- Abstract
- 1. Johdanto
- 2. Materiaalit ja menetelmät
- 2.1. Noni-hedelmämehun vaikutus sytokiinien väliseen vuorovaikutukseen ja suoliston arkkitehtuuriin. Kasvin keruu ja kasvitieteellinen tunnistaminen
- 2.2. Mehun uuttoprosessi
- 2.3. Tutkimuksen tulokset Eläinkokeet
- 2.4. DSS:n aiheuttama koliitti ja kliininen arviointi
- 2.5. Eutanasia ja näytteenotto
- 2.6. Myeloperoksidaasi (MPO) ja typpioksidi (NO)
- 2.7. Sytokiinien kvantifiointi ELISA:lla
- 2.8. Histologia ja histopatologinen analyysi
- 2.9. Tietojen analysointi ja tilastot
- 3. Tulokset
- 3.1. Tulokset 3. Hoito noni-hedelmämehulla ja taudin lopputulos
- 3.2. DSS 2,5 % + noni 1 : 100, hiiret altistettiin DSS:lle ja hoidettiin hedelmämehun 1 : 100 laimennoksella. Noni-hedelmämehun nauttiminen estää tulehdusta ja säilyttää suoliston arkkitehtuurin annosriippuvaisesti
- 3.3. Noni-hedelmämehun nauttiminen vähentää keskeisiä tulehdussytokiineja suolistossa annosriippuvaisesti
- 4. Keskustelu
- Kilpailevat intressit
- Kiitokset
Abstract
Morinda citrifolia L. (noni) on osoitettu hoitavan erilaisia häiriöitä. Tiedot sen roolista suolistotulehduksen hoidossa vaativat kuitenkin vielä selvittämistä. Tässä tutkimuksessa selvitimme noni-hedelmämehun (NFJ) vaikutuksia C57BL/6-hiirten hoidossa, jotka altistettiin jatkuvasti dekstraanisulfaattinatriumille (DSS) 9 peräkkäisen päivän ajan. NFJ:n nauttimisella ei ollut vaikutusta taudin kliinisten oireiden vähenemiseen tai laihtumiseen. Kun kuitenkin käytettiin laimennosta 1:10, hiirten suoliston arkkitehtuuri säilyi ja tulehduksellinen infiltraatti väheni. NFJ:n pitoisuudesta riippumatta suolistossa havaittiin myös sekä myeloperoksidaasin aktiivisuuden että keskeisten tulehdussytokiinien TNF-α ja IFN-γ vähenemistä. Lisäksi kun NFJ:tä laimennettiin 1 : 10 ja 1 : 100, suoliston homogenaatissa havaittiin typpioksidin ja IL-17:n tuotannon vähenemistä. Kaiken kaikkiaan NFJ-hoito oli tehokasta taudin etenemiseen ja pahenemiseen liittyvissä eri näkökohdissa. Nämä tulokset voivat viitata siihen, että noni-hedelmät ovat tärkeä anti-inflammatoristen molekyylien lähde, jolla on suuri potentiaali estää tulehdussairauksien, kuten tulehduksellisen suolistosairauden, etenemistä.
1. Johdanto
Monien luonnonyhdisteiden mahdollisia tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia tulehduksen kehittymisen avaintoimijoiden alasäätelyssä on tutkittu eri skenaarioissa, mukaan lukien sytokiinien, transkriptiotekijöiden, entsyymien ja proteiinien ja ei-proteiinien tulehdusvälittäjäaineiden tuotannon modulointi. Näihin toimintoihin kuuluu sytokiinien (esim. IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 ja IL-12), transkriptiotekijöiden, entsyymien (esim. myeloperoksidaasi-MPO ja syklooksygenaasi COX-1 ja COX-2) ja myös typpioksidin (NO) tuotannon modulointi. Koska ne ovat tärkeitä tulehduksen hallinnassa, näihin molekyyleihin kohdistuvia hoitoja on ehdotettu mahdollisiksi apuvälineiksi tulehdussairauksien, kuten nivelreuman, ihotulehduksen ja tulehduksellisen suolistosairauden (IBD), ehkäisyssä ja/tai hoidossa. IBD:t ovat ruoansulatuskanavan kroonisia tulehdussairauksia, jotka ilmenevät kliinisesti jompana kumpana sairautena, Crohnin tautina (CD) tai haavainen paksusuolen tulehdus (UC) . Nämä sairaudet ovat erityisen kiinnostavia, koska ne koskettavat miljoonia ihmisiä maailmanlaajuisesti, eivätkä nykyiset hoitomuodot ole vieläkään täysin tehokkaita taudin etenemisen hillitsemisessä tai haittavaikutusten ehkäisemisessä.
Morinda citrifolia L. (noni) kuuluu Rubiaceae-heimoon, ja se on luonnollisten molekyylien lähde, jota polynesialaiset ovat käyttäneet lääkekasvina yli 2000 vuoden ajan . Tähän mennessä noni-hedelmistä on eristetty useita bioaktiivisia yhdisteitä, kuten rasvahappoja, flavonoideja, polysakkarideja ja steroleja . Nonihedelmien yhdisteiden anti-inflammatorinen potentiaali on osoitettu Helicobacter pylori -infektion kokeellisessa mallissa, jossa käytettiin etanoli- ja etyyliasetaattiuutteita. Nämä uutteet pystyivät vähentämään sekä neutrofiilien kemotaksista että indusoituvan typpioksidin (iNOS) ja COX-2:n tuotantoa. Vastaavasti C57BL/6-hiirillä, joita hoidettiin suun kautta noni-hedelmämehulla 500 mg kg-1 pv-1 60 päivän ajan, väheni tulehduksellinen infiltraatti ja IL-12-, TNF-α-, TGF-β- ja IL-10-sytokiinien ilmentyminen Leishmania amazonensis -kasvintuhoojan infektoimassa jalkapohjassa. On tärkeää mainita, että sytokiinit, kuten IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 ja IL-23, liittyvät IBD:n kehittymiseen ja pahenemiseen, joten niitä on lähestytty eri tavalla tämän tulehduksellisen sairauden hoidossa . Lisäksi Morinda citrifolia -lehtiuutteen anti-inflammatorinen potentiaali osoitettiin vähentämällä TNF-α-, IL-1β- ja NO-tasoja makrofageissa sen jälkeen, kun niitä oli stimuloitu lipopolysakkaridilla (LPS) . Vaikka noni-hedelmäyhdisteiden rooli tulehdusta aiheuttavien toimijoiden hallinnassa on erityisen merkityksellinen, niiden vaikutuksia suolistotulehduksen kehittymiseen on tutkittu vielä vähän.
Sentähden tässä tutkimuksessa osoitettiin noni-hedelmämehun vaikutukset sytokiinien keskinäiseen vuorovaikutukseen ja suoliston arkkitehtuuriin dekstraanisulfaattinatriumin aiheuttaman koliitin hiirimallissa sen immunomodulatorisen vaikutuksen taustalla olevina mekanismeina.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Noni-hedelmämehun vaikutus sytokiinien väliseen vuorovaikutukseen ja suoliston arkkitehtuuriin. Kasvin keruu ja kasvitieteellinen tunnistaminen
Tässä tutkimuksessa käytetyt hedelmät saatiin 150 noni-kasvin monokulttuurista Fazenda Boa Vontadesta, joka sijaitsee Fazenda Boa Vontade -nimisellä maatilalla Araguarissa, Triângulo Mineiro/MG:ssä, Brasiliassa, koordinaateissa 18°43′47.23′′′ eteläistä leveyttä, 48°6′49.50′′o (tiedot Google Earth, 2013). Kaikki näytteet valmistettiin tavanomaisen herbaarisointitekniikan mukaisesti, ja ne talletettiin Uberlândian liittovaltion yliopiston herbaariin (HUFU Herbarium) rekisterinumerolla HUFU-67210 nimellä Morinda citrifolia L. (Rubiaceae).
2.2. Mehun uuttoprosessi
Morinda citrifolia (noni) -mehu valmistettiin Uberaban yliopiston farmakognosian laboratoriossa Uberabassa, Minas Geraisissa, Brasiliassa. M. citrifolia -hedelmät kerättiin käsin ja satunnaisesti 150 kasvista, pestiin otsonoidulla vedellä ja säilytettiin huoneenlämmössä 3-5 päivää. Hedelmät kuorittiin mekaanisesti hedelmänkuorimalaitteella, ja siementen poistamisen jälkeen saatu hedelmäliha sentrifugoitiin 4000 rpm:n kierrosnopeudella jäähdytyksen alaisena, kunnes supernatantit olivat kirkkaita, minkä jälkeen sitä pidettiin 100-prosenttisena (v/v) mehuna ja se varastoitiin -70 °C:ssa myöhempään käyttöön saakka.
2.3. Tutkimuksen tulokset Eläinkokeet
6-8 viikon ikäiset ja 20-25 g painavat urospuoliset C57BL/6-hiiret pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa ja standardisäädellyissä ympäristöolosuhteissa vakiolämpötilassa (25 °C) 12 tunnin valo-/pimeäjaksolla, ja niillä oli vapaasti saatavilla ruokaa ja vettä Triângulo Mineiron liittovaltionyliopiston (UFTM) eläinsuojalaitoksessa Brasiliassa. Kaikki eläinkokeet tehtiin UFTM:n laitoseläinten hoito- ja käyttökomitean pöytäkirjan 275 mukaisesti. Kokeet suoritettiin 8 hiirellä/ryhmä seuraavasti: suolaliuos, terveet kontrollihiiret, joita hoidettiin suolaliuoksella; DSS 2,5 %, hiiret, jotka altistuivat dekstraanisulfaattinatriumille (DSS); DSS 2,5 % + puhdas noni, hiiret, jotka altistuivat DSS:lle ja joita hoidettiin puhtaalla noni-hedelmämehulla; DSS 2.5 % + noni 1 : 10, hiiret altistettiin DSS:lle ja hoidettiin 1 : 10 laimennoksella noni-hedelmämehua; ja DSS 2,5 % + noni 1 : 100, hiiret altistettiin DSS:lle ja hoidettiin 1 : 100 laimennoksella noni-hedelmämehua. Hiirtä kohti annettiin 100 μl suun kautta 9 peräkkäisenä päivänä.
2.4. DSS:n aiheuttama koliitti ja kliininen arviointi
Koliitti indusoitiin 2,5-prosenttisella DSS:llä (MP Biomedicals, Illkirch, Ranska, molekyylipaino: 36 000-50 000 kDa), jota lisättiin jatkuvasti juomaveteen 9 peräkkäisenä päivänä näytteenottoa varten. Päivittäisen ruoan ja veden saannin kirjaamisen lisäksi arvioitiin päivittäin myös ruumiinpainon muutokset ja taudin kliiniset oireet, jotta jokaiselle hiirelle saatiin kliininen tautipistemäärä. Kukin eläinten oire vastasi yhtä pistettä, ja kunkin hiiren pisteiden summa määritti kliinisen pistemäärän. Kliiniset pisteet määritettiin aiemmin tässä kuvatulla tavalla .
2.5. Eutanasia ja näytteenotto
Hiiret lopetettiin 9. päivänä, ja paksusuoli poistettiin lisäanalyysejä varten. Paksusuolinäytteet jaettiin pienempiin osiin, jotka upotettiin PBS/10-prosenttiseen formaldehydiin parafiinin upottamista varten tai pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä myeloperoksidaasin (MPO) tai typpioksidin (NO) aktiivisuuden kvantifiointia varten entsymaattisilla määrityksillä. Lisäksi jokaisesta hiirestä kerättiin yksi suolileike proteaasi-inhibiittoreita (Complete®, Roche Pharmaceuticals, Mannheim, Saksa) sisältävään liuokseen sytokiinien kvantifiointia varten entsyymisidonnaisella immunosorbenttimäärityksellä (ELISA).
2.6. Myeloperoksidaasi (MPO) ja typpioksidi (NO)
Lyhyesti sanottuna MPO-määritystä varten leikkeet homogenisoitiin ja erytrosyytit lysoitiin. Sentrifugoinnin jälkeen saatu pelletti resuspendoitiin, minkä jälkeen tehtiin kolme jäädytys-sulatussykliä. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti sijoitettiin 96-kuoppalevyihin ja paljastettiin tetrametyylibentsidiinisubstraatilla (TMB) (BD OptEIA™, San Diego, CA) 37 °C:ssa. Reaktio pysäytettiin ja lukemat tehtiin spektrofotometrillä 450 nm:ssä. MPO-aktiivisuus määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla. Tulokset normalisoitiin kunkin suoliston osan kuivapainoon ja ilmaistiin optisena tiheytenä kudosgrammaa kohti (nm/g kudosta).
NO:n mittausta varten mitattiin suoliston homogenaatteihin kertynyttä nitriittiä NO:n tuotannon indikaattorina Griessin reaktiota käyttäen . Sitten 100 μl kudoshomogenaattia sekoitettiin 100 μl:aan Griess-reagenssia, joka koostuu yhtä suurista määristä 1 % (w/v) sulfanilamidia 5 % (v/v) fosforihapossa ja 0,1 % (w/v) naftyylietyleenidiamiini-HCl:ää, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuuttia. Absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä 96 kuoppalevyn lukulaitteessa (Perkin Elmer Cetus, CA, USA). Nitriitin määrä näytteissä laskettiin käyttämällä natriumnitriitin standardikäyrän sarjalaimennoksen absorbanssin lineaarista regressioanalyysia. Tulokset normalisoitiin kunkin suoliston osan kuivapainoon ja ilmaistiin pikogrammina millilitrassa kudosgrammaa kohti (pg/ml/g).
2.7. Sytokiinien kvantifiointi ELISA:lla
Sytokiinit IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4 ja IL-23 kvantifioitiin kudoshomogenaateista ELISA:lla valmistajan ohjeiden mukaisesti (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tulokset normalisoitiin kunkin suolileikkeen kuivapainoon ja ilmaistiin nanogrammoina millilitrassa kudosgrammaa kohti (ng/ml/g kudosta).
2.8. Histologia ja histopatologinen analyysi
Mikroskooppisten vaurioiden arvioimiseksi suolileikkeet leikattiin pituussuunnassa, pestiin PBS:llä, kiinnitettiin 10-prosenttiseen puskuroituun formaliiniin 24 tunniksi ja käsiteltiin sen jälkeen parafiiniin upottamista varten, jota seurasi mikrotomileikkaus. Kudosleikkaukset (5 μm) otettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E). Histopatologista analyysia varten arvioitiin limakalvo, submucosa, lihaskerrokset ja serosa. Morfometria suoritettiin Image-Pro Insight -ohjelmalla (Media Cybernetics). Tulehduksellinen infiltraatti mitattiin tulehduksellista infiltraattia sisältävän vaurioituneen alueen perusteella jaettuna otetussa kuvassa näkyvällä kudoksen kokonaispinta-alalla ja ilmaistuna prosentteina (%). Histopatologisen analyysin suoritti koulutettu patologi, joka oli sokea hoidolle.
2.9. Tietojen analysointi ja tilastot
Normaalijakauma ja homogeeninen varianssi testattiin kaikkien muuttujien osalta. Kun jakaumaa pidettiin normaalina ja varianssia homogeenisena, käytettiin parametrisia testejä: parittelematon Studentin -testi tai yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Tukeyn post hoc -testi. Jos tietojen jakauma ei ollut Gaussin kaltainen, käytettiin seuraavia ei-parametrisia testejä: Mann-Whitneyn testi tai Kruskal-Wallisin testi ja Dunnin post hoc -testi. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD. Havaittuja eroja pidettiin merkittävinä, kun (5 %). Tilastollinen analyysi tehtiin GraphPad Prism -ohjelmalla, versio 5.0 (La Jolla, CA, USA).
3. Tulokset
3.1. Tulokset
3. Hoito noni-hedelmämehulla ja taudin lopputulos
Ensiksi sen arvioimiseksi, pystyikö noni-hedelmämehu estämään painonpudotuksen ja DSS:n aiheuttaman paksusuolen tulehduksen lopputuloksen, hiiret altistettiin DSS:lle yhdeksän päivän ajan, minkä jälkeen hiiriä käsiteltiin hedelmämehulla, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Noni-hedelmämehuryhmä ei näyttänyt vähentävän painonpudotusta verrattuna kontrolliryhmään (DSS 2,5 %) (kuva 1(a)). Käytetystä pitoisuudesta riippumatta noni-hedelmämehulla käsitellyillä hiirillä ei myöskään ollut vaikutusta kliinisten tautioireiden esiintymiseen suhteessa käsittelemättömiin hiiriin (kuva 1(b)).
(a)
(b)
(a)
(b)
3.2. DSS 2,5 % + noni 1 : 100, hiiret altistettiin DSS:lle ja hoidettiin hedelmämehun 1 : 100 laimennoksella. Noni-hedelmämehun nauttiminen estää tulehdusta ja säilyttää suoliston arkkitehtuurin annosriippuvaisesti
Koska noni-hedelmämehun käytön jälkeen ei havaittu makroskooppisia vaikutuksia, pyrimme selvittämään, oliko hedelmämehun nauttimisella mikroskooppisia vaikutuksia suoliston arkkitehtuuriin. Havaittiin annosriippuvaisesti, että noni-hedelmämehulla käsitelty ryhmä pystyi säilyttämään suoliston arkkitehtuurin. Terveillä hiirillä (kuva 2(a)) epiteelin pinta oli säilynyt, suoraviivaiset kryptit, jotka koostuivat tavanomaisesta määrästä kalvosoluja. Lamina propria -kerroksessa näkyi tavanomainen mononukleaarinen infiltraatti. Submucosan, lihaksen ja seerumin arkkitehtuuri oli normaali. DSS:lle altistuneilla hiirillä oli eroosioita suolen epiteelin pinnalla ja kryptien puuttuminen (taulukko 1). Lamina propria osoitti kohtalaista turvotusta ja mononukleaaristen solujen infiltraatiota (kuva 2(b), nuolen kärki), submucosassa oli kohtalaista mononukleaarista infiltraatiota ja voimakasta turvotusta (kuva 2(b), nuoli), ja lihaskerros oli hieman paksuuntunut, mikä osoitti koliittiaktiivisuutta. Hiirillä, jotka altistuivat DSS:lle ja joita hoidettiin puhtaalla noni-mehulla, kryptojen epäsäännöllisyydet olivat harvinaisia ja lieviä (taulukko 1), ja lamina proprialla oli kohtalainen ödeema (kuva 2(c), nuoli) ja mononukleaarinen infiltraatti (kuva 2(c), nuolen kärki); submukoosikerroksessa havaittiin kuitenkin vain lievä mononukleaarinen infiltraatti ja kohtalainen ödeema, ja lihaskerros oli lievästi paksuuntunut. Toisaalta hiirillä, joita hoidettiin 1:10 laimennetulla noni-hedelmämehulla, kryptien epäsäännöllisyydet säilyivät (kuva 2(d), tähti), lamina propria osoitti sekä kohtalaista turvotusta (kuva 2(d), nuoli) että mononukleaarista infiltraattia (kuva 2(d), nuolen kärki), ja submukoosassa oli vain lievää mononukleaarista infiltraattia ja kohtalaista turvotusta (taulukko 1). Hiirillä, joita hoidettiin 1 : 100 laimennetulla noni-hedelmämehulla, kryptit olivat epäsäännöllisiä ja atrofisia (kuva 2(e), tähti), lamina propria -kerroksessa oli kohtalainen ödeema ja mononukleaarinen infiltraatti, ja submukoosikerroksessa näkyi lievä mononukleaarinen infiltraatti ja kohtalainen ödeema (taulukko 1). Yleisesti ottaen suolen kryptien arkkitehtuuri säilyi noni-hedelmämehulla hoidetuilla hiirillä, ja se säilyi paremmin hiirillä, jotka saivat noni-hedelmämehua laimennoksina 1 : 10 ja 1 : 100 verrattuna hiiriin, joita hoidettiin pelkällä noni-hedelmämehulla tai DSS:llä.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
NO:n tuotanto väheni hiirillä, joita hoidettiin noni-hedelmämehulla laimennettuna 1 : 10 ja 1 : 100, verrattuna hiiriin, jotka saivat puhdasta nonia tai DSS:ää (kuva 3 a). Lisäksi käytetystä pitoisuudesta riippumatta noni-hedelmämehulla käsitellyillä hiirillä oli vähentynyt MPO:n aktiivisuus (kuva 3(b)) verrattuna DSS:lle altistuneisiin hiiriin. Vaikka noni-hedelmien nauttiminen ei vaikuttanut painonpudotukseen ja taudin lopputulokseen, hedelmämehun nauttimiseen liittyi annosriippuvaisesti suoliston arkkitehtuurin paraneminen ja tulehduksesta vastaavien entsyymien aktiivisuuden väheneminen.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.3. Noni-hedelmämehun nauttiminen vähentää keskeisiä tulehdussytokiineja suolistossa annosriippuvaisesti
Viimeiseksi pyrimme arvioimaan, voisiko suoliston arkkitehtuurin paraneminen liittyä myös taudin pahenemiseen/suojautumiseen liittyvien keskeisten sytokiinien modulointiin. Noni-hedelmämehulla käsitellyillä hiirillä havaittiin käytetystä pitoisuudesta riippumatta vähentynyt tulehdussytokiinien TNF-α ja IFN-γ tuotanto (kuvat 4(a) ja 4(c)). IL-17:n, toisen keskeisen sytokiinin, joka liittyy taudin pahenemiseen, vähenemistä havaittiin vain hiirillä, joita hoidettiin laimennoksilla 1 : 10 ja 1 : 100 (kuva 4(e)). IL-12:n (kuva 4(b)), IL-4:n (kuva 4(d)), IL-23:n (kuva 4(f)) ja IL-10:n (kuva 4(g)) tuotannossa ei kuitenkaan ollut eroja. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että suoliston arkkitehtuurin paraneminen saattaa liittyä myös keskeisten tulehdussytokiinien paikalliseen vähenemiseen.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4. Keskustelu
Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että noni-hedelmämehu voi vähentää keskeisiä tulehdussytokiineja, jotka osallistuvat suolistotulehduksen kehittymiseen. Lisäksi osoitettiin, että hoito hedelmämehulla pystyi myös parantamaan suoliston arkkitehtuuria lähinnä silloin, kun käytettiin laimennosta 1 : 10. Ainakaan näennäisesti ei kuitenkaan havaittu vaikutuksia taudin kliinisten oireiden esiintymiseen.
Noni-hedelmämehua käyttävän hoidon suotuisat ominaisuudet paksusuolitulehduksen hallinnassa johtuivat osittain suoliston arkkitehtuurin paranemisesta yhdessä tulehdusinfiltraatin vähenemisen kanssa. Tätä skenaariota seurasi NO:n (vain silloin, kun noni-hedelmämehua laimennettiin 1 : 10 ja 1 : 100) ja MPO:n (millä tahansa pitoisuudella) aktiivisuuden väheneminen. NO on voimakas proinflammatorinen välittäjäaine, joka on peräisin pääasiassa indusoituvasta typpioksidisyntaasista (iNOS) sen jälkeen, kun sitä on stimuloitu bakteerien endotoksiineilla ja tulehduksellisilla sytokiineillä, kuten IL-1β:llä, TNF-α:lla ja IFN-γ:llä, eri solutyypeissä, mukaan lukien makrofagit, neutrofiilit, endoteelisolut ja sileät lihassolut . iNOS:n yliekspression, erityisesti limakalvokohdissa, kuten ruoansulatuskanavassa, on raportoitu liittyvän tulehdussairauksien, kuten IBD:n, kehittymiseen . Tässä yhteydessä infiltroivien solujen, kuten makrofagien, neutrofiilien ja lymfosyyttien, sekä paksusuolen epiteelisolujen tuottamien korkeiden NO-pitoisuuksien on kuvattu liittyvän suoraan paikalliseen kudosvaurioon ja taudin pahenemiseen IBD:ssä . Tätä havaintoa vahvisti se, että tulehdussytokiinien IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 ja IL-23 indusoimaa iNOS:n yliekspressiota havaittiin IBD-potilaiden ja hiirten, joilla oli suolistotulehdus, plasmassa, lamina propria -mononukleaarisoluissa ja paksusuolen epiteelisoluissa, mikä vahvisti iNOS:n johdannaisten, kuten NO:n, ja tulehdussytokiinien roolia taudin pahenemisvaiheessa ja lopputuloksessa. Siksi vaikuttaa järkevältä uskoa, että hoitomuodot, joilla pyritään muokkaamaan näitä näkökohtia, voivat olla tärkeä väline tulehduksen ja taudin etenemisen hillitsemiseksi. Tässä yhteydessä M. citrifolian kaltaisen Rubiaceae-heimon jäsenen Morinda officinaliksen juurista eristetty monotropeiini vähensi annosriippuvaisesti NO:n in vitro -tuotantoa hiiren makrofageissa LPS-stimulaation jälkeen. Positiivista korrelaatiota NO:n ja IBD:n vaikeusasteen välillä ehdotettiin kliinisissä tutkimuksissa, joissa kuvattiin korkeiden nitriitti-/nitraattipitoisuuksien esiintymistä IBD-potilaiden plasmassa, virtsassa ja luumenissa . Shin et al. osoittivat myös monotropeiinin aktiivisuuden, kun hiiret altistettiin 4 % DSS:lle 9 peräkkäisen päivän ajan. Tällöin hoito pystyi vähentämään tulehdusta aiheuttavien toimijoiden COX-2:n ja MPO:n aktiivisuutta . MPO-aktiivisuuden tutkiminen on kriittinen neutrofiilien infiltraation merkkiaine suolen limakalvolla . Tutkimukset, joissa on käytetty erilaisia protokollia koliitin indusoimiseksi, ovatkin osoittaneet positiivisen korrelaation MPO-aktiivisuuden määrittämisen ja taudin vakavuuden välillä . Vaikka COX-2:n ja iNOS:n ilmentymiä ei määritetty tutkimuksessamme, nämä tulokset viittaavat siihen, että Rubiaceae-heimon eri jäsenet voivat moduloida tulehdusta vastaavalla tavalla ja siten estää DSS-indusoidun koliitin etenemistä ja vaikeusastetta käyttämällä analogisia mekanismeja. Kyky moduloida keskeisiä tulehduskomponentteja terapioilla, joilla pyritään hallitsemaan eri solutyyppien, kuten makrofagien, toimintaa sen lisäksi, että vähennetään sytokiinien ja NO:n tuotantoa, kuten tutkimuksessamme havaittiin, kun NFJ:tä käytettiin, edustaa lupaavaa lähestymistapaa tulehduksen etenemisen rajoittamiseksi IBD:ssä. Näiden mekanismien avulla tapahtuva tulehduksen hallinta saattaa selittää tutkimuksessamme havaitun suoliston arkkitehtuurin säilymisen, kun käytettiin laimennoksia 1 : 10 ja 1 : 100.
Suolitulehduksen kehittymiseen liittyviin monimutkaisiin ja heterogeenisiin mekanismeihin kuuluvat isännän genetiikka, ympäristöstä johtuvat laukaisevat tekijät ja häiriöt sekä mikrobiston koostumuksessa että immuunitasapainossa . Suolistotulehduksen vakavuus liittyy proinflammatoristen sytokiinien (esim. TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 ja IL-23) lisääntyneeseen tuotantoon, minkä vuoksi hoitomuodot, joilla pyritään alentamaan näiden sytokiinien tasoja, ovat merkityksellisiä. Tutkimuksessamme hoito noni-hedelmämehulla pystyi annosriippuvaisesti vähentämään TNF-α:n, IFN-γ:n ja IL-17:n tuotantoa suolistossa.
TNF-α on yksi keskeisistä toimijoista suolistotulehduksen kehittymisessä , ja se on suurentunut IBD:tä sairastavien potilaiden suolen limakalvolla. Tällä sytokiinillä on myös keskeinen rooli NO:n tuotannossa, ja se lisää metalloproteinaasin tuotantoa, mikä edistää epiteelin eheyden menetystä ja taudin pahenemista. TNF-α:n vaikutuksia välittävät kaksi reseptoria, TNF-reseptori-1 (TNFR-1) ja TNF-reseptori-2 (TNFR-2). Ensin mainittu voi ilmentyä joko immuunisoluissa tai ei-immuunisoluissa, mikä johtaa NF-κB:n aktivoitumiseen, sytotoksisuuteen ja tulehdussytokiinien tuotantoon . Tutkimuksessamme hoito noni-hedelmämehulla vähensi huomattavasti TNF-α:n tuotantoa suolistossa käytetystä laimennoksesta riippumatta. Tämä modulaatio voisi ainakin osittain johtua NF-κB:n estämisestä askorbiinihapolla ja flavonoidiglykosidilla, jotka eristettiin fermentoidusta noni-hedelmämehusta . On kuitenkin mahdollista spekuloida, että nämä molekyylit saattavat vähentää TNF-α:n määrää suolistossa alentamalla TNFR-1:n säätelyä. Koska tämä sytokiini on tärkeä IBD:n kehittymisessä ja pahenemisessa, TNF-α:han kohdistuvat hoidot suolistotulehduksen kehittymisen ehkäisemiseksi voisivat olla hyödyllisiä. IL-6:n ja TNF-α:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden antaminen pystyi vähentämään taudin vaikeusastetta ja vaimentamaan suolistotulehdusta DSS-indusoidussa koliitissa. Huomattava osa potilaista menettää kuitenkin vasteensa erityisesti lääkevasta-aineiden tuotannon ja nopeutuneen lääkepoistuman vuoksi, mikä vahvistaa tarvetta uusille terapeuttisille lähestymistavoille, joilla pyritään hallitsemaan paremmin IBD:n etenemistä ja vähentämään haittavaikutuksia.
IFN-γ on proinflammatorinen sytokiini, jota tuottavat monenlaiset solut, mukaan lukien T-apulaissolut (CD4+T-solut) ja sytotoksiset T- solut (CD8+T-solut), luonnonsolujen tappajasolut ja synnynnäiset lymfoidiset solut, jotka edustavat ryhmää 1. IFN-γ:tä tuottavien CD4+T-solujen ja CD8+T-solujen esiintymistiheys oli suurempi IBD-potilailla verrattuna kontrollipotilaisiin . Sekä IFN-γ että TNF-α ovat lisääntyneet IBD-potilaiden limakalvolla, ja ne vaikuttavat synergisesti edistämällä tulehduksen kehittymistä ja ylläpitoa, joka huipentuu esteen rikkoutumiseen . Näiden sytokiinien osoitettiin häiritsevän solujen välisiä liitosproteiineja tulehdusolosuhteissa, mitä ei havaita tulehtumattomilla alueilla epäterveessä kudoksessa . Joitakin näiden häiriöiden taustalla olevia mekanismeja ovat muun muassa epiteelin apoptoosi ja tiiviin liitoksen proteiinien transkription väheneminen . Tämän vuoksi hoitomuodot, joilla pyritään vähentämään tätä sytokiinia, voivat olla hyödyllisiä tulehduksen hallinnassa ja taudin lopputuloksen parantamisessa. Tässä yhteydessä DSS:lle kuuden päivän ajan altistuneiden hiirten lyhytaikainen glukokortikoidihoito pystyi vähentämään IFN-γ:tä tuottavien CD4+-solujen esiintymistiheyttä pernassa ja vähentämään tämän sytokiinin ja IL-1β:n ilmentymistä suolistossa . Tätä IFN-γ:n aktiivisuuden vähenemistä seurasi kliinisen tilan paraneminen ja immuunitasapainon palautuminen . Lisäksi IL-1β:n ja IFN-γ:n kaltaisten tulehdussytokiinien vähenemiseen liittyviä suotuisia vaikutuksia selvitettiin tarkemmin hiiren koliitin mallissa. Tässä tapauksessa koliitti indusoitiin antamalla kolonensisäisesti dinitrobentseenisulfonihappoa (DNBS), ja hiiriä hoidettiin ei-psykotrooppisella kannabinoidilla, joka tunnetaan nimellä kannabigeroli . Vaikka tässä tutkimuksessa ei tutkittu noni-hedelmämehuhoidon vaikutuksia apoptoosiin ja suolen läpäisevyyteen, suoliston arkkitehtuurin paraneminen ja tulehduksellisen infiltraatin väheneminen voivat osittain johtua IFN-γ:n vähenemisestä.
IL-17:ää tuottavat solut ovat osallisina lukuisten tulehdus- ja autoimmuunisairauksien patogeneesissä, ja niiden on osoitettu välittävän tautipatogeneesiä IBD:ssä. Th17-solujen rooli IBD:n patogeneesissä johtui ensisijaisesti mutaatiosta IL-23R-geenissä, joka tunnistettiin IBD-potilailla ja joka säätelee Th17:ään liittyvien sytokiinien tuotantoa . Lamina propria -solujen lisääntynyt IL-17-tuotanto sekä UC:ssa että CD:ssä oli jo osoitettu . Lisäksi Th17-solujen tuottamien sytokiinien, kuten IL-17:n ja IL-21:n, havaittiin säätelevän TNF-α:n, IL-1β:n, IL-6:n ja IL-8:n ilmentymistä ja neutrofiilien rekrytoitumista, mikä voi osaltaan pahentaa IBD:n tilaa. Th17-lymfosyyttien klassisen roolin lisäksi IBD:n patogeneesissä myös ryhmän 3 synnynnäiset imusolut on yhdistetty IL-17:n tuotantoon ja taudin patogeneesiin sekä kokeellisissa malleissa että ihmisillä . Tutkimuksessamme havaittiin vähentyneitä IL-17-pitoisuuksia noni-hedelmämehulla hoidettujen hiirten paksusuolessa, mutta vain, kun käytettiin laimennoksia 1 : 10 ja 1 : 100. Vaikka emme tunnistaneet, liittyikö IL-17:n väheneminen suolistossa enemmän synnynnäiseen vai adaptiiviseen immuniteettiin vai molempiin, emme voi aliarvioida sellaisten hoitomuotojen merkitystä, joilla pyritään tuottamaan näitä sytokiineja tulehduksen estämiseksi paksusuolen tulehduksessa.
Kaiken kaikkiaan tietomme osoittivat, että noni-hedelmämehuhoidolla on tärkeä rooli tulehduksen estämisessä kokeellisen paksusuolen tulehduksen kehittymisen aikana. Yksi keskeisistä näkökohdista, jotka liittyvät hedelmämehun käyttöön terapeuttisena vaihtoehtona, koskee sen immuunijärjestelmää moduloivaa vaikutusta, joka puolestaan vaikuttaa suoliston arkkitehtuurin paranemiseen. Siitä huolimatta on tehtävä lisätutkimuksia, jotta voidaan selvittää molekyylit, jotka ovat tulehdussytokiinien vähenemisen taustalla tässä mallissa.
Kilpailevat intressit
Tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.
Kiitokset
Tutkimusta ovat tukeneet Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ja Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2).