Synonyme

Nicht-veresterte Fettsäuren (NEFA), freie Fettsäuren, ungesättigte Fettsäuren

Physiologie

Nicht veresterte („freie“ oder ungesättigte) Fettsäuren (NEFAs) sind der Hauptbestandteil von Triglyceriden (den Fettspeichern im Körper), die aus drei Fettsäuren bestehen, die an ein Glycerin-Grundgerüst gebunden sind. Bei gesunden Tieren (wenn sie fressen oder sich nicht in einem Zustand des Energiemangels befinden) stammen NEFAs hauptsächlich aus dem Abbau von Triglyceriden, die mit der Nahrung über Chylomikronen aufgenommen werden (Lipoproteinlipase setzt NEFA aus Chylomikronenresten frei). Unter Fastenbedingungen oder bei negativer Energiebilanz ist die Hauptquelle für NEFA jedoch die Hydrolyse der Fettspeicher im Körper.

Die Hydrolyse von gespeicherten Triglyceriden (Fett) im Fettgewebe durch hormonempfindliche Lipase setzt NEFAs und Glycerin frei. Die hormonempfindliche Lipase (die sich im Zytosol der Adipozyten befindet) wird durch verschiedene Hormone stimuliert, darunter Glucagon (das von den α-Zellen in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse als Reaktion auf einen niedrigen Blutzuckerspiegel freigesetzt wird) und Kortikosteroide. Sobald sie aus Fett oder Chylomiren freigesetzt sind, können NEFAs von vielen Geweben, einschließlich Skelettmuskeln und Hepatozyten, als Energiequelle genutzt werden. In den Hepatozyten hängt ihr Verbleib vom Energiebedarf, dem Hormonhaushalt und der Substratverfügbarkeit ab, d. h. sie können zur Energiegewinnung (über den Kreb-Zyklus) verwendet, in Triglyceride umgewandelt und als Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) exportiert oder in der Leber als Triglyceride gespeichert werden (was bei Überschuss zu hepatischer Lipidose führen kann) oder in Ketone umgewandelt werden.

Methodik

Die primäre Methode zur Messung der NEFA-Konzentration im Serum ist eine kolorimetrische enzymatische Methode, die an der Cornell University angewandt wird.

Reaktionstyp

Ausgeblendete Endpunktreaktion. Die Ausblendung verringert die Auswirkungen der Hämolyse auf die NEFA-Konzentrationen.

Verfahren der Cornell University

Im ersten Schritt dieser dreistufigen Reaktion katalysiert die Acyl-CoA-Synthetase (ACS) die Acylierung von NEFAs zu (Coenzym A) CoA, was zur Bildung von Acyl-CoA führt. Bei der Oxidation von Acyl-CoA durch die katalytische Wirkung der Acyl-CoA-Oxidase (ACOD) entsteht dann Wasserstoffperoxid. Schließlich ermöglicht Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Peroxidase (POD) die oxidative Kondensation von 4-Aminoantipyrin mit 3-Methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-anilin (MEHA) zur Bildung eines blau-violetten Endprodukts mit einem Absorptionsmaximum bei 550 nm. Die NEFA-Konzentration ist direkt proportional zu der gemessenen optischen Dichte des Farbstoffprodukts.

Reaktionen sind unten dargestellt:

NEFA+ ATP + CoA Acyl-CoA Synthesase > Acyl-CoA + AMP + Pyrophosphat

Acyl-CoA + O2 + Acyl-CoA Oxidase > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-Aminoantipyrin + MEHA-Peroxidase > blau-violetter Komplex+ 3H2O

Maßeinheiten

Die Konzentration von NEFAs wird in mEq/L (konventionelle Einheiten) oder mmol/L (SI-Einheiten) gemessen. Die Einheitenumrechnung ergibt sich aus der folgenden Formel:

mEq/L x 1= mmol/L

Probenüberlegungen

Probentyp

Serum oder EDTA-Plasma. Das Serum/Plasma sollte so schnell wie möglich nach der Entnahme von den Zellen getrennt werden und in ein separates Röhrchen gegeben werden. Ebenso werden Corvac-Röhrchen (Serum-Separator) nicht empfohlen, da die Werte in diesen Röhrchen im Vergleich zu nicht-antikoagulierenden Röhrchen (roter Deckel) geringfügig (aber signifikant) höher sind.

Antikoagulierend

EDTA. Die Werte sind weniger stabil in Heparin, das auch höhere Ausgangskonzentrationen als EDTA oder Serum liefert, und die NEFA-Werte steigen mit der Lagerung an (Stokol und Nydam 2005).

Stabilität

Stabil in Rinderserum oder EDTA-Plasma bei 4°C für 72 Stunden. Stabil in Rinderserum eingefroren für 1 Monat (-70°C). Die Werte steigen innerhalb von 24-48 Stunden nach Lagerung bei 24°C in Serum oder EDTA-Plasma an. NEFA-Konzentrationen steigen in Heparin nach der Lagerung schnell an. (Stokol und Nydam 2005).

Empfehlungen für die Probenentnahme bei Übergangsmilchkühen

• Gerinnungshemmer: Rote Spitze (Serum) oder violette Spitze (EDTA). Heparin- (grüner Deckel) und Corvac-Röhrchen (Serumseparator) sind zu vermeiden.
• Handhabung: So schnell wie möglich von den Zellen trennen, kühl aufbewahren, um falsche Veränderungen der Ergebnisse zu minimieren (NEFAs sind besonders instabil), so schnell wie möglich an das Labor senden.
• Zeitpunkt der Probenahme: Kühe beproben, wenn sie in die Fressboxen kommen (siehe unten).
  • Präpartale NEFAs: Proben von Kühen 2-14 Tage vor dem Kalben nehmen.
  • Postpartale NEFAs: Sammeln Sie Proben von Kühen, die 3-14 Tage in der Milch sind. Die Messung sowohl der postpartalen NEFAs als auch des BHB wird in einem Übergangskuh-Energieprofil zur Bewertung des Energiestatus bei laktierenden Kühen im Labor für klinische Pathologie der Cornell University durchgeführt.
• Anzahl der Kühe: Für die Untersuchung auf Herdenebene sollten mindestens 12 Tiere pro Herde beprobt werden (Testbeschreibung im Abschnitt „Testauswertung“ unten). Dies kann eine Mischung aus Färsen und >2 paritätischen Kühen sein.
• Pooling-Proben: Es wird NICHT empfohlen, einzelne Proben von Kühen zusammenzufassen, um den Energiestatus einer Herde zu beurteilen. Studien an der Cornell University haben gezeigt, dass die Ergebnisse aus Sammelproben weniger empfindlich sind als die von Einzelkühen (mindestens 12 Tiere pro Herde), wenn NEFA vor oder nach der Geburt zum Nachweis einer übermäßigen negativen Energiebilanz bei Übergangsmilchkühen verwendet wird.

Interferenzen

• Lipämie, Ikterus: Unbekannte Wirkung (selten bei Rindern).
• Hämolyse: Je nach der vom Labor verwendeten Methode führt die Hämolyse entweder zu einer Verringerung oder zu einer Erhöhung der NEFA-Werte. Bei der an der Cornell University angewandten Blindmethode führt eine schwere Hämolyse (Hämolyse-Index > 800 Einheiten) zu einem leichten Rückgang der NEFA-Konzentrationen im Rinderblut. Lipämische und ikterische Störfaktoren beeinflussen die NEFA-Konzentration bei den von der Cornell University verwendeten Methoden nicht wesentlich.
• Erregung/Belastung/Stress: Diese Bedingungen, die eine Katecholamin- oder ACTH-Freisetzung auslösen, erhöhen die NEFA-Konzentrationen durch Stimulierung der Lipolyse durch hormonsensitive Lipase. Diese Bedingungen sollten bei der Entnahme von Blutproben für die NEFA-Messung möglichst vermieden werden.
• Zeitpunkt der Probenentnahme: Die NEFA-Werte sind wahrscheinlich höher bei Kühen, die täglich gefüttert werden (sie haben wahrscheinlich eine negative Energiebilanz), als bei Kühen, die gerade gefüttert wurden (die Lipolyse wird bei letzteren Kühen gehemmt). Eine Entnahme kurz vor der Fütterung wird empfohlen.

Testauswertung

NEFA-Tests werden meist bei Milchkühen durchgeführt, um festzustellen, ob die Herde eine übermäßige negative Energiebilanz aufweist. Der Test wird eher auf Herdenebene als auf Einzeltierebene angewandt, und die Ergebnisse werden im Hinblick auf eine Cut-off-Konzentration oder den Prozentsatz der Tiere mit Werten über dem Cut-off gegenüber Werten über der oberen Referenzgrenze interpretiert. Die NEFA-Messung kann bei jeder anderen Tierart als Marker für eine übermäßige negative Energiebilanz durchgeführt werden. Am häufigsten wird dies bei Kameliden (die unter diesen Umständen eine hepatische Lipidose entwickeln), anderen Wiederkäuern (z. B. Ziegen, Schafen) zur Bestimmung des Ketoserisikos und bei Pferden (mit equinem metabolischem Syndrom) durchgeführt. Beachten Sie, dass Konzentrationen unterhalb der Referenzgrenze nicht klinisch relevant sind.

Erhöhte Konzentrationen

• Physiologisch: Bewegung induziert die Freisetzung von Katecholaminen und ACTH, was die hydrolytische Aktivität der hormonsensitiven Lipase stimuliert, um die Fettmobilisierung zu fördern, um den überschüssigen Energiebedarf zu decken. Dieser Prozess erhöht die Konzentration von NEFAs im Blut.
• Rassenunterschiede: Mehrere Studien haben gezeigt, dass die NEFAs bei Jersey-Kühen nach der Geburt niedriger sind als bei Holstein-Kühen, so dass die für Holstein-Kühe entwickelten Richtlinien (siehe unten) möglicherweise nicht auf Jerseys anwendbar sind (Rastani et al. 2001, French 2006, Guretsky et al. 2006, Brown et al. 2012).
• Negative Energiebilanz bei Milchkühen: Milchkühe in der periparturalen (Übergangs-)Periode befinden sich aufgrund des hohen Energiebedarfs des sich entwickelnden Fötus und der Milchproduktion (insbesondere mit dem Schwerpunkt auf der Selektion auf hohe Milchleistung) immer in einem Zustand negativer Energiebilanz. Dieser Zustand der negativen Energiebilanz kann jedoch übermäßig sein, und die betroffenen Kühe sind in der frühen postpartalen Periode dem Risiko von Magen-Darm- (verlagerter Labmagen), Stoffwechsel- (klinische Ketose) und Infektionskrankheiten (z. B. Metritis) ausgesetzt. Daher werden Milchviehherden häufig auf eine übermäßige negative Energiebilanz überwacht, indem NEFAs getestet werden, entweder allein bei Kühen vor oder nach der Geburt oder als Bestandteil eines Stoffwechselprofils bei Kühen nach der Geburt. Die Ergebnisse dieser Tests können auf der Ebene der einzelnen Kuh (d. h. ein NEFA-Wert über einem bestimmten Grenzwert weist auf eine übermäßige negative Energiebilanz hin) oder auf der Ebene der Herde (d. h. ein Anteil der getesteten Kühe hat NEFA-Werte über einem bestimmten Grenzwert) interpretiert werden. Die Feststellung einer überschüssigen negativen Energiebilanz bei einzelnen Kühen (und, was noch wichtiger ist, in der Herde) deutet auf die Notwendigkeit von Änderungen in der Fütterung (z. B. Vergrößerung der Liegefläche, Erhöhung der Energiedichte der Ration) und im Management der Übergangskühe hin, um den Energiebedarf und die Belastung der Übergangskühe zu verringern. Die folgenden Interpretationsrichtlinien basieren auf Studien der Cornell University und gelten für Proben, die von „gefährdeten“ TMR-gefütterten Holstein-Kühen zwischen 2-14 Tagen vor dem Abkalben (präpartale NEFAs) oder 3-14 Tagen nach dem Abkalben (postpartale NEFAs) entnommen wurden. Wir empfehlen die Entnahme von Proben von mindestens 12 „Risikokühen“, wenn mit TMR gefütterte Herden auf subklinische Ketose untersucht werden (Ospina et al. 2013).
  • Tests auf Kuhniveau
    • Präpartum NEFAs: Bei Holstein-Milchkühen (gefüttert mit TMR) mit NEFA-Werten > 0,30 mEq/L, wenn sie 2-14 Tage vor dem Abkalben getestet werden, gibt es ein erhöhtes Auftreten von Krankheiten nach dem Abkalben (verlagerter Labmagen, Metritis/retinierte Plazenta und klinische Ketose), eine verringerte Milchleistung und eine verringerte Reproduktionsleistung in den ersten 30 Tagen in der Milch.
    • Postpartale NEFAs: Bei Holstein-Milchkühen (mit TMR gefüttert) mit NEFA-Werten > 0,60-0,70 mEq/L, wenn sie 3-14 Tage nach dem Abkalben getestet werden, treten nach dem Abkalben häufiger Krankheiten auf (verlagerter Labmagen, Metritis/retinierte Plazenta und klinische Ketose), die Milchleistung sinkt und die Reproduktionsleistung nimmt in den ersten 30 Tagen ab. In den Cornell-Studien waren die NEFA-Werte nach dem Abkalben sogar ein besserer Prädiktor als die β-Hydroxybutyrat-Konzentration nach dem Abkalben oder die NEFA-Werte vor dem Abkalben.
  • Tests auf Herdenebene
    • Präpartale NEFA-Werte: Auf Herdenebene besteht ein signifikant erhöhtes Risiko für Stoffwechsel- und Infektionskrankheiten nach dem Abkalben, eine verringerte Milchproduktion oder eine verringerte Reproduktionsleistung, wenn >15% der getesteten Kühe vor dem Abkalben NEFA-Werte > 0,30 mEq/L aufweisen. Beachten Sie, dass, wie oben erwähnt, die Zusammenführung von Proben einzelner Kühe für Tests auf Herdenebene nicht empfohlen wird.
    • Postpartale NEFAs: Auf Herdenebene besteht ein signifikant erhöhtes Risiko für Stoffwechsel- und Infektionskrankheiten nach dem Abkalben, eine verringerte Milchproduktion oder eine verringerte Reproduktionsleistung, wenn >15-20% der getesteten Kühe nach dem Abkalben NEFA-Werte > 0,70 mEq/L aufweisen. Beachten Sie, dass, wie oben erwähnt, die Zusammenführung von Proben einzelner Kühe für Tests auf Herdenebene nicht empfohlen wird.
• Hepatische Lipidose bei Milchvieh: In einer Studie hatte ein NEFA:Cholesterin-Verhältnis >0,2 (SI-Einheiten) ein Odds Ratio von 9,9 für ein Tier mit hepatischer Lipidose (definiert als >10% Lipidgehalt in der Leber), wobei dieser Grenzwert empfindlicher (63% mit 85% Spezifität) war als BHB, NEFA allein oder AST-Aktivität (>120 U/L) für die Diagnose von hepatischer Lipidose (basierend auf der Fläche unter der Empfängerbetriebskennlinie oder AUC). Bei den Tieren in dieser Studie wurden jedoch Blutmessungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Laktation durchgeführt (Mostafavi et al 2013).
• Negative Energiebilanz bei Kleintieren: Diese tritt vor allem bei Diabetes mellitus auf. Im Zustand des Insulinmangels oder der Insulinresistenz geht die Hemmung der hormonsensitiven Lipase verloren. Ein regulatorisches Ungleichgewicht der hormonsensitiven Lipaseaktivität führt zu einer verstärkten Fettmobilisierung aus dem Fettgewebe in das Lebergewebe und damit zu einer erhöhten Konzentration von NEFAs.
• Negative Energiebilanz bei Kameliden: Kranke, gestresste Kameliden, insbesondere trächtige Weibchen, sind dem Risiko ausgesetzt, eine hepatische Lipidose zu entwickeln. Durch Messung der NEFA kann festgestellt werden, ob sie eine negative Energiebilanz aufweisen. Bei Kameliden mit einem NEFA-Wert von > 0,8 mEq/L (Tornquist et al. 2001) besteht ein erhöhtes Risiko für Lipidose. Magersüchtige Kameliden haben häufig einen erhöhten NEFA-Wert, der jedoch unter diesem Wert liegt, und entwickeln möglicherweise keine Lipidose.