9 Toxicity

Menadione edistää veren hyytymistekijöiden maksan biosynteesiä. Menadionin karsinogeeninen potentiaali määritettiin DC-polarografiamenetelmällä tiukasti vedettömässä N,N-dimetyyliformamidissa (DMF) alfa-lipoiinihapon läsnä ollessa. Superoksidi-anionin muodostuminen mitattiin sen jälkeen, kun rotan keuhkojen, maksan ja munuaisten mikrosomeja oli inkuboitu menadionin kanssa. Menadionin genotoksista potentiaalia tutkittiin suunnittelemattoman DNA-synteesin (UDS) ja emäksisen eluution määritysten avulla. Menadionin mahdollisen karsinogeenisuuden alfa-parametri oli 0,0025, mikä osoittaa, ettei menadionilla ole karsinogeenista vaikutusta. Superoksidi-anionia syntyi pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisesti, kun menadionia inkuboitiin mikrosomien kanssa. Nisäkässoluissa (A 549), joita käytettiin emäksisessä eluutiossa ja UDS-määrityksissä, menadioni oli sytotoksinen yli 20 nmol/ml:n pitoisuuksissa. S9 mix (metabolinen aktivointi) -fraktioiden käyttö vähensi menadionin sytotoksisuutta. Pitoisuusalueella yli 20 nmol/ml menadioni oli UDS-testissä genotoksinen ilman metabolista aktivointia. Metabolisen aktivaation läsnä ollessa menadionin aiheuttamat DNA-vauriot ja niiden korjautuminen vähenivät huomattavasti. A 549 -keuhkosolujen käsittely 4-nitrokinoliini-N-oksidilla (NQO) aiheutti merkittävää DNA:n yksisäiekatkojen muodostumista sekä ilman metabolista aktivaatiota että sen läsnä ollessa. A 549 -keuhkosolujen käsittely menadionilla aiheutti DNA:n yksijuosteisten katkosten muodostumista ilman S9-sekoitusta. Metabolisen aktivaation läsnä ollessa menadioni ei aiheuttanut merkittävää DNA-juostekatkosten muodostumista. Menadionin aiheuttama DNA:n korjaus A 549-soluissa oli konsentraatio-, aika- ja lämpötilariippuvainen. Suunnittelemattoman DNA:n (UDS) synteesin (korjaus) mittaaminen NQO- ja menadionikäsittelyn jälkeen tuotti voimakkaita UDS-vasteet ilman S9-seosta. Kaikkiaan näiden tutkimusten tulokset viittaavat NQO:n ja menadionin mutageeniseen potentiaaliin. Nämä tulokset osoittavat, että menadioni käy läpi redox-kiertoa, jossa muodostuu reaktiivisia happilajeja, jotka aiheuttavat DNA-vaurioita ja korjautumista ilman, että niillä on karsinogeenista potentiaalia.

Oksidatiivista stressiä on pidetty mekanismina monille maksavaurioiden muodoille. Vaikka reaktiiviset happilajit (ROS) voivat vahingoittaa solun makromolekyylejä suoraan, hapettimien aiheuttama solukuolema voi johtua redox-vaikutuksista signaalinvälitysreitteihin. Hapetusstressin aiheuttaman hepatosyyttikuoleman mekanismien ymmärtämiseksi määritettiin mitogeeni-aktivoitujen proteiinikinaasien (MAPK) toimintaa menadionin aiheuttaman hapettimen aiheuttaman hepatosyyttivaurion aikana. Matalat, myrkyttömät ja korkeat myrkylliset pitoisuudet superoksidigeneraattorin menadionia määritettiin RALA255-10G-rotan hepatosyyttisolulinjassa. Menadionin aiheuttama kuolema estettiin katalaasilla ja ebselenillä, mikä osoittaa, että kuolema oli sekundaarinen hapettimen tuottamisen eikä arylaation seurauksena. Käsittely ei-toksisella menadionipitoisuudella johti solunulkoisen signaalin säätelemän kinaasin (ERK) ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) lyhytaikaiseen aktivoitumiseen. Sitä vastoin käsittely myrkyllisellä menadionipitoisuudella aiheutti sekä ERK:n että JNK:n pitkittyneen aktivaation. ERK:n toiminnan kemiallinen estäminen herkisti RALA-hepatosyytit kuolemaan aiemmin myrkyttömien menadionipitoisuuksien vaikutuksesta yhdessä JNK:n jatkuvan aktivoitumisen kanssa. JNK:n alavirran substraatin, c-Junin, dominoivan negatiivisen proteiinin adenoviraalinen ilmentäminen esti menadionin aiheuttaman kuoleman. c-Junin pro-apoptoottinen vaikutus ei välittynyt mitokondriaalisen kuolinreitin kautta. Yhteenvetona voidaan todeta, että RALA-hepatosyyttien resistenssi menadionin aiheuttamaa hapettimen aiheuttamaa kuolemaa vastaan on riippuvainen ERK:sta, kun taas solukuolema välittyy AP-1-aktivaation kautta. Nämä havainnot tunnistavat signaalireittejä, jotka voivat olla terapeuttisia kohteita hapettimien aiheuttaman maksavaurion ehkäisyssä tai hoidossa.

Menadionin katalysoima H2O2-tuotanto elinkelpoisissa soluissa oli verrannollinen elinkelpoisten solujen lukumäärään, ja tämän H2O2:n tuotannon määritystä sovellettiin 17 aineen sytotoksisuustestiin, joita käytettiin kiinteän annoksen menetelmän kansainväliseen validointiin vaihtoehtona klassiselle LD(50)-testille. Testattujen aineiden sytotoksisuutta havainnoitiin 4 tunnin kuluttua inkuboinnista eläinsolujen kanssa, ja elinkelpoisuus määritettiin 10 minuutissa menadionikatalysoidun H2O2-tuotantomäärityksen mukaisesti. Kunkin aineen IC(50), joka vaaditaan menadione-katalysoidun H2O2-tuotannon 50 prosentin estämiseen, oli samanlainen HepG2-, HuH-6KK-, HUVE-, Vero-, Intestine 407-, NIH/3T3- ja Neuro-2a-soluissa. Kahdellatoista aineella, kolmella aineella ja kahdella aineella oli yhden, kahden ja kolmen suuruusluokan ero LD(50):n ja IC(50):n välillä. Nämä tulokset osoittavat, että menadionin katalysoima H2O2-tuotantomääritys on käyttökelpoinen sellaisten myrkyllisten yhdisteiden nopeaan havaitsemiseen, joilla on eri soluille yhteinen perussytotoksisuus, mutta se ei sovellu elinkohtaisten myrkyllisten yhdisteiden havaitsemiseen.

Menadionin aiheuttaman oksidatiivisen stressin aiheuttama solunsisäisen Ca2 + -pitoisuuden nousu erilaisissa kudoksissa on hyvin dokumentoitu. Ca2 + -tason nousu verihiutaleissa johtaa verihiutaleiden aggregaatioon. Testataksemme hypoteesia, jonka mukaan menadionin aiheuttamalla Ca2 + -nousulla voi olla merkitystä verihiutaleiden aggregaatiossa, olemme tutkineet menadionin vaikutusta naarasrotista eristettyjen verihiutaleiden aggregaatioon. Menadionikäsittely PRP:lle, joka osoittautui sopivaksi järjestelmäksi, näytti aiheuttavan annosriippuvaisia sameusmuutoksia verihiutaleissa jopa 60 % .