Abstract

Morinda citrifolia L. (noni) is aangetoond voor de behandeling van verschillende aandoeningen. Gegevens over de rol van noni bij de behandeling van darmontsteking behoeven echter nog opheldering. In de huidige studie onderzochten we de effecten van nonivruchtensap (NFJ) in de behandeling van C57BL/6 muizen, die continu werden blootgesteld aan dextran sulfaat natrium (DSS) gedurende 9 opeenvolgende dagen. Consumptie van NFJ had geen invloed op de vermindering van de klinische tekenen van de ziekte of op het gewichtsverlies. Niettemin, wanneer een verdunning van 1 : 10 werd gebruikt, bleef de darmarchitectuur van de muizen behouden, vergezeld van een vermindering van het ontstekingsinfiltraat. Ongeacht de concentratie van NFJ, werd ook een afname van zowel de activiteit van myeloperoxidase als van de belangrijkste ontstekingsbevorderende cytokines, TNF-α en IFN-γ, waargenomen in de darm. Bovendien werd bij verdunning van NFJ met 1 : 10 en 1 : 100 een vermindering van de productie van stikstofmonoxide en IL-17 waargenomen in darmhomogenaten. Over het geheel genomen was de behandeling met NFJ effectief in verschillende aspecten geassocieerd met ziekteprogressie en -verergering. Deze resultaten kunnen wijzen op nonivruchten als een belangrijke bron van ontstekingsremmende moleculen met een groot potentieel om de progressie van ontstekingsziekten te remmen, zoals inflammatoire darmziekten.

1. Inleiding

De potentiële ontstekingsremmende activiteiten van verschillende natuurlijke verbindingen in de downregulatie van belangrijke spelers in de ontwikkeling van ontsteking zijn onderzocht in verschillende scenario’s, waaronder de modulatie van cytokinen, transcriptiefactoren, enzymen, en de productie van eiwit en niet-eiwit ontstekingsmediatoren. Deze activiteiten omvatten de modulatie van cytokinen (b.v. IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 en IL-12), transcriptiefactoren, enzymen (b.v. myeloperoxidase-MPO en cyclooxygenase COX-1 en COX-2), en ook de productie van stikstofmonoxide (NO) . Gezien hun belang bij het beheersen van ontstekingen, zijn therapieën gericht op dergelijke moleculen voorgesteld als mogelijke hulpmiddelen bij de preventie en/of behandeling van ontstekingsziekten, zoals reumatoïde artritis , dermatitis , en inflammatoire darmziekten (IBD) . IBD’s zijn chronische ontstekingsziekten van het maagdarmkanaal, die klinisch de vorm aannemen van een van de twee aandoeningen, de ziekte van Crohn (CD) of colitis ulcerosa (UC) . Deze ziekten zijn van bijzonder belang omdat zij wereldwijd miljoenen mensen treffen, en de huidige therapieën nog steeds niet volledig effectief zijn in het beheersen van de ziekteprogressie of het voorkomen van het optreden van bijwerkingen.

Morinda citrifolia L. (noni) behoort tot de Rubiaceae familie, en het is een bron van natuurlijke moleculen die door de Polynesiërs al meer dan 2000 jaar als geneeskrachtige plant wordt gebruikt. Tot dusver zijn uit nonivruchten verschillende bioactieve verbindingen geïsoleerd, waaronder vetzuren, flavonoïden, polysacchariden en sterolen. Het ontstekingsremmend potentieel van nonivruchtbestanddelen werd aangetoond in een experimenteel model van Helicobacter pylori infectie waarbij ethanol en ethylacetaat extracten werden gebruikt. Deze extracten waren in staat om zowel neutrofiele chemotaxis als de productie van induceerbaar stikstofmonoxide (iNOS) en COX-2 te verminderen. Dienovereenkomstig vertoonden C57BL/6 muizen die oraal werden behandeld met nonivruchtensap aan 500 mg kg-1 dag-1 gedurende 60 dagen een verminderd ontstekingsinfiltraat en cytokine-expressie voor IL-12, TNF-α, TGF-β, en IL-10, in de voetzool geïnfecteerd met Leishmania amazonensis . Het is belangrijk te vermelden dat cytokinen zoals IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17, en IL-23 geassocieerd worden met de ontwikkeling en verergering van IBD, zodat ze anders benaderd worden om deze ontstekingsaandoening te behandelen. Bovendien werd het ontstekingsremmend potentieel van Morinda citrifolia bladextract aangetoond door de vermindering van TNF-α, IL-1β, en NO niveaus in macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) . Hoewel de rol van nonivruchtbestanddelen bij het beheersen van ontstekingsspelers van bijzonder belang is, zijn hun effecten bij de ontwikkeling van darmontsteking nog steeds slecht onderzocht.

Daarom toonde deze studie de effecten van nonivruchtensap op het cytokine samenspel en de intestinale architectuur in een muismodel van dextran sulfaat natrium-geïnduceerde colitis als onderliggende mechanismen voor zijn immunomodulerende activiteit.

2. Materialen en Methoden

2.1. Collectie en Botanische Identificatie van de Plant

De in deze studie gebruikte vruchten werden verkregen uit de monocultuur van 150 noniplanten op Fazenda Boa Vontade, een boerderij in de gemeente Araguari, Triângulo Mineiro/MG, Brazilië, op coördinaten 18°43′47.23′S, 48°6′49.50′O (gegevens van Google Earth, 2013). Alle specimens werden geprepareerd volgens conventionele herboringstechnieken en gedeponeerd in het herbarium van de Federale Universiteit van Uberlândia (HUFU Herbarium) onder het registratienummer HUFU-67210, als Morinda citrifolia L. (Rubiaceae).

2.2. Sap extractieproces

Morinda citrifolia (noni) sap werd bereid in het Laboratorium voor Farmacognosie van de Universiteit van Uberaba, in Uberaba, Minas Gerais, Brazilië. M. citrifolia vruchten werden handmatig en willekeurig verzameld van 150 planten, gewassen in ozonated water, en gedurende 3-5 dagen bij kamertemperatuur bewaard. De vruchten werden mechanisch ontpulpt met behulp van een fruit ontpitter en, na verwijdering van de zaden, werd de resulterende pulp gecentrifugeerd bij 4.000 rpm onder koeling totdat de supernatanten helder waren, en het werd vervolgens beschouwd als 100% (v/v) sap en opgeslagen bij -70°C tot verder gebruik.

2.3. Dierproeven

Mannelijke C57BL/6 muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht van 20-25 g werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije en standaardgecontroleerde omgevingsomstandigheden bij een constante temperatuur (25°C) bij een 12-uurs licht-donkercyclus, met ad libitum toegang tot voedsel en water, in de animal housing facility van de Federale Universiteit van Triângulo Mineiro (UFTM), Brazilië. Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van UFTM onder protocol 275. De experimenten werden uitgevoerd met 8 muizen/groepen, als volgt: zoutoplossing, gezonde controlemuizen behandeld met zoutoplossing; DSS 2,5%, muizen blootgesteld aan dextran sulfaat natrium (DSS); DSS 2,5% + pure noni, muizen blootgesteld aan DSS en behandeld met pure noni vruchtensap; DSS 2.5% + noni 1 : 10, muizen blootgesteld aan DSS en behandeld met een 1 : 10 verdunning van nonivruchtensap; en DSS 2,5% + noni 1 : 100, muizen blootgesteld aan DSS en behandeld met een 1 : 100 verdunning van nonivruchtensap. Een volume van 100 μl per muis werd oraal toegediend gedurende 9 opeenvolgende dagen.

2.4. DSS-geïnduceerde colitis en klinische beoordeling

Colitis werd geïnduceerd door 2,5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, Frankrijk, Moleculair gewicht: 36.000-50.000 kDa) continu toegevoegd aan het drinkwater gedurende 9 opeenvolgende dagen voor het verzamelen van monsters. Naast het registreren van de dagelijkse voedsel- en wateropname, werden ook de veranderingen in lichaamsgewicht en de klinische ziektesymptomen elke dag beoordeeld om een klinische ziektescore voor elke muis te verkrijgen. Elk teken dat de dieren vertoonden kwam overeen met één punt, en de som van de punten voor elke muis bepaalde een klinische score. De klinische scores werden bepaald zoals eerder hierin beschreven. Euthanasie en monstername

De muizen werden geëuthanaseerd op dag 9, en de dikke darm werd verwijderd voor verdere analyse. De colon monsters werden verdeeld in kleinere secties die werden ondergedompeld in PBS/10% formaldehyde voor paraffine inbedding of werden onmiddellijk bevroren in vloeibare stikstof voor kwantificering van myeloperoxidase (MPO) of stikstofmonoxide (NO) activiteit door enzymatische assays. Bovendien werd van elke muis een darmsectie verzameld in een oplossing met proteaseremmers (Complete®, Roche Pharmaceuticals, Mannheim, Duitsland) voor cytokinekwantificering door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

2.6. Myeloperoxidase (MPO) en stikstofoxide (NO)

Briefjes, voor MPO assay, werden de secties gehomogeniseerd en erytrocyten werden gelyseerd. De na centrifugatie verkregen pellet werd geresuspendeerd, gevolgd door drie vries-en-dooicycli. Na centrifugatie werd het supernatans in 96-well-platen gebracht en bij 37°C geopenbaard met tetramethylbenzidine (TMB)-substraat (BD OptEIA™, San Diego, CA). De reactie werd gestopt en aflezingen werden uitgevoerd in een spectrofotometer bij 450 nm. De MPO-activiteit werd bepaald zoals eerder beschreven. De resultaten werden genormaliseerd naar het drooggewicht van elke darmsectie en uitgedrukt als optische dichtheid per gram weefsel (nm / g weefsel).

Voor NO meting, werd het nitriet geaccumuleerd in darmhomogenaten gemeten als een indicator van NO productie met behulp van Griess reactie . Vervolgens werd 100 μl weefselhomogenaat gemengd met 100 μl Griess-reagens, dat is samengesteld uit gelijke volumes van 1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) fosforzuur, en 0,1% (w/v) naftyl-ethyleendiamine-HCl, en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min. De extinctie werd gemeten bij 540 nm in een 96-wells-plaatlezer (Perkin Elmer Cetus, CA, USA). De hoeveelheid nitriet in de monsters werd berekend met behulp van lineaire regressieanalyse van de extinctie van de seriële verdunning van de natriumnitriet-standaardcurve. De resultaten werden genormaliseerd naar het drooggewicht van elke darmsectie en uitgedrukt als picogram per milliliter per gram weefsel (pg/ml/g).

2.7. Cytokine Kwantificering door ELISA

Cytokines IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4, en IL-23 werden gekwantificeerd in weefselhomogenaten door ELISA volgens de instructies van de fabrikant (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). De resultaten werden genormaliseerd naar het drooggewicht van elke darmsectie en uitgedrukt in nanogram per milliliter per gram weefsel (ng/mL/g weefsel).

2.8. Histologie en histopathologische analyse

Om de microscopische schade te beoordelen, werden de darmsecties in de lengte doorgesneden, gewassen met PBS, gefixeerd in 10% gebufferde formaline gedurende 24 uur, en vervolgens verwerkt voor paraffine inbedding gevolgd door microtoom snijden. Weefsel secties (5 urn) werden verkregen en gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Voor histopathologische analyse werden de mucosa, submucosa, spierlagen en serosa geëvalueerd. Deze darmsecties werden ook beoordeeld op de aanwezigheid van oedeem, ontstekingsinfiltraat, en epitheliale afwijkingen.

Images werden vastgelegd met behulp van een digitale videocamera (Evolution MP 5.0 color Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA), met een 10x objectief, gekoppeld aan een lichtmicroscoop (Nikon Eclipse 50i, Melville, NY, USA). Morfometrie werd uitgevoerd met Image-Pro Insight (Media Cybernetics). Het ontstekingsinfiltraat werd gemeten op basis van het beschadigde gebied met ontstekingsinfiltraat gedeeld door het totale gebied van weefsel gevisualiseerd in het verworven beeld en uitgedrukt als een percentage (%). Een getrainde patholoog die blind was voor de behandeling voerde de histopathologische analyse uit.

2.9. Voor alle variabelen werden de normale verdeling en homogene variantie getest. Wanneer de verdeling normaal en de variantie homogeen werd geacht, werden parametrische tests gebruikt: ongepaarde Student’s -test of eenzijdige ANOVA gevolgd door Tukey’s post hoc test. Bij een niet-Gaussiaanse verdeling van de gegevens werden de volgende niet-parametrische toetsen gebruikt: Mann-Whitney test of Kruskal-Wallis test, gevolgd door Dunn’s post hoc test. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. De waargenomen verschillen werden als significant beschouwd wanneer (5%). Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism, versie 5.0 (La Jolla, CA, USA).

3. Resultaten

3.1. Behandeling met Nonivruchtensap en Ziekteverloop

Vooreerst, om te beoordelen of nonivruchtensap in staat was gewichtsverlies en het resultaat van DSS-geïnduceerde colitis te voorkomen, werden de muizen gedurende 9 dagen blootgesteld aan DSS en vervolgens behandeld met het vruchtensap, zoals beschreven in Materialen en Methoden. De nonivruchtensapgroep leek het gewichtsverlies niet te verminderen in vergelijking met hun tegenhangers in de controlegroep (DSS 2,5%) (Figuur 1(a)). Bovendien was er, ongeacht de gebruikte concentratie, geen effect op de presentatie van klinische ziektesymptomen bij de muizen behandeld met nonivruchtensap in verhouding tot de onbehandelde muizen (figuur 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

3.2. Nonivruchtensapconsumptie remt ontsteking en behoudt darmarchitectuur op een dosis-afhankelijke wijze

Daarna, aangezien geen macroscopische effecten werden waargenomen na behandeling met nonivruchtensap, trachtten wij te bepalen of de consumptie van vruchtensap enig microscopisch effect had op de darmarchitectuur. Er werd waargenomen, op een dosis-afhankelijke manier, dat de groep die behandeld werd met nonivruchtensap in staat was om hun darmarchitectuur te behouden. Gezonde muizen (Figuur 2(a)) hadden een behouden epitheeloppervlak, rechtlijnige crypten, samengesteld door het gebruikelijke aantal gobletcellen. In de lamina propria, werd de gebruikelijke mononucleaire infiltraat gevisualiseerd. De submucosa, de musculus en de sereuze spieren hadden een normale architectuur. Muizen blootgesteld aan DSS hadden erosies aan het oppervlak van het darmepitheel en afwezigheid van crypten (tabel 1). De lamina propria toonde matig oedeem en infiltratie van mononucleaire cellen (figuur 2(b), pijlpunt), de submucosa had matig mononucleair infiltraat en ernstig oedeem (figuur 2(b), pijl), en de spierlaag was licht verdikt, met colitis activiteit. Bij muizen blootgesteld aan DSS en behandeld met zuiver nonisap, waren de onregelmatigheden in de crypten schaars en mild (tabel 1), en de lamina propria had matig oedeem (figuur 2(c), pijl) en mononucleair infiltraat (figuur 2(c), pijlpunt); echter, slechts een mild mononucleair infiltraat en matig oedeem werden gedetecteerd in de submucosale laag, en de musculaire laag was licht verdikt. Aan de andere kant, in muizen behandeld met nonivruchtensap verdund 1 : 10, hadden de crypten hun onregelmatigheden behouden (Figuur 2 (d), asterisk), de lamina propria vertoonde zowel matig oedeem (Figuur 2 (d), pijl) en mononucleair infiltraat (Figuur 2 (d), pijlpunt), en de submucosa had slechts een mild mononucleair infiltraat en matig oedeem (Tabel 1). Bij de muizen behandeld met nonivruchtensap verdund 1 : 100, waren de crypten onregelmatig en atrofisch (figuur 2(e), asterisk), de lamina propria had matig oedeem en mononucleair infiltraat, en de submucosale laag toonde een mild mononucleair infiltraat en matig oedeem (tabel 1). In het algemeen bleef de architectuur van de darmcrypten behouden bij de muizen die met nonivruchtensap werden behandeld, en deze was meer behouden bij muizen die nonisap kregen in een verdunning van 1 : 10 en 1 : 100 in vergelijking met muizen die met pure noni of DSS werden behandeld.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

De produktie van NO was verminderd bij de muizen die met nonivruchtensap verdund 1 : 10 en 1 : 100 waren behandeld, vergeleken met die welke zuivere noni of DSS hadden gekregen (figuur 3(a)). Bovendien hadden muizen die met nonivruchtensap waren behandeld, ongeacht de gebruikte concentratie, een verminderde MPO-activiteit (figuur 3(b)) in vergelijking met muizen die aan DSS waren blootgesteld. Hoewel gewichtsverlies en ziekte-uitkomst niet werden beïnvloed door nonivruchtconsumptie, waren de verbeterde darmarchitectuur en de verminderde activiteit van enzymen die verantwoordelijk zijn voor ontsteking geassocieerd met vruchtensapconsumptie op een dosis-afhankelijke manier.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.3. Consumptie van nonivruchtensap vermindert belangrijke inflammatoire cytokinen in de darm op een dosis-afhankelijke wijze

Ten slotte trachtten wij te evalueren of de verbetering van de intestinale architectuur ook geassocieerd kon worden met de modulatie van belangrijke cytokinen die geassocieerd zijn met ziekteverergering/bescherming. Muizen behandeld met nonivruchtensap, ongeacht de gebruikte concentratie, vertoonden een verminderde productie van de ontstekingsbevorderende cytokines TNF-α en IFN-γ (Figuren 4(a) en 4(c), resp.). Een vermindering van IL-17, een andere belangrijke cytokine geassocieerd met verslechtering van de ziekte, werd alleen waargenomen bij muizen behandeld met 1 : 10 en 1 : 100 verdunningen (figuur 4(e)). Er waren echter geen verschillen in de productie van IL-12 (Figuur 4(b)), IL-4 (Figuur 4(d)), IL-23 (Figuur 4(f)), en IL-10 (Figuur 4(g)). Tezamen suggereren deze resultaten dat een verbeterde darmarchitectuur ook kan worden geassocieerd met de lokale vermindering van de belangrijkste ontstekingsbevorderende cytokines.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

4. Discussie

De hierin gepresenteerde resultaten tonen aan dat nonivruchtensap belangrijke ontstekingsbevorderende cytokinen kan verminderen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van darmontsteking. Bovendien bleek behandeling met vruchtensap ook in staat de darmarchitectuur te verbeteren, vooral wanneer de verdunning 1 : 10 werd gebruikt. Er werden echter, althans ogenschijnlijk, geen effecten waargenomen op de presentatie van klinische ziektesymptomen.

De gunstige eigenschappen van de behandeling met nonivruchtensap bij de beheersing van colitis werden gedeeltelijk toegeschreven aan een verbetering van de darmarchitectuur samen met een vermindering van het ontstekingsinfiltraat. Dit scenario werd gevolgd door een afname van de activiteit van NO (alleen wanneer nonivruchtensap werd verdund met 1 : 10 en 1 : 100) en MPO (bij elke concentratie). NO is een sterke pro-inflammatoire mediatator die hoofdzakelijk wordt afgeleid van induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS) na stimulatie met bacteriële endotoxinen en ontstekingsbevorderende cytokinen zoals IL-1β, TNF-α, en IFN-γ, in verschillende celtypes, waaronder macrofagen, neutrofielen, endotheelcellen en gladde spiercellen. Overexpressie van iNOS, vooral op mucosale plaatsen, zoals het maagdarmkanaal, wordt in verband gebracht met de ontwikkeling van ontstekingsziekten, waaronder IBD. In deze context werd de productie van hoge NO niveaus door infiltrerende cellen, zoals macrofagen, neutrofielen, en lymfocyten, evenals door epitheelcellen van de dikke darm, beschreven als direct geassocieerd met lokale weefselschade en verergering van de ziekte bij IBD . Deze observatie werd versterkt door het feit dat de overexpressie van iNOS geïnduceerd door de inflammatoire cytokines IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17, en IL-23 werd gevonden in het plasma, in lamina propria mononucleaire cellen, en in colon epitheliale cellen van IBD patiënten en muizen met intestinale ontsteking , waardoor de rol van iNOS derivaten zoals NO, en inflammatoire cytokines, in de verergering van de ziekte en de uitkomst versterkt wordt. Daarom lijkt het redelijk te geloven dat therapieën die erop gericht zijn deze aspecten te moduleren, een belangrijk instrument kunnen zijn om de ontsteking en de ziekteprogressie in te perken. In deze context verminderde monotropeïne, geïsoleerd uit de wortels van Morinda officinalis, een lid van de familie Rubiaceae zoals M. citrifolia, de in vitro productie van NO in muriene macrofagen na stimulatie met LPS op een dosis-afhankelijke wijze. Een positieve correlatie tussen NO en de ernst van IBD werd voorgesteld in klinische studies die het voorkomen van hoge niveaus nitriet/nitraat in het plasma, de urine en het lumen van IBD-patiënten beschreven. Shin et al. toonden ook de activiteit van monotropeïne aan toen muizen gedurende 9 opeenvolgende dagen werden blootgesteld aan 4% DSS. In dit geval was de behandeling in staat om de activiteit van de ontstekingsactoren COX-2 en MPO te verminderen. De MPO-activiteit is een kritische marker voor de infiltratie van neutrofielen in het darmslijmvlies. Studies die gebruik maken van verschillende protocollen om colitis te induceren hebben inderdaad een positieve correlatie aangetoond tussen de bepaling van MPO-activiteit en de ernst van de ziekte . Hoewel de expressie van COX-2 en iNOS niet bepaald werd in onze studie, suggereren deze resultaten dat verschillende leden van de Rubiaceae familie de ontsteking op een gelijkaardige manier kunnen moduleren, en zo de progressie en de ernst van DSS-geïnduceerde colitis kunnen afremmen, gebruik makend van analoge mechanismen. De mogelijkheid om de belangrijkste ontstekingscomponenten te moduleren door therapieën die gericht zijn op het controleren van de activiteit van verschillende celtypes, zoals macrofagen, naast het verminderen van de productie van cytokines en NO, zoals in onze studie werd waargenomen toen NFJ werd gebruikt, vertegenwoordigt een veelbelovende benadering om de progressie van ontsteking in IBD te beperken. De beheersing van de ontsteking door deze mechanismen kan een verklaring zijn voor het behoud van de darmarchitectuur die in onze studie werd waargenomen bij gebruik van de verdunningen 1 : 10 en 1 : 100.

De complexe en heterogene mechanismen die in verband worden gebracht met de ontwikkeling van darmontsteking omvatten gastheergenetica, milieutriggers, en stoornissen in zowel de samenstelling van de microbiota als in het immuniteitsevenwicht. De ernst van darmontsteking wordt geassocieerd met verhoogde productie van proinflammatoire cytokines (bijv. TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17, en IL-23), waardoor therapieën gericht op het verminderen van de niveaus van deze cytokines relevant zijn. In onze studie was behandeling met nonivruchtensap, op een dosis-afhankelijke manier, in staat om de productie van TNF-α, IFN-γ, en IL-17 in de darm te verminderen.

TNF-α is een van de centrale spelers in de ontwikkeling van intestinale ontsteking , en het is verhoogd in het intestinale slijmvlies van patiënten met IBD . Dit cytokine heeft ook een centrale rol in de productie van NO, en het verhoogt de productie van metalloproteïnase, wat bijdraagt tot het verlies van epitheliale integriteit en tot verergering van de ziekte. De effecten van TNF-α worden gemedieerd door twee receptoren, TNF-receptor-1 (TNFR-1) en TNF-receptor-2 (TNFR-2). De eerstgenoemde receptor kan zowel in immuun- als niet-immuuncellen tot expressie komen, wat resulteert in de activering van NF-κB, cytotoxiciteit en de productie van ontstekingsbevorderende cytokines. In onze studie verminderde de behandeling met nonivruchtensap de productie van TNF-α in de darm aanzienlijk, ongeacht de gebruikte verdunning. Deze modulatie zou, althans gedeeltelijk, toegeschreven kunnen worden aan de remming van NF-κB door ascorbinezuur en flavonoïde glycoside, die geïsoleerd werden uit gefermenteerd nonivruchtensap. Het is echter mogelijk te speculeren dat deze moleculen de niveaus van TNF-α in de darm zouden kunnen verlagen door TNFR-1 te downreguleren. Gezien het belang van deze cytokine bij de ontwikkeling en verergering van IBD, zouden therapieën die gericht zijn tegen TNF-α om de ontwikkeling van darmontsteking te voorkomen, inderdaad nuttig kunnen zijn. De toediening van monoklonale antilichamen tegen IL-6 en TNF-α was in staat om de ernst van de ziekte te verminderen en de intestinale ontsteking te verzachten in colitis geïnduceerd door DSS. Desondanks verliest een aanzienlijk aantal patiënten responsiviteit, met name door de productie van antilichamen tegen het geneesmiddel en versnelde klaring van het geneesmiddel, en dat versterkt de behoefte aan nieuwe therapeutische benaderingen die gericht zijn op een betere beheersing van IBD progressie en het verminderen van bijwerkingen.

IFN-γ is een pro-inflammatoire cytokine geproduceerd door een breed scala van cellen, waaronder T-helpercellen (CD4+T-cellen) en cytotoxische T-cellen (CD8+T-cellen), natuurlijke killercellen, en groep 1 aangeboren lymfoïde cellen. Een hogere frequentie van CD4+T cellen en CD8+T cellen die IFN-γ produceren werd aangetoond bij patiënten met IBD in vergelijking met hun controle tegenhangers. Zowel IFN-γ als TNF-α zijn verhoogd in de mucosa van IBD patiënten en dragen synergetisch bij aan de ontwikkeling en instandhouding van ontsteking die culmineert in barrière afbraak. Van deze cytokinen is aangetoond dat zij onder ontstekingsomstandigheden de intercellulaire verbindingseiwitten verstoren, hetgeen niet wordt waargenomen in niet-ontstoken gebieden van ongezond weefsel. Enkele van de mechanismen die aan deze aandoeningen ten grondslag liggen zijn epitheliale apoptose en verminderde transcriptie van tight-junction proteïnen . Daarom zouden therapieën die erop gericht zijn deze cytokine te verminderen, nuttig kunnen zijn om de ontsteking onder controle te houden en het ziekteverloop te verbeteren. In deze context was een kortdurende behandeling met glucocorticoïden van muizen die gedurende zes dagen werden blootgesteld aan DSS in staat om de frequentie van IFN-γ-producerende CD4+ cellen in de milt te verminderen en de expressie van dit cytokine en IL-1β in de darm te verminderen. Deze vermindering van de activiteit van IFN-γ werd gevolgd door een verbetering van de klinische uitkomst en herstel van het immuniteitsevenwicht . Bovendien werden de gunstige effecten geassocieerd met de vermindering van ontstekingsbevorderende cytokines zoals IL-1β en IFN-γ verder opgehelderd in een murien model van colitis. In dit geval werd colitis geïnduceerd door intracoloniale toediening van dinitrobenzeensulfonzuur (DNBS), en werden de muizen behandeld met een niet-psychotrope cannabinoïde, bekend als cannabigerol . Hoewel de effecten van nonivruchtensapbehandeling op apoptose en darmpermeabiliteit in deze studie niet werden onderzocht, zouden de verbetering van de darmarchitectuur en de vermindering van het ontstekingsinfiltraat gedeeltelijk kunnen worden toegeschreven aan de vermindering van IFN-γ.

IL-17-producerende cellen zijn betrokken bij de pathogenese van talrijke ontstekings- en auto-immuunziekten, en er is aangetoond dat zij de ziektepathogenese in IBD mediëren. De rol van Th17 cellen in de pathogenese van IBD werd voornamelijk toegeschreven aan een mutatie in het IL-23R gen, dat werd geïdentificeerd bij IBD patiënten en dat de productie van Th17-gerelateerde cytokines reguleert. Inderdaad was reeds een verhoogde productie van IL-17 door lamina propria cellen in zowel UC als CD aangetoond . Bovendien werd vastgesteld dat cytokines geproduceerd door Th17 cellen, zoals IL-17 en IL-21, de expressie van TNF-α, IL-1β, IL-6, en IL-8 en de rekrutering van neutrofielen upreguleren, wat kan bijdragen tot de verergering van IBD. Naast de klassieke rol van Th17 lymfocyten in IBD pathogenese, zijn groep 3 aangeboren lymfoïde cellen ook betrokken bij IL-17 productie en ziekte pathogenese in zowel experimentele modellen en menselijke proefpersonen. In onze studie werden verlaagde niveaus van IL-17 gedetecteerd in de dikke darm van muizen behandeld met nonivruchtensap, maar alleen wanneer de 1 : 10 en 1 : 100 verdunningen werden gebruikt. Hoewel we niet hebben vastgesteld of de vermindering van IL-17 in de darm meer geassocieerd was met aangeboren of adaptieve immuniteit, of beide, kunnen we het belang van therapieën die gericht zijn op de productie van deze cytokinen om ontsteking in colitis te remmen niet onderschatten.

Over het geheel genomen toonden onze gegevens aan dat de behandeling met nonivruchtensap een belangrijke rol speelt in het remmen van ontsteking tijdens de ontwikkeling van experimentele colitis. Een van de belangrijkste aspecten met betrekking tot het gebruik van vruchtensap als therapeutische optie betreft zijn immuunmodulerende werking, die een consequente invloed heeft op de verbetering van de darmarchitectuur. Niettemin moeten verdere studies worden uitgevoerd om de moleculen die ten grondslag liggen aan de vermindering van inflammatoire cytokines in dit model op te helderen.

Competing Interests

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2).