- Abstract
- 1. Úvod
- 2. Materiál a metody
- 2.1. Materiál a metody 2.2. Šťáva z ovoce noni. Sběr a botanická identifikace rostliny
- 2.2. Postup extrakce šťávy
- 2.3. Šťáva z plodů citriolisté citriolisté. Studie na zvířatech
- 2.4. Kolitida vyvolaná DSS a klinické hodnocení
- 2,5. Eutanazie a odběr vzorků
- 2.6. Myeloperoxidáza (MPO) a oxid dusnatý (NO)
- 2.7. Kvantifikace cytokinů metodou ELISA
- 2,8. Histologie a histopatologická analýza
- 2.9. Analýza dat a statistika
- 3. Výsledky
- 3.1. Statistické výsledky Léčba ovocnou šťávou z noni a výsledek onemocnění
- 3.2. DSS 2,5 % + noni 1 : 100, myši vystavené DSS a ošetřené ředěním ovocné šťávy v poměru 1 : 100. Konzumace ovocné šťávy z noni inhibuje zánět a zachovává střevní architekturu v závislosti na dávce
- 3.3. Konzumace šťávy z ovoce noni snižuje množství klíčových zánětlivých cytokinů ve střevě v závislosti na dávce
- 4. Diskuse
- Konkurenční zájmy
- Poděkování
Abstract
Šťáva z plodů Morinda citrifolia L. (Noni) se osvědčila při léčbě různých onemocnění. Údaje týkající se její role při léčbě střevních zánětů však stále vyžadují upřesnění. V této studii jsme zkoumali účinky šťávy z plodů noni (NFJ) při léčbě myší C57BL/6, které byly nepřetržitě vystaveny působení dextran sulfátu sodného (DSS) po dobu 9 po sobě jdoucích dnů. Konzumace NFJ neměla žádný vliv na snížení klinických příznaků onemocnění ani na úbytek hmotnosti. Nicméně při použití ředění 1 : 10 byla střevní architektura myší zachována, což bylo doprovázeno snížením zánětlivého infiltrátu. Bez ohledu na koncentraci NFJ bylo ve střevě pozorováno také snížení aktivity myeloperoxidázy i klíčových zánětlivých cytokinů, TNF-α a IFN-γ. V případě myšího střeva došlo k poklesu aktivity myeloperoxidázy. Dále bylo při ředění NFJ v poměru 1 : 10 a 1 : 100 zjištěno snížení produkce oxidu dusnatého a IL-17 ve střevních homogenátech. Celkově byla léčba NFJ účinná v různých aspektech spojených s progresí a zhoršením onemocnění. Tyto výsledky mohou poukazovat na plody noni jako na důležitý zdroj protizánětlivých molekul s velkým potenciálem inhibovat progresi zánětlivých onemocnění, jako je například zánětlivé střevní onemocnění.
1. Úvod
Potenciální protizánětlivé aktivity několika přírodních sloučenin při downregulaci klíčových hráčů v rozvoji zánětu byly zkoumány v různých scénářích, včetně modulace cytokinů, transkripčních faktorů, enzymů a produkce proteinových a neproteinových mediátorů zánětu. Tyto aktivity zahrnují modulaci cytokinů (např. IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 a IL-12), transkripčních faktorů, enzymů (např. myeloperoxidázy-MPO a cyklooxygenázy COX-1 a COX-2) a také produkci oxidu dusnatého (NO) . Vzhledem k jejich významu při kontrole zánětu byly navrženy terapie zaměřené na tyto molekuly jako možné pomocné prostředky při prevenci a/nebo léčbě zánětlivých onemocnění, jako je revmatoidní artritida , dermatitida a zánětlivé onemocnění střev (IBD) . IBD jsou chronická zánětlivá onemocnění gastrointestinálního traktu, která se klinicky projevují jako jedno ze dvou onemocnění, Crohnova choroba (CD) nebo ulcerózní kolitida (UC) . Tyto patologické stavy jsou předmětem zvláštního zájmu, protože postihují miliony lidí na celém světě a současná léčba stále není plně účinná při kontrole progrese onemocnění nebo prevenci výskytu vedlejších účinků .
Morinda citrifolia L. (noni) patří do čeledi Rubiaceae a je zdrojem přírodních molekul, které Polynésané používají jako léčivou rostlinu již více než 2 000 let . Z plodů noni bylo dosud izolováno několik bioaktivních látek, včetně mastných kyselin, flavonoidů, polysacharidů a sterolů . Protizánětlivý potenciál sloučenin z plodů noni byl prokázán na experimentálním modelu infekce Helicobacter pylori, při kterém byly použity ethanolové a ethylacetátové extrakty. Tyto extrakty dokázaly snížit chemotaxi neutrofilů i produkci indukovatelného oxidu dusnatého (iNOS) a COX-2 . V souladu s tím vykazovaly myši C57BL/6, kterým byla perorálně podávána šťáva z plodů noni v dávce 500 mg kg-1 den-1 po dobu 60 dnů, snížení zánětlivého infiltrátu a exprese cytokinů IL-12, TNF-α, TGF-β a IL-10 ve stélce infikované Leishmania amazonensis . Je důležité zmínit, že cytokiny jako IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 a IL-23 jsou spojovány s rozvojem a zhoršováním IBD, proto se k nim přistupovalo různě s cílem léčit toto zánětlivé onemocnění . Dále byl protizánětlivý potenciál extraktu z listů Morinda citrifolia prokázán snížením hladin TNF-α, IL-1β a NO v makrofázích po stimulaci lipopolysacharidem (LPS) . Přestože úloha sloučenin z plodů noni při kontrole zánětlivých hráčů má zvláštní význam, jejich účinky při rozvoji střevního zánětu jsou stále málo prozkoumané.
Tato studie proto ukázala účinky šťávy z ovoce noni na souhru cytokinů a střevní architekturu u myšího modelu kolitidy vyvolané dextran-sulfátem sodným jako základní mechanismy její imunomodulační aktivity.
2. Materiál a metody
2.1. Materiál a metody
2.2. Šťáva z ovoce noni. Sběr a botanická identifikace rostliny
Plodiny použité v této studii byly získány z monokultury 150 rostlin noni na farmě Fazenda Boa Vontade v obci Araguari, Triângulo Mineiro/MG, Brazílie, na souřadnicích 18°43′47.23′′ j. š., 48°6′49,50′′ o. z. d. (údaje z Google Earth, 2013). Všechny exempláře byly připraveny podle běžných herborizačních technik a uloženy v herbáři Federální univerzity v Uberlândii (HUFU Herbarium) pod registračním číslem HUFU-67210 jako Morinda citrifolia L. (Rubiaceae).
2.2. Postup extrakce šťávy
Šťáva z Morinda citrifolia (noni) byla připravena v Laboratoři farmakognozie Univerzity Uberaba v Uberabě, Minas Gerais, Brazílie. Plody M. citrifolia byly ručně a náhodně sebrány ze 150 rostlin, omyty v ozonizované vodě a uchovávány při pokojové teplotě po dobu 3-5 dnů. Plody byly mechanicky odšťavněny pomocí odšťavňovače a po odstranění semen byla získaná dužina odstředěna při 4 000 otáčkách za minutu v chladu, dokud nebyl supernatant čirý, a poté byla považována za 100% (v/v) šťávu a skladována při teplotě -70 °C až do dalšího použití.
2.3. Šťáva z plodů citriolisté citriolisté. Studie na zvířatech
Myši samčího pohlaví C57BL/6 ve věku 6-8 týdnů a hmotnosti 20-25 g byly umístěny ve specifických podmínkách prostředí bez patogenů a se standardní kontrolou při konstantní teplotě (25 °C) v 12hodinovém cyklu světlo/tma, s přístupem k potravě a vodě ad libitum, v zařízení pro zvířata Federální univerzity Triângulo Mineiro (UFTM) v Brazílii. Všechny studie na zvířatech byly prováděny v souladu s institucionálním výborem pro péči o zvířata a jejich použití UFTM podle protokolu 275. Pokusy byly prováděny s 8 myšmi/skupinami, a to takto: fyziologický roztok, zdravé kontrolní myši, kterým byl podáván fyziologický roztok; DSS 2,5 %, myši vystavené působení dextran sulfátu sodného (DSS); DSS 2,5 % + čistá noni, myši vystavené působení DSS a ošetřené čistou ovocnou šťávou z noni; DSS 2,5 % + čistá noni, myši vystavené působení DSS a ošetřené čistou ovocnou šťávou z noni.5 % + noni 1 : 10, myši vystavené DSS a ošetřené šťávou z ovoce noni v poměru 1 : 10; a DSS 2,5 % + noni 1 : 100, myši vystavené DSS a ošetřené šťávou z ovoce noni v poměru 1 : 100. Objem 100 μl na myš byl podáván perorálně po dobu 9 po sobě jdoucích dnů.
2.4. Kolitida vyvolaná DSS a klinické hodnocení
Kolitida byla vyvolána 2,5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, Francie, molekulová hmotnost: 36 000-50 000 kDa) kontinuálně přidávaným do pitné vody po dobu 9 po sobě následujících dnů pro odběr vzorků. Kromě zaznamenávání denního příjmu potravy a vody byly každý den hodnoceny také změny tělesné hmotnosti a klinické příznaky onemocnění, aby bylo možné získat klinické skóre onemocnění pro každou myš. Každý příznak, který zvířata vykazovala, odpovídal jednomu bodu a součet bodů pro každou myš určoval klinické skóre. Klinické skóre bylo stanoveno, jak je popsáno výše .
2,5. Eutanazie a odběr vzorků
Myši byly utraceny 9. den a tlusté střevo bylo odstraněno pro další analýzu. Vzorky tlustého střeva byly rozděleny na menší řezy, které byly ponořeny do PBS/10% formaldehydu pro zalití do parafínu nebo byly okamžitě zmrazeny v tekutém dusíku pro kvantifikaci aktivity myeloperoxidázy (MPO) nebo oxidu dusnatého (NO) pomocí enzymatických testů. Kromě toho byl z každé myši odebrán jeden střevní řez v roztoku obsahujícím inhibitory proteáz (Complete®, Roche Pharmaceuticals, Mannheim, Německo) pro kvantifikaci cytokinů pomocí enzymatické imunosorbční analýzy (ELISA).
2.6. Myeloperoxidáza (MPO) a oxid dusnatý (NO)
Krátce, pro stanovení MPO byly řezy homogenizovány a erytrocyty byly lyzovány. Peleta získaná po centrifugaci byla resuspendována a následovaly tři cykly zmrazení a rozmrazení. Po centrifugaci byl supernatant umístěn do 96jamkových destiček a při 37 °C odhalen pomocí substrátu tetrametylbenzidinu (TMB) (BD OptEIA™, San Diego, CA). Reakce byla zastavena a odečty byly provedeny ve spektrofotometru při 450 nm. Aktivita MPO byla stanovena podle předchozího popisu . Výsledky byly normalizovány na suchou hmotnost každého střevního řezu a vyjádřeny jako optická hustota na gram tkáně (nm/g tkáně).
Pro měření NO byly měřeny dusitany akumulované ve střevních homogenátech jako indikátor produkce NO pomocí Griessovy reakce . Poté bylo 100 μl tkáňového homogenátu smícháno se 100 μl Griessova činidla, které se skládá ze stejných objemů 1% (w/v) sulfanilamidu v 5% (v/v) kyselině fosforečné a 0,1% (w/v) naftyl-etylendiamin-HCl, a inkubováno při pokojové teplotě po dobu 10 min. Absorbance byla měřena při vlnové délce 540 nm v 96jamkové destičkové čtečce (Perkin Elmer Cetus, CA, USA). Množství dusitanů ve vzorcích bylo vypočteno pomocí lineární regresní analýzy absorbance sériového ředění standardní křivky dusitanu sodného. Výsledky byly normalizovány na suchou hmotnost každého střevního řezu a vyjádřeny v pikogramech na mililitr a gram tkáně (pg/ml/g).
2.7. Kvantifikace cytokinů metodou ELISA
Cytokiny IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4 a IL-23 byly kvantifikovány v tkáňových homogenátech metodou ELISA podle pokynů výrobce (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Výsledky byly normalizovány na suchou hmotnost každého střevního řezu a vyjádřeny v nanogramech na mililitr a gram tkáně (ng/ml/g tkáně).
2,8. Histologie a histopatologická analýza
Za účelem posouzení mikroskopického poškození byly střevní řezy podélně rozříznuty, promyty PBS, fixovány v 10% pufrovaném formalínu po dobu 24 hodin a poté zpracovány pro zalití do parafínu s následným řezáním mikrotomem. Byly získány tkáňové řezy (5 μm) a obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E). Pro histopatologickou analýzu byla hodnocena sliznice, submukóza, svalové vrstvy a seróza. Tyto střevní řezy byly také hodnoceny na přítomnost edému, zánětlivého infiltrátu a epiteliálních abnormalit.
Snímky byly pořízeny pomocí digitální videokamery (Evolution MP 5.0 color Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) s objektivem 10x, připojené ke světelnému mikroskopu (Nikon Eclipse 50i, Melville, NY, USA). Morfometrie byla provedena pomocí programu Image-Pro Insight (Media Cybernetics). Zánětlivý infiltrát byl měřen na základě podílu poškozené plochy obsahující zánětlivý infiltrát a celkové plochy tkáně zobrazené na získaném snímku a vyjádřen v procentech (%). Histopatologickou analýzu provedl vyškolený patolog, který byl zaslepen vůči léčbě.
2.9. Analýza dat a statistika
U všech proměnných bylo testováno normální rozdělení a homogenní rozptyl. Pokud bylo rozdělení považováno za normální a rozptyl za homogenní, byly použity parametrické testy: nepárový Studentův -test nebo jednocestná ANOVA s následným Tukeyho post hoc testem. V případě negaussovského rozdělení dat byly použity následující neparametrické testy: Mann-Whitneyho test nebo Kruskal-Wallisův test doplněný Dunnovým post hoc testem. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Zjištěné rozdíly byly považovány za významné, pokud (5 %). Statistická analýza byla provedena pomocí programu GraphPad Prism, verze 5.0 (La Jolla, CA, USA).
3. Výsledky
3.1. Statistické výsledky Léčba ovocnou šťávou z noni a výsledek onemocnění
Nejprve bylo třeba posoudit, zda je ovocná šťáva z noni schopna zabránit úbytku hmotnosti a výsledku kolitidy vyvolané DSS, myši byly vystaveny DSS po dobu 9 dnů a poté jim byla podávána ovocná šťáva, jak je popsáno v části Materiály a metody. Nezdálo se, že by skupina s ovocnou šťávou z noni snížila úbytek hmotnosti ve srovnání s jejich kontrolními protějšky (DSS 2,5 %) (obrázek 1 a)). Kromě toho, bez ohledu na použitou koncentraci, nebyl u myší léčených ovocnou šťávou z noni pozorován žádný vliv na projevy klinických příznaků onemocnění ve srovnání s neléčenými myšmi (obrázek 1(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
3.2. DSS 2,5 % + noni 1 : 100, myši vystavené DSS a ošetřené ředěním ovocné šťávy v poměru 1 : 100. Konzumace ovocné šťávy z noni inhibuje zánět a zachovává střevní architekturu v závislosti na dávce
Protože po léčbě ovocnou šťávou z noni nebyly pozorovány žádné makroskopické účinky, zaměřili jsme se na zjištění, zda má konzumace ovocné šťávy nějaký mikroskopický účinek na střevní architekturu. Bylo zjištěno, že v závislosti na dávce si skupina, které byla podávána ovocná šťáva z noni, dokázala zachovat střevní architekturu. Zdravé myši (obrázek 2 a)) měly zachovaný povrch epitelu, přímočaré krypty tvořené obvyklým počtem pohárkových buněk. V lamina propria byl vizualizován obvyklý mononukleární infiltrát. Submukóza, svalovina a seróza měly normální architekturu. Myši vystavené DSS měly na povrchu střevního epitelu eroze a absenci krypt (tabulka 1). Lamina propria vykazovala středně silný edém a infiltraci mononukleárními buňkami (obrázek 2 b), hrot šipky), submukóza měla středně silný mononukleární infiltrát a silný edém (obrázek 2 b), šipka) a svalová vrstva byla mírně ztluštělá, s aktivitou kolitidy. U myší vystavených DSS a ošetřených čistou noni šťávou byly nepravidelnosti krypt řídké a mírné (tabulka 1) a lamina propria měla středně silný edém (obrázek 2(c), šipka) a mononukleární infiltrát (obrázek 2(c), hrot šipky); v podslizniční vrstvě však byl zjištěn pouze mírný mononukleární infiltrát a středně silný edém a svalová vrstva byla mírně ztluštělá. Naproti tomu u myší, kterým byla podávána šťáva z plodů noni ředěná v poměru 1 : 10, zůstaly zachovány nepravidelnosti krypt (obrázek 2(d), hvězdička), lamina propria vykazovala mírný edém (obrázek 2(d), šipka) i mononukleární infiltrát (obrázek 2(d), hrot šipky) a submukóza měla pouze mírný mononukleární infiltrát a mírný edém (tabulka 1). U myší, kterým byla podávána šťáva z plodů noni ředěná v poměru 1 : 100, byly krypty nepravidelné a atrofické (obrázek 2(e), hvězdička), lamina propria měla mírný edém a mononukleární infiltrát a submukózní vrstva vykazovala mírný mononukleární infiltrát a středně silný edém (tabulka 1). Celkově byla architektura střevních krypt zachována u myší, kterým byla podávána šťáva z plodů noni, a byla více zachována u myší, které dostávaly šťávu z noni v ředění 1 : 10 a 1 : 100 ve srovnání s myšmi, kterým byla podávána čistá noni nebo DSS.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Tvorba NO byla snížena u myší, kterým byla podávána šťáva z plodů noni ředěná v poměru 1 : 10 a 1 : 100, ve srovnání s těmi, které dostávaly čistou noni nebo DSS (obrázek 3 a)). Navíc bez ohledu na použitou koncentraci měly myši, kterým byla podávána šťáva z ovoce noni, sníženou aktivitu MPO (obrázek 3b) ve srovnání s myšmi vystavenými DSS. Přestože konzumace ovoce noni neměla vliv na úbytek hmotnosti a výsledek onemocnění, zlepšení střevní architektury a snížení aktivity enzymů zodpovědných za zánět byly spojeny s konzumací ovocné šťávy v závislosti na dávce.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.3. Konzumace šťávy z ovoce noni snižuje množství klíčových zánětlivých cytokinů ve střevě v závislosti na dávce
Nakonec jsme se zaměřili na vyhodnocení, zda zlepšení střevní architektury může být také spojeno s modulací klíčových cytokinů spojených se zhoršením/ochranou před onemocněním. Myši, kterým byla podávána šťáva z plodů noni, bez ohledu na použitou koncentraci, vykazovaly sníženou produkci zánětlivých cytokinů TNF-α a IFN-γ (obr. 4(a), resp. 4(c)). Snížení IL-17, dalšího klíčového cytokinu spojeného se zhoršením onemocnění, bylo pozorováno pouze u myší léčených ředěním 1 : 10 a 1 : 100 (obr. 4(e)). Nicméně nebyly zjištěny žádné rozdíly v produkci IL-12 (obrázek 4b), IL-4 (obrázek 4d), IL-23 (obrázek 4f) a IL-10 (obrázek 4g). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že zlepšení střevní architektury může být spojeno také s lokálním snížením klíčových zánětlivých cytokinů.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Diskuse
Předložené výsledky ukazují, že šťáva z ovoce noni může snižovat množství klíčových zánětlivých cytokinů podílejících se na rozvoji střevního zánětu. Kromě toho se ukázalo, že léčba pomocí ovocné šťávy je schopna zlepšit i střevní architekturu, a to především při použití ředění 1 : 10. Přinejmenším zdánlivě však nebyly zjištěny žádné účinky na projevy klinických příznaků onemocnění.
Příznivé vlastnosti léčby pomocí ovocné šťávy z noni při kontrole kolitidy byly částečně přisuzovány zlepšení střevní architektury spolu se snížením zánětlivého infiltrátu. Tento scénář byl následován snížením aktivity NO (pouze při ředění ovocné šťávy z noni v poměru 1 : 10 a 1 : 100) a MPO (při jakékoli koncentraci). NO je silný prozánětlivý mediátor odvozený především od indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (iNOS) po stimulaci bakteriálními endotoxiny a zánětlivými cytokiny, jako jsou IL-1β, TNF-α a IFN-γ, v různých typech buněk, včetně makrofágů, neutrofilů, endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva . Uvádí se, že nadměrná exprese iNOS, zejména na sliznicích, jako je gastrointestinální trakt, je spojena s rozvojem zánětlivých onemocnění, včetně IBD . V této souvislosti byla popsána přímá souvislost produkce vysokých hladin NO infiltrujícími buňkami, jako jsou makrofágy, neutrofily a lymfocyty, a také epiteliálními buňkami tlustého střeva s lokálním poškozením tkání a zhoršením onemocnění u IBD . Toto pozorování bylo podpořeno skutečností, že nadměrná exprese iNOS indukovaná zánětlivými cytokiny IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 a IL-23 byla zjištěna v plazmě, v mononukleárních buňkách lamina propria a v epiteliálních buňkách tlustého střeva pacientů s IBD a myší se střevním zánětem , což posiluje úlohu derivátů iNOS, jako je NO, a zánětlivých cytokinů ve zhoršování a výsledku onemocnění. Proto se zdá být důvodné se domnívat, že terapie zaměřené na modulaci těchto aspektů mohou představovat důležitý nástroj k omezení zánětu a progrese onemocnění. V této souvislosti monotropein izolovaný z kořenů Morinda officinalis, člena čeledi Rubiaceae stejně jako M. citrifolia, snížil in vitro produkci NO v myších makrofázích po stimulaci LPS v závislosti na dávce . Pozitivní korelace mezi NO a závažností IBD byla navržena v klinických studiích popisujících výskyt vysokých hladin dusitanů/nitrátů v plazmě, moči a lumen pacientů s IBD . Shin et al. rovněž prokázali aktivitu monotropeinu, když byly myši vystaveny 4% DSS po dobu 9 po sobě jdoucích dnů. V tomto případě byla léčba schopna snížit aktivitu zánětlivých hráčů COX-2 a MPO . Studium aktivity MPO je kritickým markerem infiltrace neutrofilů ve střevní sliznici . Studie využívající různé protokoly k vyvolání kolitidy skutečně prokázaly pozitivní korelaci mezi stanovením aktivity MPO a závažností onemocnění . Ačkoli v naší studii nebyla stanovena exprese COX-2 a iNOS, tyto výsledky naznačují, že různí členové čeledi Rubiaceae mohou podobným způsobem modulovat zánět, a inhibovat tak progresi a závažnost kolitidy vyvolané DSS pomocí analogických mechanismů. Schopnost modulovat klíčové složky zánětu pomocí terapií zaměřených na kontrolu aktivity různých typů buněk, jako jsou makrofágy, kromě snížení produkce cytokinů a NO, jak bylo pozorováno v naší studii při použití NFJ, představuje slibný přístup k omezení progrese zánětu u IBD. Kontrola zánětu těmito mechanismy může vysvětlovat zachování střevní architektury pozorované v naší studii při použití ředění 1 : 10 a 1 : 100.
Komplexní a heterogenní mechanismy spojené s rozvojem střevního zánětu zahrnují genetiku hostitele, spouštěče z prostředí a poruchy jak ve složení mikrobioty, tak v imunitní rovnováze . Závažnost střevního zánětu je spojena se zvýšenou produkcí prozánětlivých cytokinů (např. TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 a IL-23), což činí relevantní terapii zaměřenou na snížení hladiny těchto cytokinů. V naší studii byla léčba šťávou z plodů noni v závislosti na dávce schopna snížit produkci TNF-α, IFN-γ a IL-17 ve střevě.
TNF-α je jedním z ústředních hráčů při rozvoji střevního zánětu , a je zvýšený ve střevní sliznici pacientů s IBD. Tento cytokin má také klíčovou roli v produkci NO a zvyšuje produkci metaloproteinázy, což přispívá ke ztrátě integrity epitelu a ke zhoršení onemocnění. Účinky TNF-α jsou zprostředkovány dvěma receptory, a to receptorem TNF-1 (TNFR-1) a receptorem TNF-2 (TNFR-2). První z nich může být exprimován v imunitních i neimunitních buňkách, což vede k aktivaci NF-κB, cytotoxicitě a produkci zánětlivých cytokinů . V naší studii léčba šťávou z plodů noni výrazně snížila produkci TNF-α ve střevě, a to bez ohledu na použité ředění. Tuto modulaci lze alespoň částečně přičíst inhibici NF-κB kyselinou askorbovou a flavonoidním glykosidem, které byly izolovány z fermentované ovocné šťávy noni . Je však možné spekulovat, že tyto molekuly by mohly snižovat hladinu TNF-α ve střevě prostřednictvím downregulace TNFR-1. Vzhledem k významu tohoto cytokinu při rozvoji a zhoršování IBD by totiž mohly být užitečné terapie zaměřené na cílené ovlivnění TNF-α, aby se zabránilo rozvoji střevního zánětu. Podávání monoklonálních protilátek proti IL-6 a TNF-α dokázalo snížit závažnost onemocnění a zmírnit střevní zánět u DSS indukované kolitidy . Nicméně značný počet pacientů ztrácí citlivost zejména v důsledku tvorby protilátek proti léku a zrychlené clearance léku , a to posiluje potřebu nových terapeutických přístupů zaměřených na lepší kontrolu progrese IBD a snížení vedlejších účinků.
IFN-γ je prozánětlivý cytokin produkovaný širokou škálou buněk, včetně pomocných T buněk (CD4+T buněk) a cytotoxických T buněk (CD8+T buněk), přirozených zabíječů a vrozených lymfoidních buněk skupiny 1 . U pacientů s IBD byla prokázána vyšší frekvence CD4+T buněk a CD8+T buněk produkujících IFN-γ ve srovnání s jejich kontrolními protějšky . IFN-γ i TNF-α jsou ve sliznici pacientů s IBD zvýšené a působí synergicky, čímž přispívají k rozvoji a udržování zánětu, který vrcholí rozpadem bariéry . Bylo prokázáno, že tyto cytokiny za zánětlivých podmínek narušují proteiny mezibuněčných spojů, což není pozorováno v nezánětlivých oblastech nezdravé tkáně . Mezi mechanismy, které jsou základem těchto poruch, patří apoptóza epitelu a snížená transkripce proteinů těsných spojů . Terapie zaměřená na snížení tohoto cytokinu by proto mohla být užitečná při kontrole zánětu a zlepšení výsledků onemocnění. V této souvislosti dokázala krátkodobá léčba myší vystavených DSS po dobu šesti dnů glukokortikoidy snížit frekvenci CD4+ buněk produkujících IFN-γ ve slezině a snížit expresi tohoto cytokinu a IL-1β ve střevě . Toto snížení aktivity IFN-γ bylo následováno zlepšením klinického výsledku a obnovením imunitní rovnováhy . Kromě toho byly příznivé účinky spojené se snížením zánětlivých cytokinů, jako jsou IL-1β a IFN-γ, dále objasněny na myším modelu kolitidy. V tomto případě byla kolitida vyvolána intrakolonickým podáním kyseliny dinitrobenzensulfonové (DNBS) a myši byly léčeny pomocí nepsychotropního kanabinoidu, známého jako kanabigerol . Přestože v této studii nebyl zkoumán vliv léčby šťávou z plodů noni na apoptózu a střevní propustnost, zlepšení střevní architektury a snížení zánětlivého infiltrátu lze částečně přičíst snížení IFN-γ.
Buňky produkující IL-17 se podílejí na patogenezi mnoha zánětlivých a autoimunitních onemocnění a bylo prokázáno, že zprostředkovávají patogenezi onemocnění u IBD . Úloha buněk Th17 v patogenezi IBD byla přisuzována především mutaci v genu IL-23R, která byla identifikována u pacientů s IBD a která reguluje produkci cytokinů souvisejících s Th17 . Zvýšená produkce IL-17 buňkami lamina propria u UC i CD již byla skutečně prokázána . Dále bylo zjištěno, že cytokiny produkované buňkami Th17, jako jsou IL-17 a IL-21, regulují expresi TNF-α, IL-1β, IL-6 a IL-8 a nábor neutrofilů , což může přispívat ke zhoršení IBD. Kromě klasické role Th17 lymfocytů v patogenezi IBD se na produkci IL-17 a patogenezi onemocnění podílejí také vrozené lymfoidní buňky skupiny 3, a to jak v experimentálních modelech, tak u lidí . V naší studii byla zjištěna snížená hladina IL-17 v tlustém střevě myší léčených šťávou z ovoce noni, ale pouze při použití ředění 1 : 10 a 1 : 100 . Ačkoli jsme nezjistili, zda snížení IL-17 ve střevě souvisí spíše s vrozenou nebo adaptivní imunitou, případně s oběma, nemůžeme podceňovat význam terapií zaměřených na produkci těchto cytokinů za účelem potlačení zánětu při kolitidě.
Celkově naše údaje ukázaly, že léčba šťávou z ovoce noni hraje důležitou roli při potlačování zánětu během rozvoje experimentální kolitidy. Jeden z klíčových aspektů týkajících se použití ovocné šťávy jako terapeutické možnosti se týká jejího imunomodulačního účinku, který má následně vliv na zlepšení střevní architektury. Nicméně je třeba provést další studie, aby bylo možné objasnit molekuly, které jsou základem snížení zánětlivých cytokinů v tomto modelu.
Konkurenční zájmy
Autoři nehlásí žádný střet zájmů.
Poděkování
Tato studie byla podpořena Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) a Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2)
.