例し，このH2O2生成の測定は，従来のLD（50）試験の代替として，固定用量手順の国際検証に用いた17物質の細胞毒性試験で応用された． 試験物質の細胞毒性は，動物細胞を用いて培養した4時間後に観察し，メナジオン触媒によるH2O2生成量測定法に従って，10分後の生存率を測定した． HepG2, HuH-6KK, HUVE, Vero, Intestine 407, NIH/3T3 および Neuro-2a 細胞において，メナジオン触媒による H2O2 産生の 50%阻害に必要な各物質の IC(50) はほぼ同じであった． また，LD(50)とIC(50)の大きさは，12物質が1桁，3物質が2桁，2物質が3桁の差があった． これらの結果から，メナジオン触媒によるH2O2生成アッセイは，様々な細胞に共通する基礎的な細胞毒性を有する毒性化合物の迅速な検出には有用であるが，臓器特異的な毒性化合物の検出には適さないことがわかった．

メナジオンによる酸化ストレスで種々の組織で細胞内Ca2 +が上昇することはよく知られているが，このことは，細胞毒性を有する毒性のある毒性化合物の検出には適さない． 血小板のCa2 +レベルの上昇は、血小板の凝集をもたらす。 そこで、メナジオンによるCa2 +の上昇が血小板の凝集に関与するという仮説を検証するために、メスラットより分離した血小板の凝集に対するメナジオンの影響を調べたところ、血小板の凝集はメナジオンによるCa2 +の上昇によって引き起こされることがわかった。 メナジオンが血小板の凝集に及ぼす影響について検討したところ、メナジオンとPRPの併用により、血小板の濁度が60％程度まで変化することがわかった。