Abstract

Morinda citrifolia L. (Noni) hat sich bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen bewährt. Die Daten über seine Rolle bei der Behandlung von Darmentzündungen müssen jedoch noch geklärt werden. In der aktuellen Studie untersuchten wir die Auswirkungen von Noni-Fruchtsaft (NFJ) bei der Behandlung von C57BL/6-Mäusen, die 9 Tage lang kontinuierlich Dextransulfat-Natrium (DSS) ausgesetzt waren. Der Verzehr von NFJ hatte keinen Einfluss auf die Verringerung der klinischen Anzeichen der Krankheit oder auf den Gewichtsverlust. Bei Verwendung einer Verdünnung von 1:10 blieb die Darmarchitektur der Mäuse jedoch erhalten, begleitet von einer Verringerung des entzündlichen Infiltrats. Unabhängig von der NFJ-Konzentration wurde im Darm auch ein Rückgang der Aktivität der Myeloperoxidase und der wichtigsten Entzündungszytokine TNF-α und IFN-γ beobachtet. Darüber hinaus wurde bei einer Verdünnung von NFJ im Verhältnis 1:10 und 1:100 eine Verringerung der Produktion von Stickstoffmonoxid und IL-17 in Darmhomogenaten festgestellt. Insgesamt war die Behandlung mit NFJ bei verschiedenen Aspekten, die mit dem Fortschreiten und der Verschlimmerung der Krankheit in Zusammenhang stehen, wirksam. Diese Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass die Noni-Frucht eine wichtige Quelle für entzündungshemmende Moleküle ist, die ein großes Potenzial haben, das Fortschreiten von Entzündungskrankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen zu hemmen.

1. Einleitung

Die potenziellen entzündungshemmenden Aktivitäten verschiedener Naturstoffe bei der Herunterregulierung von Schlüsselfaktoren bei der Entstehung von Entzündungen wurden in verschiedenen Szenarien erforscht, einschließlich der Modulation von Zytokinen, Transkriptionsfaktoren, Enzymen und der Produktion von Protein- und Nichtprotein-Entzündungsmediatoren. Zu diesen Aktivitäten gehören die Modulation von Zytokinen (z. B. IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 und IL-12), Transkriptionsfaktoren, Enzymen (z. B. Myeloperoxidase-MPO und Cyclooxygenase COX-1 und COX-2) und auch die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO). Aufgrund ihrer Bedeutung für die Kontrolle von Entzündungen wurden Therapien, die auf diese Moleküle abzielen, als mögliche Hilfsmittel für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Entzündungskrankheiten wie rheumatoider Arthritis, Dermatitis und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) vorgeschlagen. Bei den IBD handelt es sich um chronische entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts, die sich klinisch als eine der beiden Erkrankungen Morbus Crohn (CD) oder Colitis ulcerosa (UC) äußern. Diese Pathologien sind von besonderem Interesse, da sie weltweit Millionen von Menschen betreffen und die derzeitigen Therapien immer noch nicht vollständig wirksam sind, um das Fortschreiten der Krankheit zu kontrollieren oder das Auftreten von Nebenwirkungen zu verhindern.

Morinda citrifolia L. (Noni) gehört zur Familie der Rubiaceae und ist eine Quelle natürlicher Moleküle, die von den Polynesiern seit mehr als 2.000 Jahren als Heilpflanze verwendet wurde. Bisher wurden mehrere bioaktive Verbindungen aus Noni-Früchten isoliert, darunter Fettsäuren, Flavonoide, Polysaccharide und Sterole. Das entzündungshemmende Potenzial von Noni-Fruchtbestandteilen wurde in einem experimentellen Modell einer Helicobacter pylori-Infektion nachgewiesen, bei dem Ethanol- und Ethylacetat-Extrakte verwendet wurden. Diese Extrakte waren in der Lage, sowohl die Chemotaxis der Neutrophilen als auch die Produktion von induzierbarem Stickstoffmonoxid (iNOS) und COX-2 zu verringern. Dementsprechend zeigten C57BL/6-Mäuse, die 60 Tage lang oral mit Noni-Fruchtsaft in einer Dosierung von 500 mg kg-1 pro Tag behandelt wurden, eine Verringerung des entzündlichen Infiltrats und der Zytokinexpression für IL-12, TNF-α, TGF-β und IL-10 in den mit Leishmania amazonensis infizierten Fußballen. Es ist wichtig zu erwähnen, dass Zytokine wie IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 und IL-23 mit der Entwicklung und Verschlimmerung von IBD in Verbindung gebracht werden, weshalb sie bei der Behandlung dieser entzündlichen Erkrankung anders behandelt werden. Darüber hinaus wurde das entzündungshemmende Potenzial des Extrakts aus den Blättern von Morinda citrifolia durch die Senkung der TNF-α-, IL-1β- und NO-Spiegel in Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) nachgewiesen. Obwohl die Rolle der Nonifrucht-Verbindungen bei der Kontrolle von Entzündungsakteuren von besonderer Bedeutung ist, sind ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von Darmentzündungen noch wenig erforscht.

Daher wurde in dieser Studie die Wirkung von Noni-Fruchtsaft auf das Zusammenspiel von Zytokinen und die Darmarchitektur in einem Mausmodell der Dextransulfat-Natrium-induzierten Kolitis als zugrundeliegende Mechanismen für seine immunmodulatorische Aktivität gezeigt.

2. Materialien und Methoden

2.1. Sammlung und botanische Identifizierung der Pflanze

Die in dieser Studie verwendeten Früchte stammen aus einer Monokultur von 150 Noni-Pflanzen auf der Fazenda Boa Vontade, einer Farm in der Gemeinde Araguari, Triângulo Mineiro/MG, Brasilien, bei den Koordinaten 18°43′47.23′′S, 48°6′49.50′′O (Daten von Google Earth, 2013). Alle Exemplare wurden nach konventionellen Herborisierungsverfahren präpariert und im Herbarium der Bundesuniversität von Uberlândia (HUFU Herbarium) unter der Registrierungsnummer HUFU-67210 als Morinda citrifolia L. (Rubiaceae) hinterlegt.

2.2. Saftextraktionsverfahren

Morinda citrifolia (Noni)-Saft wurde im Labor für Pharmakognosie der Universität Uberaba in Uberaba, Minas Gerais, Brasilien, hergestellt. Die Früchte von M. citrifolia wurden von Hand und nach dem Zufallsprinzip von 150 Pflanzen gepflückt, in ozonisiertem Wasser gewaschen und 3-5 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Die Früchte wurden mechanisch mit einem Fruchtentschäler entschält, und nach der Entfernung der Samen wurde das resultierende Fruchtfleisch bei 4.000 Umdrehungen pro Minute unter Kühlung zentrifugiert, bis der Überstand klar war, und es wurde dann als 100% (v/v) Saft betrachtet und bei -70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

2.3. Tierstudien

Männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und mit einem Gewicht von 20-25 g wurden unter spezifischen pathogenfreien und standardkontrollierten Umweltbedingungen bei konstanter Temperatur (25°C) und einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser in der Tierhaltungseinrichtung der Bundesuniversität Triângulo Mineiro (UFTM), Brasilien, gehalten. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der UFTM nach Protokoll 275 durchgeführt. Die Experimente wurden mit 8 Mäusen/Gruppen wie folgt durchgeführt: Kochsalzlösung, gesunde Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden; DSS 2,5%, Mäuse, die Dextransulfat-Natrium (DSS) ausgesetzt waren; DSS 2,5% + reine Noni, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit reinem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden; DSS 2.5% + noni 1 : 10, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit einer 1 : 10-Verdünnung von Noni-Fruchtsaft behandelt wurden; und DSS 2,5% + noni 1 : 100, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit einer 1 : 100-Verdünnung von Noni-Fruchtsaft behandelt wurden. Ein Volumen von 100 μl pro Maus wurde an 9 aufeinanderfolgenden Tagen oral verabreicht.

2.4. DSS-induzierte Colitis und klinische Bewertung

Die Colitis wurde durch 2,5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, Frankreich, Molekulargewicht: 36.000-50.000 kDa) induziert, das dem Trinkwasser an 9 aufeinanderfolgenden Tagen zur Probenentnahme kontinuierlich zugesetzt wurde. Zusätzlich zur Aufzeichnung der täglichen Futter- und Wasseraufnahme wurden auch die Veränderungen des Körpergewichts und die klinischen Krankheitsanzeichen täglich bewertet, um für jede Maus einen klinischen Krankheitswert zu erhalten. Jedes Zeichen, das die Tiere zeigten, entsprach einem Punkt, und die Summe der Punkte für jede Maus definierte einen klinischen Score. Die klinischen Scores wurden wie zuvor beschrieben ermittelt.

2.5. Euthanasie und Probenentnahme

Die Mäuse wurden an Tag 9 euthanasiert, und der Dickdarm wurde für weitere Analysen entfernt. Die Kolonproben wurden in kleinere Abschnitte geteilt, die für die Paraffineinbettung in PBS/10% Formaldehyd getaucht oder sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden, um die Aktivität der Myeloperoxidase (MPO) oder des Stickstoffoxids (NO) mittels enzymatischer Assays zu quantifizieren. Außerdem wurde von jeder Maus ein Darmabschnitt in einer Lösung mit Proteaseinhibitoren (Complete®, Roche Pharmaceuticals, Mannheim, Deutschland) für die Quantifizierung von Zytokinen mittels Enzymimmunoassay (ELISA) entnommen.

2.6. Myeloperoxidase (MPO) und Stickstoffmonoxid (NO)

Kurz gesagt, wurden für den MPO-Test die Schnitte homogenisiert und die Erythrozyten lysiert. Das nach der Zentrifugation erhaltene Pellet wurde resuspendiert, gefolgt von drei Gefrier- und Auftauzyklen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in 96-Well-Platten gegeben und mit Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat (BD OptEIA™, San Diego, CA) bei 37 °C nachgewiesen. Die Reaktion wurde gestoppt und die Ergebnisse wurden in einem Spektralphotometer bei 450 nm gemessen. Die MPO-Aktivität wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse wurden auf das Trockengewicht der einzelnen Darmabschnitte normiert und als optische Dichte pro Gramm Gewebe (nm/g Gewebe) ausgedrückt.

Für die NO-Messung wurde das in Darmhomogenaten akkumulierte Nitrit als Indikator für die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. Anschließend wurden 100 μl Gewebehomogenat mit 100 μl Griess-Reagenz gemischt, das sich aus gleichen Volumina von 1 % (w/v) Sulfanilamid in 5 % (v/v) Phosphorsäure und 0,1 % (w/v) Naphthyl-Ethylendiamin-HCl zusammensetzt, und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption wurde bei 540 nm in einem 96-Well-Plattenlesegerät (Perkin Elmer Cetus, CA, USA) gemessen. Die Nitritmenge in den Proben wurde durch lineare Regressionsanalyse der Absorption der seriellen Verdünnung der Natriumnitrit-Standardkurve berechnet. Die Ergebnisse wurden auf das Trockengewicht der einzelnen Darmabschnitte normiert und als Pikogramm pro Milliliter pro Gramm Gewebe (pg/ml/g) ausgedrückt.

2.7. Quantifizierung der Zytokine mittels ELISA

Die Zytokine IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4 und IL-23 wurden in den Gewebehomogenaten mittels ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) quantifiziert. Die Ergebnisse wurden auf das Trockengewicht der einzelnen Darmabschnitte normiert und als Nanogramm pro Milliliter pro Gramm Gewebe (ng/mL/g Gewebe) ausgedrückt.

2.8. Histologie und histopathologische Analyse

Um die mikroskopischen Schäden zu beurteilen, wurden die Darmabschnitte in Längsrichtung geschnitten, mit PBS gewaschen, 24 Stunden lang in 10% gepuffertem Formalin fixiert und dann für die Paraffineinbettung und den anschließenden Mikrotomschnitt bearbeitet. Es wurden Gewebeschnitte (5 μm) angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Für die histopathologische Analyse wurden die Mukosa, Submukosa, Muskelschichten und Serosa untersucht. Diese Darmabschnitte wurden auch auf das Vorhandensein von Ödemen, entzündlichen Infiltraten und Epithelanomalien untersucht.

Die Bilder wurden mit einer digitalen Videokamera (Evolution MP 5.0 color Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) mit einem 10x-Objektiv und einem Lichtmikroskop (Nikon Eclipse 50i, Melville, NY, USA) aufgenommen. Die Morphometrie wurde mit Image-Pro Insight (Media Cybernetics) durchgeführt. Das Entzündungsinfiltrat wurde auf der Grundlage der geschädigten Fläche mit Entzündungsinfiltrat geteilt durch die Gesamtfläche des im aufgenommenen Bild sichtbaren Gewebes gemessen und in Prozent (%) ausgedrückt. Ein geschulter Pathologe, der gegenüber der Behandlung verblindet war, führte die histopathologische Analyse durch.

2.9. Datenanalyse und Statistik

Normalverteilung und homogene Varianz wurden für alle Variablen getestet. Wenn die Verteilung als normal und die Varianz als homogen angesehen wurde, wurden parametrische Tests verwendet: ungepaarte Student’s-Tests oder einseitige ANOVA, gefolgt von Tukey’s Post-Hoc-Test. Im Falle einer nicht-gaußschen Verteilung der Daten wurden die folgenden nichtparametrischen Tests verwendet: Mann-Whitney-Test oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Post-hoc-Test. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die beobachteten Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn (5%). Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism, Version 5.0 (La Jolla, CA, USA) durchgeführt.

3. Ergebnisse

3.1. Behandlung mit Noni-Fruchtsaft und Krankheitsverlauf

Zunächst wurde untersucht, ob Noni-Fruchtsaft in der Lage war, den Gewichtsverlust und den Verlauf der DSS-induzierten Kolitis zu verhindern. Die Mäuse wurden 9 Tage lang DSS ausgesetzt und dann mit dem Fruchtsaft behandelt, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Noni-Fruchtsaftgruppe schien den Gewichtsverlust im Vergleich zu den Kontrollmäusen (DSS 2,5 %) nicht zu verringern (Abbildung 1(a)). Darüber hinaus gab es unabhängig von der verwendeten Konzentration keine Auswirkungen auf die Präsentation klinischer Krankheitszeichen bei den mit Noni-Fruchtsaft behandelten Mäusen im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen (Abbildung 1(b)).

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Abbildung 1

Behandlung mit Noni-Fruchtsaft und Krankheitsverlauf. C57BL/6-Mäuse wurden Dextransulfat-Natrium (DSS) 2,5% ausgesetzt und täglich mit Nonifruchtsaft behandelt. Am 9. Tag wurden die Mäuse eingeschläfert, um Darmschnitte zu erhalten. (a) Prozentsatz der Gewichtsveränderung. (b) Klinischer Krankheitswert. Kochsalzlösung, gesunde Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden; DSS 2,5%, Mäuse, die DSS ausgesetzt waren; DSS 2,5% + reine Noni, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit reinem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden; DSS 2.5% + noni 1 : 10, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit einer 1 : 10 Verdünnung des Fruchtsaftes behandelt wurden; und DSS 2,5% + noni 1 : 100, Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit einer 1 : 100 Verdünnung des Fruchtsaftes behandelt wurden.

3.2. Der Konsum von Noni-Fruchtsaft hemmt die Entzündung und bewahrt die Darmarchitektur in einer dosisabhängigen Weise

Da nach der Behandlung mit Noni-Fruchtsaft keine makroskopischen Effekte beobachtet wurden, wollten wir feststellen, ob der Konsum von Fruchtsaft irgendeinen mikroskopischen Effekt auf die Darmarchitektur hat. Es wurde dosisabhängig beobachtet, dass die mit Noni-Fruchtsaft behandelte Gruppe ihre Darmarchitektur erhalten konnte. Bei den gesunden Mäusen (Abbildung 2(a)) blieb die Epitheloberfläche erhalten, die Krypten waren geradlinig und bestanden aus der üblichen Anzahl von Becherzellen. In der Lamina propria war das übliche mononukleäre Infiltrat zu sehen. Die Submukosa, die Muskulatur und die serösen Muskeln wiesen eine normale Architektur auf. Mäuse, die DSS ausgesetzt waren, wiesen Erosionen an der Oberfläche des Darmepithels und das Fehlen von Krypten auf (Tabelle 1). Die Lamina propria wies ein mäßiges Ödem und eine Infiltration mit mononukleären Zellen auf (Abbildung 2(b), Pfeilspitze), die Submukosa hatte ein mäßiges mononukleäres Infiltrat und ein starkes Ödem (Abbildung 2(b), Pfeil), und die Muskelschicht war leicht verdickt, was auf eine Colitis-Aktivität hindeutet. Bei Mäusen, die DSS ausgesetzt waren und mit reinem Noni-Saft behandelt wurden, waren Unregelmäßigkeiten in der Krypta selten und leicht (Tabelle 1), und die Lamina propria wies ein mäßiges Ödem (Abbildung 2(c), Pfeil) und ein mononukleäres Infiltrat (Abbildung 2(c), Pfeilspitze) auf; in der submukösen Schicht wurden jedoch nur ein leichtes mononukleäres Infiltrat und ein mäßiges Ödem festgestellt, und die Muskelschicht war leicht verdickt. Bei den Mäusen, die mit 1:10 verdünntem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden, blieben die Krypten dagegen unregelmäßig (Abbildung 2(d), Sternchen), die Lamina propria wies sowohl ein mäßiges Ödem (Abbildung 2(d), Pfeil) als auch ein mononukleäres Infiltrat auf (Abbildung 2(d), Pfeilspitze), und die Submukosa wies nur ein leichtes mononukleäres Infiltrat und ein mäßiges Ödem auf (Tabelle 1). Bei den Mäusen, die mit 1:100 verdünntem Nonifruchtsaft behandelt wurden, waren die Krypten unregelmäßig und atrophisch (Abbildung 2(e), Sternchen), die Lamina propria wies ein mäßiges Ödem und ein mononukleäres Infiltrat auf, und die Submukosa zeigte ein leichtes mononukleäres Infiltrat und ein mäßiges Ödem (Tabelle 1). Im Allgemeinen war die Architektur der Darmkrypten bei den mit Noni-Fruchtsaft behandelten Mäusen erhalten, und sie war bei Mäusen, die Noni-Saft in einer Verdünnung von 1 : 10 und 1 : 100 erhielten, im Vergleich zu den mit reinem Noni oder DSS behandelten Mäusen besser erhalten.

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Abbildung 2

Noni-Fruchtsaftkonsum bewahrt die Darmarchitektur in einer dosisabhängigendependent manner. C57BL/6-Mäuse wurden Dextransulfat-Natrium (DSS) 2,5% ausgesetzt und täglich mit Nonifruchtsaft behandelt. Der Dickdarm wurde an Tag 9 für die histopathologische Analyse entnommen. (a) Gesunde Mäuse ohne Kolitis; (b) Mäuse, die DSS ausgesetzt waren: Lamina propria mit mäßigem Ödem und mononukleärer Zellinfiltration (Pfeilspitze), Submukosa mit mäßigem mononukleärem Infiltrat und starkem Ödem (Pfeil); (c) Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit reinem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden: Lamina propria mit mäßigem Ödem (Pfeil) und mononukleärem Infiltrat (Pfeilspitze); (d) Mäuse, die DSS ausgesetzt waren und mit Nonifruchtsaft, verdünnt 1 : 10: Krypten mit erhaltenen Unregelmäßigkeiten (Sternchen); Lamina propria mit mäßigem Ödem (Pfeil) und mononukleärem Infiltrat (Pfeilspitze); (e) Mäuse, die DSS ausgesetzt und mit 1 : 100 verdünntem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden: regelmäßige und atrophische Krypten (Sternchen); Lamina propria mit mäßigem Ödem (Pfeil) und mononukleärem Infiltrat (Pfeilspitze).

Die NO-Produktion war bei den Mäusen, die mit 1 : 10 und 1 : 100 verdünntem Noni-Fruchtsaft behandelt wurden, im Vergleich zu denen, die reines Noni oder DSS erhielten, reduziert (Abbildung 3(a)). Darüber hinaus wiesen die mit Noni-Fruchtsaft behandelten Mäuse unabhängig von der verwendeten Konzentration eine geringere MPO-Aktivität auf (Abbildung 3(b)) als die DSS-exponierten Mäuse. Obwohl Gewichtsverlust und Krankheitsverlauf durch den Noni-Fruchtkonsum nicht beeinflusst wurden, waren die verbesserte Darmarchitektur und die verringerte Aktivität der für Entzündungen verantwortlichen Enzyme dosisabhängig mit dem Fruchtsaftkonsum verbunden.

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Abbildung 3

Noni-Fruchtsaftkonsum hemmt Entzündungen durch Reduzierung der Stickoxid- und Myeloperoxidase-Aktivitäten. C57BL/6-Mäuse wurden Dextransulfat-Natrium (DSS) 2,5% ausgesetzt und täglich mit Nonifruchtsaft behandelt. Am 9. Tag wurden die Mäuse eingeschläfert, um Darmschnitte zu erhalten. Quantifizierung der intestinalen Produktion von Stickstoffmonoxid (a) und der Aktivität der Myeloperoxidase (MPO), ausgedrückt als Pikogramm pro Milliliter pro Gramm Gewebe (pg/ml/g) bzw. als optische Dichte pro Gramm Gewebe (nm/g Gewebe). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. .

3.3. Noni-Fruchtsaftkonsum reduziert wichtige entzündliche Zytokine im Darm in einer dosisabhängigen Weise

Schließlich wollten wir untersuchen, ob die Verbesserung der Darmarchitektur auch mit der Modulation wichtiger Zytokine verbunden sein könnte, die mit der Verschlechterung/Schutz der Krankheit in Verbindung stehen. Mäuse, die mit Noni-Fruchtsaft behandelt wurden, zeigten unabhängig von der verwendeten Konzentration eine verringerte Produktion der Entzündungszytokine TNF-α und IFN-γ (Abbildungen 4(a) und 4(c)). Eine Verringerung von IL-17, einem weiteren Schlüsselzytokin, das mit der Verschlimmerung der Krankheit in Verbindung gebracht wird, wurde nur bei Mäusen beobachtet, die mit Verdünnungen von 1 : 10 und 1 : 100 behandelt wurden (Abbildung 4(e)). Es gab jedoch keine Unterschiede in der Produktion von IL-12 (Abbildung 4(b)), IL-4 (Abbildung 4(d)), IL-23 (Abbildung 4(f)) und IL-10 (Abbildung 4(g)). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine verbesserte Darmarchitektur auch mit einer lokalen Verringerung wichtiger Entzündungszytokine verbunden sein könnte.

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Abbildung 4

Noni-Fruchtsaftkonsum reduziert wichtige entzündliche Zytokine im Darm in einer dosis-dependent manner. C57BL/6-Mäuse wurden Dextransulfat-Natrium (DSS) 2,5% ausgesetzt und täglich mit Nonifruchtsaft behandelt. Der Enzymimmunoassay (ELISA) wurde in Darmhomogenaten durchgeführt. (a) TNF-α, (b) IL-12, (c) IFN-γ, (d) IL-17, (e) IL-23, (f) IL-4, und (g) IL-10. Die Ergebnisse wurden als Nanogramm Zytokin pro Milliliter pro Gramm Gewebe (ng/ml/g Gewebe) ausgedrückt, normiert auf das Gewebetrockengewicht. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt.

4. Diskussion

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass Noni-Fruchtsaft wichtige entzündliche Zytokine, die an der Entwicklung von Darmentzündungen beteiligt sind, reduzieren kann. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fruchtsaft auch die Darmarchitektur verbessern kann, vor allem wenn die Verdünnung 1:10 verwendet wurde. Allerdings wurden zumindest scheinbar keine Auswirkungen auf die klinischen Krankheitszeichen festgestellt.

Die positiven Eigenschaften der Behandlung mit Noni-Fruchtsaft bei der Kontrolle der Kolitis wurden teilweise auf eine Verbesserung der Darmarchitektur zusammen mit einer Verringerung des entzündlichen Infiltrats zurückgeführt. Diesem Szenario folgte eine Verringerung der Aktivität von NO (nur bei einer Verdünnung von Noni-Fruchtsaft im Verhältnis 1:10 und 1:100) und MPO (in jeder Konzentration). NO ist ein starker proinflammatorischer Mediator, der hauptsächlich von der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) nach Stimulation mit bakteriellen Endotoxinen und entzündlichen Zytokinen wie IL-1β, TNF-α und IFN-γ in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Makrophagen, Neutrophilen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen, gebildet wird. Es wird berichtet, dass eine Überexpression von iNOS, insbesondere an Schleimhautstellen wie dem Magen-Darm-Trakt, mit der Entwicklung von Entzündungskrankheiten, einschließlich IBD, in Verbindung gebracht wird. In diesem Zusammenhang wurde beschrieben, dass die Produktion hoher NO-Konzentrationen durch infiltrierende Zellen wie Makrophagen, Neutrophile und Lymphozyten sowie durch Epithelzellen des Dickdarms in direktem Zusammenhang mit lokalen Gewebeschäden und der Verschlimmerung der Krankheit bei CED steht. Diese Beobachtung wurde durch die Tatsache verstärkt, dass die Überexpression von iNOS, die durch die entzündlichen Zytokine IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 und IL-23 induziert wird, im Plasma, in mononukleären Zellen der Lamina propria und in Darmepithelzellen von IBD-Patienten und Mäusen mit Darmentzündung gefunden wurde, was die Rolle von iNOS-Derivaten wie NO und entzündlichen Zytokinen bei der Verschlimmerung der Krankheit und dem Krankheitsverlauf unterstreicht. Daher liegt die Vermutung nahe, dass Therapien, die auf die Beeinflussung dieser Aspekte abzielen, ein wichtiges Instrument zur Eindämmung der Entzündung und des Fortschreitens der Krankheit darstellen könnten. In diesem Zusammenhang verringerte das aus den Wurzeln von Morinda officinalis, einem Mitglied der Familie der Rubiaceae wie M. citrifolia, isolierte Monotropein die In-vitro-Produktion von NO in Makrophagen von Mäusen nach Stimulierung mit LPS in dosisabhängiger Weise. In klinischen Studien, in denen hohe Nitrit-/Nitratwerte im Plasma, Urin und Lumen von CED-Patienten beschrieben wurden, wurde ein positiver Zusammenhang zwischen NO und dem Schweregrad von CED vermutet. Shin et al. wiesen auch die Wirkung von Monotropein nach, wenn Mäuse an 9 aufeinanderfolgenden Tagen 4 % DSS ausgesetzt wurden. In diesem Fall war die Behandlung in der Lage, die Aktivität der Entzündungsfaktoren COX-2 und MPO zu verringern. Die Untersuchung der MPO-Aktivität ist ein kritischer Marker für die Infiltration von Neutrophilen in der Darmschleimhaut. In der Tat haben Studien, bei denen verschiedene Protokolle zur Induktion einer Kolitis verwendet wurden, eine positive Korrelation zwischen der Bestimmung der MPO-Aktivität und dem Schweregrad der Erkrankung gezeigt. Obwohl die Expressionen von COX-2 und iNOS in unserer Studie nicht bestimmt wurden, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass verschiedene Mitglieder der Rubiaceae-Familie die Entzündung auf ähnliche Weise modulieren und somit das Fortschreiten und den Schweregrad der DSS-induzierten Kolitis durch analoge Mechanismen hemmen können. Die Fähigkeit, wichtige Entzündungskomponenten durch Therapien zu modulieren, die darauf abzielen, die Aktivität verschiedener Zelltypen, wie z. B. Makrophagen, zu kontrollieren und darüber hinaus die Produktion von Zytokinen und NO zu reduzieren, wie dies in unserer Studie bei der Verwendung von NFJ beobachtet wurde, stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um das Fortschreiten der Entzündung bei CED einzuschränken. Die Kontrolle der Entzündung durch diese Mechanismen könnte die Aufrechterhaltung der Darmarchitektur erklären, die in unserer Studie bei den Verdünnungen 1:10 und 1:100 beobachtet wurde.

Zu den komplexen und heterogenen Mechanismen, die mit der Entwicklung von Darmentzündungen in Verbindung gebracht werden, gehören die Genetik des Wirts, Auslöser aus der Umwelt und Störungen sowohl in der Zusammensetzung der Mikrobiota als auch im Immungleichgewicht. Der Schweregrad der Darmentzündung geht mit einer erhöhten Produktion proinflammatorischer Zytokine (z. B. TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 und IL-23) einher, so dass Therapien, die auf eine Senkung dieser Zytokine abzielen, von Bedeutung sind. In unserer Studie konnte die Behandlung mit Noni-Fruchtsaft dosisabhängig die Produktion von TNF-α, IFN-γ und IL-17 im Darm verringern.

TNF-α ist einer der zentralen Akteure bei der Entstehung von Darmentzündungen und ist in der Darmschleimhaut von Patienten mit CED erhöht. Dieses Zytokin spielt auch eine zentrale Rolle bei der Produktion von NO und erhöht die Produktion von Metalloproteinase, was zum Verlust der epithelialen Integrität und zur Verschlimmerung der Krankheit beiträgt. Die Wirkungen von TNF-α werden durch zwei Rezeptoren vermittelt, TNF-Rezeptor-1 (TNFR-1) und TNF-Rezeptor-2 (TNFR-2). Ersterer kann sowohl in Immun- als auch in Nicht-Immunzellen exprimiert werden und führt zur Aktivierung von NF-κB, Zytotoxizität und Produktion von Entzündungszytokinen. In unserer Studie hat die Behandlung mit Noni-Fruchtsaft die Produktion von TNF-α im Darm unabhängig von der verwendeten Verdünnung erheblich reduziert. Diese Modulation könnte zumindest teilweise auf die Hemmung von NF-κB durch Ascorbinsäure und Flavonoidglykosid zurückzuführen sein, die aus fermentiertem Noni-Fruchtsaft isoliert wurden. Es kann jedoch auch spekuliert werden, dass diese Moleküle die TNF-α-Konzentration im Darm durch eine Herunterregulierung von TNFR-1 verringern könnten. Aufgrund der Bedeutung dieses Zytokins bei der Entstehung und Verschlimmerung von CED könnten Therapien, die auf die Bekämpfung von TNF-α abzielen, um die Entwicklung von Darmentzündungen zu verhindern, tatsächlich nützlich sein. Die Verabreichung von monoklonalen Antikörpern gegen IL-6 und TNF-α konnte den Schweregrad der Erkrankung verringern und die Darmentzündung bei DSS-induzierter Kolitis abschwächen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit neuer therapeutischer Ansätze, die darauf abzielen, das Fortschreiten der IBD besser zu kontrollieren und die Nebenwirkungen zu verringern.

IFN-γ ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von einer Vielzahl von Zellen produziert wird, darunter T-Helferzellen (CD4+T-Zellen) und zytotoxische T-Zellen (CD8+T-Zellen), natürliche Killerzellen und angeborene lymphoide Zellen der Gruppe 1 . Eine höhere Frequenz von CD4+T-Zellen und CD8+T-Zellen, die IFN-γ produzieren, wurde bei Patienten mit CED im Vergleich zu ihren Kontrollkollegen festgestellt. Sowohl IFN-γ als auch TNF-α sind in der Schleimhaut von CED-Patienten erhöht und wirken synergetisch, indem sie zur Entwicklung und Aufrechterhaltung von Entzündungen beitragen, die in einem Abbau der Barriere gipfeln. Es wurde gezeigt, dass diese Zytokine unter entzündlichen Bedingungen interzelluläre Verbindungsproteine zerstören, was in nicht entzündeten Bereichen von ungesundem Gewebe nicht beobachtet wird. Zu den Mechanismen, die diesen Störungen zugrunde liegen, gehören die Apoptose des Epithels und die verminderte Transkription von Proteinen der engen Verbindungen. Daher könnten Therapien, die auf eine Verringerung dieses Zytokins abzielen, bei der Kontrolle der Entzündung und der Verbesserung des Krankheitsverlaufs hilfreich sein. In diesem Zusammenhang konnte eine kurzzeitige Glukokortikoid-Behandlung von Mäusen, die sechs Tage lang DSS ausgesetzt waren, die Häufigkeit der IFN-γ-produzierenden CD4+-Zellen in der Milz verringern und die Expression dieses Zytokins und von IL-1β im Darm reduzieren. Diese Verringerung der IFN-γ-Aktivität führte zu einer Verbesserung des klinischen Ergebnisses und zur Wiederherstellung des Immungleichgewichts. Darüber hinaus wurden die positiven Auswirkungen, die mit der Verringerung von entzündlichen Zytokinen wie IL-1β und IFN-γ verbunden sind, in einem Mausmodell für Kolitis weiter aufgeklärt. In diesem Fall wurde die Kolitis durch intrakolonische Verabreichung von Dinitrobenzolsulfonsäure (DNBS) ausgelöst, und die Mäuse wurden mit einem nicht psychotropen Cannabinoid, Cannabigerol genannt, behandelt. Obwohl die Auswirkungen der Behandlung mit Noni-Fruchtsaft auf die Apoptose und die intestinale Permeabilität in dieser Studie nicht untersucht wurden, könnten die Verbesserung der Darmarchitektur und die Verringerung des entzündlichen Infiltrats teilweise auf die Verringerung von IFN-γ zurückgeführt werden.

IL-17-produzierende Zellen sind an der Pathogenese zahlreicher Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen beteiligt, und es wurde gezeigt, dass sie die Krankheitspathogenese bei IBD vermitteln. Die Rolle der Th17-Zellen bei der Pathogenese von CED wurde in erster Linie auf eine Mutation im IL-23R-Gen zurückgeführt, das bei CED-Patienten identifiziert wurde und die Produktion von Th17-verwandten Zytokinen reguliert. In der Tat wurde bereits eine erhöhte Produktion von IL-17 durch Lamina-Propria-Zellen sowohl bei UC als auch bei CD nachgewiesen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass von Th17-Zellen produzierte Zytokine wie IL-17 und IL-21 die Expression von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-8 sowie die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten hochregulieren, was zur Verschlimmerung der CED beitragen kann. Neben der klassischen Rolle der Th17-Lymphozyten in der Pathogenese der CED wurden auch angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 3 sowohl in experimentellen Modellen als auch bei Menschen mit der Produktion von IL-17 und der Pathogenese der Krankheit in Verbindung gebracht. In unserer Studie wurden im Dickdarm von Mäusen, die mit Noni-Fruchtsaft behandelt wurden, verringerte IL-17-Konzentrationen festgestellt, allerdings nur bei Verwendung der Verdünnungen 1:10 und 1:100. Obwohl wir nicht feststellen konnten, ob die Verringerung von IL-17 im Darm eher mit der angeborenen oder der adaptiven Immunität oder mit beidem zusammenhängt, dürfen wir die Bedeutung von Therapien nicht unterschätzen, die darauf abzielen, diese Zytokine zu produzieren, um die Entzündung bei Kolitis zu hemmen.

Insgesamt haben unsere Daten gezeigt, dass die Behandlung mit Noni-Fruchtsaft eine wichtige Rolle bei der Hemmung der Entzündung während der Entwicklung einer experimentellen Kolitis spielt. Einer der wichtigsten Aspekte bei der Verwendung von Fruchtsaft als therapeutische Option ist seine immunmodulierende Wirkung, die sich folglich auf die Verbesserung der Darmarchitektur auswirkt. Dennoch müssen weitere Studien durchgeführt werden, um die Moleküle aufzuklären, die der Verringerung der entzündlichen Zytokine in diesem Modell zugrunde liegen.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anerkennungen

Diese Studie wurde von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2) unterstützt.