Abstract

Morinda citrifolia L. (noni) har vist sig at kunne behandle forskellige sygdomme. Data vedrørende dens rolle i behandlingen af tarmbetændelse kræver dog stadig afklaring. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi virkningerne af nonifrugtjuice (NFJ) i behandlingen af C57BL/6-mus, som kontinuerligt blev udsat for dextransulfatnatrium (DSS) i 9 på hinanden følgende dage. NFJ-indtagelse havde ingen indvirkning på reduktionen af de kliniske tegn på sygdommen eller på vægttabet. Ikke desto mindre blev musenes tarmarkitektur bevaret ved anvendelse af en fortynding på 1 : 10, ledsaget af en reduktion af det inflammatoriske infiltrat. Uanset koncentrationen af NFJ blev der også observeret et fald i både aktiviteten af myeloperoxidase og de vigtigste inflammatoriske cytokiner, TNF-α og IFN-γ, i tarmen. Når NFJ blev fortyndet 1 : 10 og 1 : 100, blev der desuden påvist en reduktion i produktionen af nitrogenoxid og IL-17 i tarmhomogenater. Samlet set var behandlingen med NFJ effektiv i forskellige aspekter, der er forbundet med sygdomsprogression og forværring af sygdommen. Disse resultater kan pege på nonifrugt som en vigtig kilde til antiinflammatoriske molekyler med et stort potentiale til at hæmme progressionen af inflammatoriske sygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom.

1. Introduktion

Den potentielle antiinflammatoriske aktivitet af flere naturlige forbindelser i nedreguleringen af nøgleaktører i udviklingen af inflammation er blevet undersøgt i forskellige scenarier, herunder modulation af cytokiner, transkriptionsfaktorer, enzymer og produktion af protein- og nonprotein-inflammatoriske mediatorer. Disse aktiviteter omfatter modulering af cytokiner (f.eks. IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 og IL-12), transkriptionsfaktorer, enzymer (f.eks. myeloperoxidase-MPO og cyclooxygenase COX-1 og COX-2) og også produktion af nitrogenoxid (NO) . På grund af deres betydning for kontrol af inflammation er behandlinger, der er rettet mod sådanne molekyler, blevet foreslået som mulige hjælpemidler til forebyggelse og/eller behandling af inflammatoriske sygdomme som f.eks. reumatoid arthritis , dermatitis og inflammatorisk tarmsygdom (IBD) . IBD’er er kroniske inflammatoriske sygdomme i mave-tarmkanalen, som klinisk viser sig som en af de to sygdomme Crohns sygdom (CD) eller colitis ulcerosa (UC) . Disse patologier er af særlig interesse, da de berører millioner af mennesker verden over, og de nuværende behandlinger er stadig ikke fuldt ud effektive til at kontrollere sygdomsudviklingen eller forhindre forekomsten af bivirkninger .

Morinda citrifolia L. (noni) tilhører Rubiaceae-familien, og den er en kilde til naturlige molekyler, der er blevet brugt som lægeplante af polyneserne i mere end 2 000 år . Indtil videre er der blevet isoleret adskillige bioaktive forbindelser fra nonifrugter, herunder fedtsyrer, flavonoider, polysaccharider og steroler . Det antiinflammatoriske potentiale af nonifrugtforbindelser er blevet påvist i en eksperimentel model af Helicobacter pylori-infektion, hvor der blev anvendt ethanol- og ethylacetatekstrakter. Disse ekstrakter var i stand til at reducere både neutrofile kemotaxis og produktionen af inducerbar nitrogenoxid (iNOS) og COX-2 . I overensstemmelse hermed viste C57BL/6-mus, der blev behandlet oralt med nonifrugtjuice på 500 mg kg-1 dag-1 i 60 dage, reduceret inflammatorisk infiltrat og cytokinekspression for IL-12, TNF-α, TGF-β og IL-10 i fodballen, der var inficeret med Leishmania amazonensis . Det er vigtigt at nævne, at cytokiner som IL-12, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-17 og IL-23 er forbundet med udvikling og forværring af IBD, så de er blevet behandlet forskelligt med henblik på at behandle denne inflammatoriske lidelse . Endvidere blev det antiinflammatoriske potentiale af Morinda citrifolia-bladekstrakt vist ved reduktion af TNF-α-, IL-1β- og NO-niveauerne i makrofager efter stimulering med lipopolysaccharid (LPS) . Selv om nonifrugtforbindelsernes rolle i kontrollen af inflammatoriske aktører er af særlig relevans, er deres virkninger i udviklingen af tarmbetændelse stadig dårligt udforsket.

Derfor viste denne undersøgelse virkningerne af noni-frugtjuice på cytokinsamspillet og tarmarkitekturen i en murinmodel af dextransulfatnatrium-induceret colitis som underliggende mekanismer for dens immunmodulerende aktivitet.

2. Materialer og metoder

2.1. Indsamling og botanisk identifikation af planten

Frugterne anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra monokultur af 150 noni planter på Fazenda Boa Vontade, en gård i kommunen Araguari, Triângulo Mineiro/MG, Brasilien, ved koordinaterne 18°43′47.23′′′S, 48°6′49.50′′′′O (data fra Google Earth, 2013). Alle eksemplarer blev præpareret i henhold til konventionelle herboriseringsteknikker og deponeret i herbariet på det føderale universitet i Uberlândia (HUFU Herbarium) under registreringsnummer HUFU-67210, som Morinda citrifolia L. (Rubiaceae).

2.2. Saftudtrækningsproces

Morinda citrifolia (noni)-saft blev fremstillet i laboratoriet for farmakokognosie på universitetet i Uberaba i Uberaba, Minas Gerais, Brasilien. M. citrifolia-frugter blev manuelt og tilfældigt indsamlet fra 150 planter, vasket i ozonbehandlet vand og opbevaret ved stuetemperatur i 3-5 dage. Frugterne blev mekanisk afpulpet ved hjælp af en frugtpulpemaskine, og efter fjernelse af frø blev det resulterende frugtkød centrifugeret ved 4 000 rpm under køling, indtil supernatanterne var klare, og det blev derefter betragtet som 100 % (v/v) saft og opbevaret ved -70 °C indtil videre brug.

2.3. Dyreforsøg

C57BL/6-hanemus i alderen 6-8 uger og med en vægt på 20-25 g blev opstaldet under specifikke patogenfrie og standardkontrollerede miljøforhold ved konstant temperatur (25 °C) i en 12-timers lys/mørkecyklus med ad libitum adgang til mad og vand i dyrehuset på Federal University of Triângulo Mineiro (UFTM), Brasilien. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med UFTM’s Institutional Animal Care and Use Committee i henhold til protokol 275. Forsøgene blev udført med 8 mus/grupper som følger: saltvand, sunde kontrolmus behandlet med saltvand; DSS 2,5 %, mus udsat for dextransulfatnatrium (DSS); DSS 2,5 % + ren noni, mus udsat for DSS og behandlet med ren nonifrugtjuice; DSS 2,5 % + ren noni, mus udsat for DSS og behandlet med ren nonifrugtjuice; DSS 2.5 % + noni 1 : 10, mus, der udsættes for DSS og behandles med en 1 : 10 fortynding af nonifrugtjuice, og DSS 2,5 % + noni 1 : 100, mus, der udsættes for DSS og behandles med en 1 : 100 fortynding af nonifrugtjuice. En mængde på 100 μl pr. mus blev administreret oralt i 9 på hinanden følgende dage.

2.4. DSS-induceret colitis og klinisk vurdering

Kolitis blev induceret med 2,5 % DSS (MP Biomedicals, Illkirch, Frankrig, Molekylvægt: 36.000-50.000 kDa), der kontinuerligt blev tilsat drikkevandet i 9 på hinanden følgende dage med henblik på prøveudtagning. Ud over at registrere den daglige føde- og vandindtagelse blev også ændringer i kropsvægt og kliniske sygdomstegn vurderet hver dag for at opnå en klinisk sygdomsscore for hver mus. Hvert tegn, som dyrene viste, svarede til et point, og summen af point for hver mus definerede en klinisk score. De kliniske scorer blev bestemt som tidligere beskrevet heri .

2,5. Eutanasi og prøveudtagning

Musene blev eutanaseret på dag 9, og tyktarmen blev fjernet med henblik på yderligere analyse. Colonprøverne blev opdelt i mindre sektioner, der blev nedsænket i PBS/10% formaldehyd med henblik på paraffinindlejring eller blev straks frosset ned i flydende nitrogen med henblik på kvantificering af myeloperoxidase (MPO) eller nitrogenoxid (NO) aktivitet ved enzymatiske analyser. Desuden blev et tarmsnit fra hver mus opsamlet i en opløsning indeholdende proteaseinhibitorer (Complete®, Roche Pharmaceuticals, Mannheim, Tyskland) med henblik på kvantificering af cytokiner ved enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

2.6. Myeloperoxidase (MPO) og nitrogenoxid (NO)

Med henblik på MPO-assay blev sektionerne homogeniseret, og erytrocytterne blev lyseret. Den pellet, der blev opnået efter centrifugering, blev resuspenderet, efterfulgt af tre fryse- og optøningscyklusser. Efter centrifugering blev supernatanten anbragt i 96-hulsplader og afsløret med tetramethylbenzidin (TMB)-substrat (BD OptEIA™, San Diego, CA) ved 37 °C. Reaktionen blev stoppet, og der blev foretaget aflæsninger i et spektrofotometer ved 450 nm. MPO-aktiviteten blev bestemt som tidligere beskrevet . Resultaterne blev normaliseret til tørvægten af hvert tarmsnit og udtrykt som optisk tæthed pr. gram væv (nm/g væv).

For NO-måling blev det nitrit, der akkumuleres i tarmhomogenater, målt som en indikator for NO-produktion ved hjælp af Griess-reaktionen . Derefter blev 100 μL vævshomogenat blandet med 100 μL Griess-reagens, som består af lige store mængder af 1% (w/v) sulfanilamid i 5% (v/v) fosforsyre og 0,1% (w/v) naphthyl-ethylendiamin-HCl, og inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. Absorbansen blev målt ved 540 nm i en 96-hulpladelæser (Perkin Elmer Cetus, CA, USA). Mængden af nitrit i prøverne blev beregnet ved hjælp af lineær regressionsanalyse af absorbansen af den serielle fortynding af natriumnitrit-standardkurven. Resultaterne blev normaliseret i forhold til tørvægten af hvert tarmsnit og udtrykt som picogram pr. milliliter pr. gram væv (pg/ml/g).

2,7. Cytokinkvantificering ved ELISA

Cytokinerne IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-4 og IL-23 blev kvantificeret i vævshomogenater ved ELISA i henhold til producentens anvisninger (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Resultaterne blev normaliseret i forhold til tørvægten af hvert tarmsnit og udtrykt som nanogram pr. milliliter pr. gram væv (ng/mL/g væv).

2,8. Histologi og histopatologisk analyse

For at vurdere de mikroskopiske skader blev tarmsnittene skåret i længderetningen, skyllet med PBS, fikseret i 10 % bufferet formalin i 24 timer og derefter behandlet til paraffinindlejring efterfulgt af mikrotomsnit. Der blev fremstillet vævssnit (5 μm), som blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E). Med henblik på histopatologisk analyse blev mucosa, submucosa, muskellag og serosa vurderet. Disse tarmsnit blev også vurderet for tilstedeværelse af ødem, inflammatorisk infiltrat og epitelafvigelser.

Billeder blev optaget ved hjælp af et digitalt videokamera (Evolution MP 5.0 color Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA), med et 10x objektiv, koblet til et lysmikroskop (Nikon Eclipse 50i, Melville, NY, USA). Morfometri blev udført ved hjælp af Image-Pro Insight (Media Cybernetics). Det inflammatoriske infiltrat blev målt på grundlag af det beskadigede område med inflammatorisk infiltrat divideret med det samlede vævsareal visualiseret på det erhvervede billede og udtrykt som en procentdel (%). En uddannet patolog, der var blindet for behandlingen, udførte den histopatologiske analyse.

2,9. Dataanalyse og statistik

Normal fordeling og homogen varians blev testet for alle variabler. Når fordelingen blev betragtet som normal, og variansen var homogen, blev der anvendt parametriske test: uparret Student-test eller envejs ANOVA efterfulgt af Tukey’s post hoc-test. I tilfælde af en ikke-Gaussiansk fordeling af data blev følgende ikke-parametriske test anvendt: Mann-Whitney-test eller Kruskal-Wallis-test ledsaget af Dunn’s post hoc-test. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SD. De observerede forskelle blev betragtet som signifikante, når (5 %). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism, version 5.0 (La Jolla, CA, USA).

3. Resultater

3.1. Behandling med nonifrugtjuice og sygdomsudfald

Først blev musene for at vurdere, om nonifrugtjuice kunne forhindre vægttab og udfaldet af DSS-induceret colitis, udsat for DSS i 9 dage og derefter behandlet med frugtsaft, som beskrevet i Materialer og metoder. Noni-frugtjuicegruppen syntes ikke at reducere vægttabet sammenlignet med deres kontrolmodparter (DSS 2,5 %) (Figur 1(a)). Desuden var der, uanset den anvendte koncentration, ingen effekt på præsentationen af kliniske sygdomstegn hos de mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice, i forhold til de ubehandlede mus (figur 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

Behandling med noni-frugtjuice og sygdomsudfald. C57BL/6-mus blev udsat for dextransulfatnatrium (DSS) 2,5 % og blev behandlet dagligt med nonifrugtjuice. På dag 9 blev musene euthaniseret for at få tarmsnit. (a) Procentvis vægtændring. (b) Klinisk sygdomsscore. Saltvand, sunde kontrolmus behandlet med saltvand; DSS 2,5 %, mus udsat for DSS; DSS 2,5 % + ren noni, mus udsat for DSS og behandlet med den rene nonifrugtjuice; DSS 2.5% + noni 1 : 10, mus, der udsættes for DSS og behandles med en 1 : 10 fortynding af frugtsaft; og DSS 2,5% + noni 1 : 100, mus, der udsættes for DSS og behandles med en 1 : 100 fortynding af frugtsaft.

3.2. Indtagelse af nonifrugtsaft hæmmer inflammation og bevarer tarmarkitekturen på en dosisafhængig måde

Da der ikke blev observeret nogen makroskopiske virkninger efter behandling med nonifrugtsaft, sigtede vi herefter mod at bestemme, om indtagelse af frugtsaft havde nogen mikroskopisk effekt på tarmarkitekturen. Det blev observeret, på en dosisafhængig måde, at den gruppe, der blev behandlet med nonifrugtjuice, var i stand til at bevare deres tarmarkitektur. De sunde mus (figur 2(a)) havde en bevaret epiteloverflade, retlinede krypter, der var sammensat af det sædvanlige antal gobletceller. I lamina propria blev det sædvanlige mononukleære infiltrat visualiseret. Submucosa, muskulatur og serøse muskler havde normal arkitektur. Mus, der blev udsat for DSS, havde erosioner på tarmepitelets overflade og fravær af krypter (tabel 1). Lamina propria viste moderat ødem og infiltration af mononukleære celler (Figur 2(b), pilespids), submucosa havde moderat mononukleært infiltrat og alvorligt ødem (Figur 2(b), pil), og muskellaget var let fortykket med colitisaktivitet. Hos mus, der blev udsat for DSS og behandlet med ren nonisaft, var der kun få og milde uregelmæssigheder i krypterne (tabel 1), og lamina propria havde moderat ødem (figur 2(c), pil) og mononukleært infiltrat (figur 2(c), pilespids); der blev imidlertid kun påvist et mildt mononukleært infiltrat og moderat ødem i det submucosale lag, og det muskulære lag var let fortykket. På den anden side havde krypterne hos mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice fortyndet 1 : 10, deres uregelmæssigheder bevaret (Figur 2(d), asterisk), lamina propria viste både moderat ødem (Figur 2(d), pil) og mononukleært infiltrat (Figur 2(d), pilespids), og submucosa havde kun et let mononukleært infiltrat og moderat ødem (Tabel 1). Hos de mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice fortyndet 1 : 100, var krypterne uregelmæssige og atrofiske (Figur 2(e), asterisk), lamina propria havde moderat ødem og mononukleært infiltrat, og submucosalaget viste et let mononukleært infiltrat og moderat ødem (Tabel 1). Generelt var arkitekturen af tarmkrypterne bevaret hos de mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice, og den var mere bevaret hos de mus, der fik nonisaft i fortyndinger på 1 : 10 og 1 : 100 i sammenligning med dem, der blev behandlet med ren noni eller DSS.

DSS 2,5 % DSS 2,5 % + ren noni DSS 2,5 % + noni 1 : 10 DSS 2.5% + noni 1 : 100 Lamina propria-ødem Moderat Moderat Mildt Moderat Submucosalt ødem Svært Moderat Moderat Moderat Mukosalt mononukleært infiltrat Moderat Mildt Mildt Mildt Moderat Submucosal mononukleært infiltrat Moderat Mild Mild Mild Mild Intestinale krypter Absent Kontinuerlig Uregelmæssig Uregelmæssig

Tabel 1

Histopatologiske resultater for mus, der blev udsat for DSS under forskellige forhold.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figur 2

Noni-frugtjuiceindtagelse bevarer tarmens arkitektur i et dosis-afhængig måde. C57BL/6-mus blev udsat for dextransulfatnatrium (DSS) 2,5 % og blev behandlet dagligt med nonifrugtjuice. Tyktarmen blev indsamlet på dag 9 med henblik på histopatologisk analyse. (a) raske mus uden colitis; (b) mus udsat for DSS: lamina propria med moderat ødem og infiltration af mononukleære celler (pilespids), submucosa med moderat mononukleært infiltrat og alvorligt ødem (pil); (c) mus udsat for DSS og behandlet med ren noni-frugtjuice: lamina propria med moderat ødem (pil) og mononukleært infiltrat (pilespids); (d) mus udsat for DSS og behandlet med nonifrugtjuice fortyndet med 1 : 10: krypter med bevarede uregelmæssigheder (stjerne); lamina propria med moderat ødem (pil) og mononukleært infiltrat (pilespids); (e) mus udsat for DSS og behandlet med nonifrugtjuice fortyndet 1 : 100: regelmæssige og atrofiske krypter (stjerne); lamina propria med moderat ødem (pil) og mononukleært infiltrat (pilespids).

Produktionen af NO var reduceret hos de mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice fortyndet 1 : 10 og 1 : 100 i forhold til dem, der fik ren noni eller DSS (figur 3(a)). Desuden havde mus, uanset den anvendte koncentration, der blev behandlet med nonifrugtjuice, en reduceret aktivitet af MPO (figur 3(b)) i forhold til DSS-eksponerede mus. Selv om vægttab og sygdomsudfald ikke blev påvirket af noni-frugtindtagelse, var den forbedrede tarmarkitektur og den reducerede aktivitet af enzymer, der er ansvarlige for inflammation, forbundet med frugtsaftindtagelse på en dosisafhængig måde.

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)
(b)

Figur 3

Noni-frugtjuiceindtagelse hæmmer inflammation ved at reducere nitrogenoxid- og myeloperoxidase-aktiviteterne. C57BL/6-mus blev udsat for dextran sulfatnatrium (DSS) 2,5 % og blev behandlet dagligt med nonifrugtjuice. På dag 9 blev musene aflivet for at få tarmsnit. Kvantificering af intestinal produktion af nitrogenoxid (a) og myeloperoxidase (MPO)-aktivitet, udtrykt som henholdsvis picogram pr. milliliter pr. gram væv (pg/ml/g) og som optisk tæthed pr. gram væv (nm/g væv). Dataene er angivet som gennemsnit ± SEM. .

3.3. Noni-frugtjuiceforbrug reducerer vigtige inflammatoriske cytokiner i tarmen i en dosisafhængig måde

Endeligt sigtede vi mod at evaluere, om forbedringen af tarmarkitekturen også kunne være forbundet med modulering af vigtige cytokiner, der er forbundet med forværring/beskyttelse af sygdom. Mus behandlet med nonifrugtjuice, uanset den anvendte koncentration, viste reduceret produktion af inflammatoriske cytokiner TNF-α og IFN-γ (figur 4(a) og 4(c), hhv.). En reduktion af IL-17, en anden vigtig cytokin, der er forbundet med sygdomsforværring, blev kun observeret hos mus, der blev behandlet med 1 : 10- og 1 : 100-forstørrelser (figur 4(e)). Ikke desto mindre var der ingen forskelle i produktionen af IL-12 (Figur 4(b)), IL-4 (Figur 4(d)), IL-23 (Figur 4(f)) og IL-10 (Figur 4(g)). Samlet set tyder disse resultater på, at en forbedret tarmarkitektur også kan være forbundet med en lokal reduktion af vigtige inflammatoriske cytokiner.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

Figur 4

Noni-frugtjuiceindtagelse reducerer vigtige inflammatoriske cytokiner i tarmen i en dosis-afhængig måde. C57BL/6-mus blev udsat for dextransulfatnatrium (DSS) 2,5 % og blev behandlet dagligt med nonifrugtjuice. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) blev udført i tarmhomogenater. (a) TNF-α, (b) IL-12, (c) IFN-γ, (d) IL-17, (e) IL-23, (f) IL-4, og (g) IL-10. Resultaterne blev udtrykt som nanogram cytokin pr. milliliter pr. gram væv (ng/ml/g væv), normaliseret i forhold til vævets tørvægt. Data er angivet som gennemsnit ± SEM. .

4. Diskussion

De resultater, der præsenteres heri, viser, at nonifrugtjuice kan reducere vigtige inflammatoriske cytokiner, der er involveret i udviklingen af tarmbetændelse. Endvidere blev det vist, at behandling med frugtsaft også kunne forbedre tarmarkitekturen, hovedsagelig når der blev anvendt en fortynding på 1 : 10. Der blev dog, i det mindste tilsyneladende, ikke påvist nogen virkninger på præsentationen af kliniske sygdomstegn.

De gavnlige egenskaber ved behandling med nonifrugtjuice i forbindelse med kontrol af colitis blev delvist tilskrevet en forbedring af tarmens arkitektur sammen med en reduktion af inflammatoriske infiltrater. Dette scenarie blev fulgt af et fald i aktiviteten af NO (kun når nonifrugtjuice blev fortyndet 1 : 10 og 1 : 100) og MPO (ved enhver koncentration). NO er en stærk proinflammatorisk mediator, der hovedsagelig stammer fra inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) efter stimulering med bakterielle endotoksiner og inflammatoriske cytokiner som IL-1β, TNF-α og IFN-γ i forskellige celletyper, herunder makrofager, neutrofiler, endotelceller og glatte muskelceller . Overekspression af iNOS, især på slimhinder, f.eks. i mave-tarmkanalen, er rapporteret at være forbundet med udviklingen af inflammatoriske sygdomme, herunder IBD . I denne forbindelse blev det beskrevet, at produktionen af høje NO-niveauer fra infiltrerende celler, såsom makrofager, neutrofiler og lymfocytter, samt fra colon-epitelceller er direkte forbundet med lokal vævsskade og forværring af sygdommen ved IBD . Denne observation blev forstærket af, at overekspression af iNOS induceret af de inflammatoriske cytokiner IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 og IL-23 blev fundet i plasma, i lamina propria mononukleære celler og i colon epitelceller hos IBD-patienter og mus med tarmbetændelse , hvilket styrker den rolle, som iNOS-derivater såsom NO og inflammatoriske cytokiner spiller for forværringen af sygdommen og dens udfald. Det synes derfor rimeligt at tro, at behandlinger, der sigter mod at modulere sådanne aspekter, kan være et vigtigt redskab til at begrænse inflammation og sygdomsudvikling. I denne sammenhæng reducerede monotropein isoleret fra rødderne af Morinda officinalis, et medlem af Rubiaceae-familien ligesom M. citrifolia, in vitro produktionen af NO i murine makrofager efter stimulering med LPS på en dosisafhængig måde . En positiv korrelation mellem NO og sværhedsgraden af IBD blev foreslået i kliniske undersøgelser, der beskriver forekomsten af høje niveauer af nitrit/nitrat i plasma, urin og lumen hos IBD-patienter . Shin et al. påviste også aktiviteten af monotropein, når mus blev udsat for 4% DSS i 9 på hinanden følgende dage . I dette tilfælde var behandlingen i stand til at reducere aktiviteten af de inflammatoriske aktører COX-2 og MPO . Undersøgelsen af MPO-aktivitet er en kritisk markør for neutrofil infiltration i tarmslimhinden . Undersøgelser, der anvender forskellige protokoller til at fremkalde colitis, har faktisk vist en positiv korrelation mellem bestemmelse af MPO-aktivitet og sygdommens sværhedsgrad . Selv om udtrykkene af COX-2 og iNOS ikke blev bestemt i vores undersøgelse, tyder disse resultater på, at forskellige medlemmer af Rubiaceae-familien kan modulere inflammation på en lignende måde og dermed hæmme progressionen og sværhedsgraden af DSS-induceret colitis ved hjælp af analoge mekanismer. Evnen til at modulere vigtige inflammatoriske komponenter ved hjælp af behandlinger, der sigter mod at kontrollere aktiviteten af forskellige celletyper, såsom makrofager, ud over at reducere produktionen af cytokiner og NO, som det blev observeret i vores undersøgelse, da NFJ blev anvendt, repræsenterer en lovende tilgang til at begrænse progressionen af inflammation i IBD. Kontrollen af inflammation ved hjælp af disse mekanismer kan forklare opretholdelsen af tarmarkitekturen, der blev observeret i vores undersøgelse, når fortyndingerne 1 : 10 og 1 : 100 blev anvendt.

De komplekse og heterogene mekanismer, der er forbundet med udviklingen af tarmbetændelse, omfatter værtsgenetik, miljømæssige udløsende faktorer og forstyrrelser både i mikrobiotaens sammensætning og i immunbalancen . Sværhedsgraden af tarminflammation er forbundet med øget produktion af proinflammatoriske cytokiner (f.eks. TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-17 og IL-23), hvilket gør terapier, der sigter mod at reducere niveauerne af disse cytokiner, relevante. I vores undersøgelse kunne behandling med nonifrugtjuice på en dosisafhængig måde reducere produktionen af TNF-α, IFN-γ og IL-17 i tarmen.

TNF-α er en af de centrale aktører i udviklingen af tarmbetændelse , og den er øget i tarmslimhinden hos patienter med IBD . Dette cytokin har også en central rolle i produktionen af NO, og det øger produktionen af metalloproteinase, hvilket bidrager til tab af epithelintegritet og til forværring af sygdommen. Virkningerne af TNF-α formidles af to receptorer, TNF-receptor-1 (TNFR-1) og TNF-receptor-2 (TNFR-2). Førstnævnte kan udtrykkes i både immune og ikke-immune celler, hvilket resulterer i aktivering af NF-κB, cytotoksicitet og produktion af inflammatoriske cytokiner . I vores undersøgelse reducerede behandling med nonifrugtjuice i betydelig grad produktionen af TNF-α i tarmen, uanset den anvendte fortynding. Denne modulation kunne, i det mindste delvist, tilskrives hæmningen af NF-κB af ascorbinsyre og flavonoidglycosid, som blev isoleret fra fermenteret nonifrugtjuice . Det er dog muligt at spekulere i, at disse molekyler kan reducere niveauerne af TNF-α i tarmen ved at nedregulere TNFR-1. På grund af denne cytokins betydning for udvikling og forværring af IBD kunne det være nyttigt med behandlinger, der sigter mod at målrette TNF-α for at forhindre udviklingen af tarmbetændelse. Indgivelse af monoklonale antistoffer mod IL-6 og TNF-α var i stand til at reducere sygdommens sværhedsgrad og dæmpe tarmbetændelse i DSS-induceret colitis . Ikke desto mindre mister et betydeligt antal patienter reaktivitet, især på grund af produktion af antistofantistoffer og fremskyndet medicinclearance , og det styrker behovet for nye terapeutiske tilgange med henblik på bedre at kontrollere IBD-progression og reducere bivirkninger.

IFN-γ er et proinflammatorisk cytokin, der produceres af en bred vifte af celler, herunder T-hjælperceller (CD4+T-celler) og cytotoksiske T-celler (CD8+T-celler), naturlige dræberceller og gruppe 1 medfødte lymfoide celler . Der blev påvist en højere frekvens af CD4+T-celler og CD8+T-celler, der producerer IFN-γ, hos patienter med IBD sammenlignet med deres kontrolmodparter . Både IFN-γ og TNF-α er forøget i slimhinden hos IBD-patienter og virker synergistisk og bidrager til udvikling og vedligeholdelse af inflammation, der kulminerer med nedbrydning af barrieren . Det blev vist, at disse cytokiner forstyrrer intercellulære forbindelsesproteiner under inflammatoriske forhold, hvilket ikke observeres i ikke-inflammede områder af usundt væv . Nogle af de mekanismer, der ligger til grund for disse forstyrrelser, omfatter epitelapoptose og nedsat transkription af proteiner fra tætte forbindelser . Derfor kan behandlinger, der sigter mod at reducere dette cytokin, være nyttige til at kontrollere inflammation og forbedre sygdomsudfaldet. I denne sammenhæng kunne en kortvarig glukokortikoidbehandling af mus, der var udsat for DSS i seks dage, reducere hyppigheden af IFN-γ-producerende CD4+-celler i milten og mindske ekspressionen af dette cytokin og IL-1β i tarmen . Denne reduktion i IFN-γ-aktiviteten blev efterfulgt af en forbedring af det kliniske resultat og en genoprettelse af immunbalancen . Desuden blev de gavnlige virkninger i forbindelse med reduktionen af inflammatoriske cytokiner såsom IL-1β og IFN-γ yderligere belyst i en murin model af colitis. I dette tilfælde blev colitis induceret ved intracolonisk administration af dinitrobenzensulfonsyre (DNBS), og musene blev behandlet med en ikke-psykotropisk cannabinoid, kendt som cannabigerol . Selv om virkningerne af nonifrugtjuice-behandling på apoptose og tarmpermeabilitet ikke blev undersøgt i denne undersøgelse, kunne forbedringen af tarmarkitekturen og reduktionen af inflammatorisk infiltrat delvis tilskrives reduktionen af IFN-γ.

IL-17-producerende celler er involveret i patogenesen af mange inflammatoriske og autoimmune sygdomme, og det er blevet vist, at de formidler sygdomspatogenese i IBD . Th17-cellernes rolle i patogenesen af IBD blev primært tilskrevet en mutation i IL-23R-genet, som blev identificeret hos IBD-patienter, og som regulerer produktionen af Th17-relaterede cytokiner . Der var faktisk allerede blevet påvist en øget produktion af IL-17 af lamina propria-celler i både UC og CD . Endvidere blev det konstateret, at cytokiner produceret af Th17-celler, såsom IL-17 og IL-21, opregulerer ekspressionen af TNF-α, IL-1β, IL-6 og IL-8 og rekrutteringen af neutrofile , hvilket kan bidrage til forværring af IBD. Ud over den klassiske rolle, som Th17-lymfocytter spiller i IBD-patogenese, er gruppe 3 medfødte lymfoide celler også blevet impliceret i IL-17-produktion og sygdomspatogenese i både eksperimentelle modeller og hos mennesker . I vores undersøgelse blev der påvist reducerede niveauer af IL-17 i tyktarmen hos mus, der blev behandlet med nonifrugtjuice, men kun når der blev anvendt 1 : 10- og 1 : 100-fortyndinger. Selv om vi ikke identificerede, om reduktionen af IL-17 i tarmen var mere forbundet med den medfødte eller adaptive immunitet eller begge dele, kan vi ikke undervurdere betydningen af behandlinger, der sigter mod at producere disse cytokiner for at hæmme inflammation i colitis.

Samlet set viste vores data, at behandling med nonifrugtjuice spiller en vigtig rolle i at hæmme inflammation under udviklingen af eksperimentel colitis. Et af de vigtigste aspekter vedrørende brugen af frugtsaft som en terapeutisk mulighed vedrører dens immunmodulerende virkning, som har en deraf følgende indvirkning på forbedringen af tarmens arkitektur. Ikke desto mindre skal der udføres yderligere undersøgelser for at klarlægge de molekyler, der ligger til grund for reduktionen af inflammatoriske cytokiner i denne model.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 150075/2016-2).