Abstrakt

Cílem této studie bylo zhodnotit aktivitu flukonazolu proti 32 klinickým kmenům Candida albicans rezistentním na flukonazol a C. albicans ATCC 10231 referenčního kmene, po jejich vystavení subletálním koncentracím tea tree oil (TTO) nebo jeho hlavní bioaktivní složce terpinen-4-olu. U všech testovaných flukonazol-rezistentních kmenů C. albicans byly minimální inhibiční koncentrace (MIC) TTO a terpinen-4-olu nízké a pohybovaly se od 0,06 % do 0,5 %. Čtyřiadvacetihodinová expozice flukonazol-rezistentních kmenů C. albicans flukonazolu se subletální dávkou TTO zvýšila aktivitu flukonazolu vůči těmto kmenům. Celkem 62,5 % izolátů bylo klasifikováno jako citlivé, 25,0 % vykazovalo střední citlivost a 12,5 % bylo rezistentních. U všech testovaných klinických kmenů se MIC flukonazolu snížila z průměrných 244,0 μg/ml na průměrných 38,46 μg/ml a minimální fungicidní koncentrace flukonazolu (MFC) se snížila z průměrných 254,67 μg/ml na průměrných 66,62 μg/ml. Bylo zjištěno, že terpinen-4-ol je účinnější než TTO a silně zvyšuje aktivitu flukonazolu proti flukonazol-rezistentním kmenům C. albicans. Výsledky této studie ukazují, že kombinace přírodních látek, jako je TTO, a konvenčního léčiva, jako je flukonazol, může pomoci léčit obtížné kvasinkové infekce.

1. Úvod

Esenciální oleje jsou antiseptické látky produkované rostlinami. Tea tree oil (TTO) je esenciální olej získaný parní destilací z australské původní rostliny Melaleuca alternifolia a používá se v lékařství jako lokální antiseptikum. Má široké spektrum antimikrobiální účinnosti proti široké škále bakterií, virů a plísní, včetně kvasinek a dermatofytů. TTO je směs více než 100 různých sloučenin, především terpenů (především monoterpenů a seskviterpenů). Fyzikální vlastnosti a chemické složení TTO jsou proměnlivé, a proto je důležité stanovit mezinárodní normy. Australská norma pro tea tree oil (AS 2782-1985) obsahuje směrnice týkající se obsahu dvou složek: minimální obsah terpinen-4-olu by měl být nejméně 30 % a maximální obsah 1,8-cineolu by měl být nižší než 15 % objemu oleje . Mezinárodní norma pro tea tree oil (ISO 4730:2004) obsahuje maximální a minimální procentuální hodnoty pro 15 nejdůležitějších složek TTO. TTO získaný parní destilací listů a koncových větví Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller a dalších druhů Melaleuca by měl této normě vyhovovat .

TTO se po staletí používá v australském lidovém léčitelství, převážně k ošetření ran . Ve 20. letech 20. století Penfold poprvé popsal vlastnosti a chemické složení TTO a později potvrdil antiseptické vlastnosti TTO a jeho složek . Ve 30. letech 20. století se postupně objevily publikace, které prokázaly silnou antimikrobiální aktivitu TTO při použití v inhalační terapii, aseptické chirurgii, zubní chirurgii, dezinfekci ran a výplachu ústní dutiny .

V současné době se TTO používá jako lokální prostředek k léčbě různých onemocnění, převážně dermatóz (např. recidivující herpes labialis, akné, puchýřky, lupy a vyrážky). TTO se také používá k léčbě infekcí způsobených Staphylococcus aureus v dutině ústní a hltanu, vaginitidy a onemocnění dýchacích cest. Četné studie potvrdily širokou antimikrobiální aktivitu TTO proti bakteriím, plísním a virům i mikroorganismům, které jsou rezistentní vůči běžným léčivům . To je důležité vzhledem k nárůstu obtížně léčitelných infekcí, protože TTO lze použít jako alternativu ke konvenčním léčivům (včetně antibiotik a chemoterapeutik) nebo v kombinaci s nimi.

Léčba infekcí může být založena na monoterapii (použití jednoho antimikrobiálního léčiva) nebo kombinované léčbě (dvě nebo více léčiv). Hlavním cílem kombinované léčby je posílit účinek léčiv při současném snížení dávek, a to prostřednictvím synergismu. Pokud je monoterapie nebo kombinovaná léčba založená na konvenčních lécích neúspěšná, může být účinnější kombinovaná léčba zahrnující přírodní látku. Několik nedávných studií uvádí zvýšenou antimikrobiální aktivitu přírodních látek v kombinaci s konvenčními léčivy ve srovnání se samotnou léčbou konvenčními léčivy .

Cílem této studie bylo zhodnotit aktivitu flukonazolu vůči klinickým kmenům Candida albicans rezistentním vůči flukonazolu a referenčnímu kmeni C. albicans ATCC 10231 po jejich vystavení subletálním koncentracím TTO nebo jeho hlavní bioaktivní složce terpinen-4-olu.

2. Materiály a metody

2.1. Metodika

2.2. Příprava a použití TTO Kmeny Candida albicans

Tato studie zahrnovala 32 klinických kmenů Candida albicans, které byly izolovány z následujících materiálů: stěrů z hltanu a dutiny ústní (), pochvy (), sputa () nebo stolice (). Tyto kmeny byly izolovány z kultury na Sabouraudově agaru (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Francie) a druhová identifikace byla provedena pomocí biochemického testu ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Francie). Použili jsme také referenční kmen C. albicans ATCC 10231, který byl zakoupen u společnosti Oxoid Ltd. (Basingstoke, Velká Británie). Předtím jsme stanovili citlivost kmenů C. albicans k flukonazolu pomocí Kirby-Bauerova diskového difuzního testu citlivosti s použitím disků z filtračního papíru o průměru 6 mm napuštěných 10 μg flukonazolu, které jsme získali od společnosti DHN (Krakov, Polsko), a agaru YNB (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5 %, glukóza 3 %, agar 1,8 %, pH = 7), který jsme rovněž získali od společnosti DHN (Krakov, Polsko). Kmeny C. albicans byly klasifikovány jako vykazující citlivost (průměr zóny inhibice růstu ≥18 mm), střední citlivost (průměr zóny inhibice růstu od 14 mm do 17 mm) nebo rezistenci (průměr zóny inhibice růstu <14 mm) k flukonazolu (údaje byly popsány v kapitole 3). Hodnoty MIC flukonazolu (minimální inhibiční koncentrace) a MFC (minimální fungicidní koncentrace) byly stanoveny metodou bujónového ředění podle dokumentu CLSI M27-A3-2008 (Clinical and Laboratory Standards Institute) . Pomocí této normy byly kmeny C. albicans klasifikovány jako vykazující citlivost (MIC ≤ 8 μg/ml), střední citlivost (MIC od 9 μg/ml do 63 μg/ml) nebo rezistenci (MIC ≥ 64 μg/ml) k flukonazolu (údaje byly uvedeny v kapitole 3).

2.2. Kmeny C. albicans byly klasifikovány jako citlivé (MIC ≤ 8 μg/ml), středně citlivé (MIC od 9 μg/ml do 63 μg/ml) nebo rezistentní (MIC ≥ 64 μg/ml). Tea Tree Oil (TTO)

V této studii jsme použili australský tea tree oil (Melaleuca alternifolia) od společnosti Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Austrálie) série 270930, který odpovídá normě ISO 4730:2004 (tabulka 1). TTO byl destilován ze speciálně vybraných listů Melaleuca alternifolia, rostliny pocházející z pobřežních oblastí severního Nového Jižního Walesu a jihovýchodního Queenslandu v Austrálii. Analýza složení TTO byla provedena plynovou chromatografií podle mezinárodní normy ISO 4730. Byla provedena za těchto podmínek: kolona z taveného křemíku (50 m × 0,20 mm i.d., tloušťka vrstvy 0,25 μm) a plamenoionizační typ detektoru, nosným plynem byl vodík (průtok 1 ml/min), teplotní program pece byl od 70 °C do 220 °C rychlostí 2 °C/min, teplota injektoru byla 230 °C, teplota detektoru byla 250 °C, objem nastříknutého TTO byl 0,2 μl a poměr dělení byl 1 : 100.

V naší studii jsme také použili terpinen-4-ol, který byl získán od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3. Flukonazol

V této studii jsme použili antimykotikum flukonazol (Polfarmex, Kutno, Polsko). Struktura molekuly flukonazolu je znázorněna na obrázku 1.

Obrázek 1

Chemická struktura flukonazolu .

2.4 Struktura flukonazolu. Příprava výchozí suspenze Candida albicans

Buňky C. albicans kultivované 24 h na Sabouraudově agaru byly suspendovány ve fyziologickém roztoku (0,85 % NaCl) a upraveny na standardní hustotu 0,5 McFarland (1,5 × 108 CFU/ml). Tato suspenze byla později zředěna na hustotu 6 × 104 CFU/ml. Suspenze byla poté použita k odhadu hodnot MIC a MFC pro TTO, terpinen-4-ol a flukonazol.

2,5. Stanovení hodnot MIC a MFC pro TTO a terpinen-4-ol

Aktivita TTO vůči testovaným kmenům C. albicans byla stanovena bujónovým makroředěním za použití obecných standardů ředění podle normy PN-EN ISO 20776-1:2007 . TTO byl sériově ředěn v tekutém Sabouraudově médiu s 10 % Tween 80 na konečné koncentrace TTO 1 % až 0,0075 %. Detergent Tween 80 pomáhá rozpouštět TTO. Do každé zkumavky byl přidán stejný objem suspenze C. albicans, aby se dosáhlo konečné hustoty 3 × 103 CFU/ml. Po 24 hodinách inkubace při 35 °C byl vizuálně posouzen růst buněk ve zkumavkách s TTO a v pozitivní kontrolní zkumavce (bez TTO). MIC byla definována jako nejnižší koncentrace TTO, která nevedla k viditelnému růstu testovaných buněčných kmenů. Hodnota MFC byla definována jako nejnižší koncentrace TTO, která nevykazovala žádný růst kolonií C. albicans. Experiment byl proveden třikrát. Hodnoty MIC a MFC terpinen-4-olu byly stanoveny identicky, jak je popsáno výše. MIC TTO a terpinen-4-olu byly použity pro výpočet subletálních dávek TTO a terpinen-4-olu použitých v následujících pokusech.

2.6. Krátká předúprava Candida albicans s 1/4 MIC TTO

Pro každý vzorek byla připravena zkumavka obsahující fyziologický roztok s 10% Tween 80 a TTO na konečnou koncentraci 1/4 MIC TTO. Byla také připravena kontrolní zkumavka bez TTO. Poté byla do zkumavek přidána suspenze C. albicans, aby se dosáhlo konečné hustoty 3 × 103 CFU/ml. Suspenze byly poté inkubovány při 35 °C po dobu 30 minut. Vzorky byly poté dvakrát propláchnuty a mezi proplachy centrifugovány (3000 ×g, 15 minut) a buňky byly resuspendovány na hustotu 6 × 104 CFU/ml. Suspenze byla poté použita ke stanovení MIC flukonazolu a minimální fungicidní koncentrace (MFC) flukonazolu. Studie byla provedena ve třech opakováních.

2.7. Stanovení hodnot MIC a MFC flukonazolu po krátkém předléčení Candida albicans s 1/4 MIC TTO

Aktivita flukonazolu proti testovaným kmenům C. albicans byla stanovena bujónovým makroředěním s použitím obecných standardů ředění podle normy PN-EN ISO 20776-1:2007 . V tekutém Sabouraudově médiu byly připraveny sériové paralelní ředění flukonazolu v rozmezí od 256,0 μg/ml do 0,125 μg/ml a byla zařazena kontrolní zkumavka bez léčiva. Do každé zkumavky byl přidán stejný objem suspenze buněk C. albicans předléčených 1/4 MIC TTO a inokulum bylo upraveno na konečnou hustotu 3 × 103 CFU/ml. Po 24 hodinách inkubace při 35 °C byl růst buněk v každé zkumavce hodnocen vizuálně. Hodnota MIC byla definována jako nejnižší koncentrace flukonazolu, která nevedla k viditelnému růstu testovaných kmenů. Buňky ze zkumavky označené jako MIC, stejně jako několik okolních ředění, byly naneseny na Sabouraudův agar. Po 24 hodinách inkubace při 35 °C byly spočítány kolonie C. albicans. Hodnota MFC byla definována jako nejnižší koncentrace flukonazolu, při které nedošlo k růstu kolonií C. albicans. Experiment byl proveden ve třech opakováních. Kmeny C. albicans byly klasifikovány jako vykazující citlivost, střední citlivost nebo rezistenci k flukonazolu podle dokumentu CLSI M27-A3-2008 , jak je popsáno v oddíle 2.1.

2.8. Dlouhodobé předléčení Candida albicans flukonazolem a subletální dávkou TTO nebo terpinen-4-olu

Sériové, paralelní ředění flukonazolu v rozmezí od 256,0 μg/ml do 0,125 μg/ml bylo připraveno v tekutém Sabouraudově kultivačním médiu. Byly zahrnuty dvě pozitivní kontroly. Všechny zkumavky obsahovaly 10% Tween 80 a do každého ředění a jedné z kontrolních zkumavek byl přidán TTO, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 1/4 MIC TTO. Druhá kontrolní zkumavka obsahovala pouze tekuté médium. Poté byl do každé zkumavky přidán stejný objem suspenze C. albicans na konečnou hustotu 3 × 103 CFU/ml. Všechny zkumavky byly inkubovány při 35 °C po dobu 24 h. Po inkubaci byl vizuálně vyhodnocen růst buněk v každé zkumavce a byly stanoveny hodnoty MIC a MFC flukonazolu, jak bylo popsáno dříve. Buňky ze zkumavky označené jako MIC, stejně jako několik okolních ředění, byly naneseny na Sabouraudův agar. Po 24 hodinách inkubace při 35 °C byly spočítány kolonie C. albicans a byla stanovena hodnota MFC flukonazolu. Experiment byl proveden ve třech opakováních. Prodloužená předúprava C. albicans flukonazolem a terpinen-4-olem byla provedena identicky, jak je popsáno výše.

2.9. Předběžná úprava C. albicans flukonazolem a terpinen-4-olem. Statistické metody

Výsledky jsou prezentovány jako aritmetický průměr a medián. Statistické rozdíly mezi průměrnými hodnotami byly stanoveny Studentovým testem a Mannovým-Whitneyovým testem v závislosti na tom, jak dobře výsledky odpovídaly normálnímu rozdělení. Hodnoty větší než byly považovány za statisticky významné. Ke statistické analýze byl použit program STATISTICA verze 10 (StatSoft, Krakov, Polsko).

3. Výsledky

Testované kmeny Candida albicans byly rezistentní k flukonazolu a citlivé k nízkým koncentracím TTO. Klinické kmeny C. albicans a referenční kmen C. albicans ATCC 10231, testované pomocí Kirby-Bauerova diskového difuzního testu citlivosti, nevykazovaly zónu inhibice růstu. Všechny studované kmeny C. albicans byly klasifikovány jako vykazující rezistenci k flukonazolu. Hodnoty MIC flukonazolu pro 32 klinických kmenů C. albicans se pohybovaly od 64,0 μg/ml do 256,0 μg/ml (průměr = 244,0 ± 47,22 μg/ml). Nejčastější hodnoty byly 256,0 μg/ml (30 kmenů) a 64,0 μg/ml (2 kmeny). U referenčního kmene C. albicans ATCC 10231 byla MIC flukonazolu 256,0 μg/ml.

MIC TTO pro 32 klinických kmenů C. albicans se pohybovaly od 0,06 % do 0,5 % (průměr = 0,19 ± 0,09 %). Nejčastější hodnoty byly 0,125 % (15 kmenů) a 0,25 % (15 kmenů). MIC TTO dvou zbývajících kmenů byly 0,06 % a 0,5 %. Pro referenční kmen C. albicans ATCC 10231 byla MIC TTO 0,125 %. Tyto výsledky naznačují, že testované kmeny C. albicans nevykazovaly žádnou zkříženou rezistenci k TTO a flukonazolu. Hodnoty MIC TTO byly použity pro výpočet subletálních dávek (1/4 MIC TTO) použitých ve zbytku studie.

Krátká předběžná úprava 32 klinických kmenů C. albicans a referenčního kmene C. albicans ATCC 10231 pomocí 1/4 MIC TTO nezměnila hodnoty MIC a MFC flukonazolu. Vystavení kmenů C. albicans působení 1/4 MIC TTO a flukonazolu po dobu 24 hodin (prodloužená předběžná úprava) významně zvýšilo citlivost kmenů kvasinek k flukonazolu. Z 32 klinických kmenů C. albicans rezistentních k flukonazolu pak 28 kmenů (87,5 %) vykazovalo vysokou nebo střední citlivost k flukonazolu (tabulka 2).

Expozice flukonazol-rezistentních kmenů C. albicans po dobu 24 h 1/4 MIC TTO a flukonazolu zvýšila aktivitu flukonazolu vůči těmto kmenům. Celkem 62,5 % izolátů bylo klasifikováno jako citlivých, 25,0 % vykazovalo střední citlivost a 12,5 % bylo rezistentních. U všech testovaných klinických kmenů se průměrná MIC flukonazolu po této prodloužené předběžné úpravě snížila z 244,0 μg/ml na 38,46 μg/ml a průměrná MFC flukonazolu se snížila z 254,67 μg/ml na 66,62 μg/ml (tabulka 3). Hodnoty MIC a MFC pro citlivé kmeny () a kmeny se střední citlivostí () byly statisticky nízké ve srovnání s analogickými hodnotami získanými pro kontrolní vzorek a pro vzorky, které byly pouze krátce předléčeny TTO. U skupiny citlivých izolátů klesla MIC flukonazolu v průměru na 0,52 μg/ml a MFC flukonazolu v průměru na 4,25 μg/ml. Dlouhodobé předléčení standardního kmene Candida albicans ATCC 10231 s 1/4 MIC TTO a flukonazolem nezvýšilo citlivost tohoto kmene k flukonazolu, stejně jako u čtyř studovaných klinických kmenů C. albicans rezistentních k flukonazolu.

Terpinen-4-ol, hlavní bioaktivní složka přítomná v TTO, silně zvyšoval aktivitu flukonazolu proti flukonazol-rezistentním kmenům C. albicans. MIC terpinen-4-olu pro klinické kmeny C. albicans se pohybovaly od 0,06 % do 0,25 % (průměr = 0,11 ± 0,09 %). Pro standardní kmen C. albicans ATCC 10231 byla MIC terpinen-4-olu 0,06 %. Testované kmeny C. albicans nevykazovaly žádnou zkříženou rezistenci k terpinen-4-olu a flukonazolu. Vystavení klinických a standardních kmenů C. albicans rezistentních vůči flukonazolu po dobu 24 hodin flukonazolu a subletálním dávkám (1/4 MIC) terpinen-4-olu silně zvýšilo aktivitu flukonazolu vůči těmto kmenům a všechny izoláty C. albicans byly klasifikovány jako citlivé (MIC flukonazolu klesla na 0,125 μg/ml). Výsledky této studie jsme shrnuli a nejdůležitější údaje jsou uvedeny ve formě tabulky (Tabulka 4).

4. Diskuse

TTO je nejčastěji používaný éterický olej pro své antibakteriální a antimykotické vlastnosti . V této studii jsme hodnotili změnu aktivity flukonazolu in vitro proti klinickým kmenům Candida albicans rezistentním k flukonazolu, které byly vystaveny subletálním koncentracím TTO nebo terpinen-4-olu, hlavní bioaktivní složky TTO. Dřívější studie citlivosti Candida spp. na TTO in vitro ukázaly, že TTO je vysoce aktivní proti těmto mikrobům, stejně jako proti kmenům rezistentním k azolům, u nichž se MIC TTO pohybovaly od 0,25 % do 0,5 % . U kmenů C. albicans, které byly rezistentní k flukonazolu i itrakonazolu, se MIC TTO pohybovaly od 0,25 do 1,0 %, MIC50 TTO byla 0,5 % a MIC90 TTO byla 1 % . Jiná studie ukázala, že tři klinické kmeny C. albicans rezistentní k flukonazolu měly velmi nízké MIC TTO (0,15 % u dvou kmenů a 0,07 % u třetího kmene) .

Pokusy provedené v této studii potvrzují výsledky dříve publikovaných studií v tom, že všechny testované kmeny C. albicans rezistentní k flukonazolu byly citlivé k TTO . Stanovené MIC TTO byly nízké a pohybovaly se od 0,06 % do 0,5 %. Antimikrobiální aktivita TTO se připisuje především terpinen-4-olu, hlavní bioaktivní složce přítomné v TTO . Stanovené hodnoty MIC pro terpinen-4-ol byly velmi nízké a pohybovaly se od 0,06 % do 0,25 %. Naše studie a další studie ukazují, že C. albicans nevykazuje zkříženou rezistenci vůči TTO a azolovým látkám . Klinická rezistence k TTO nebyla zaznamenána. Vícesložková povaha TTO může snižovat možnost spontánního vzniku rezistence a k překonání všech antimikrobiálních účinků jednotlivých složek může být zapotřebí více současných mutací . TTO lze tedy použít jako lokální antiseptikum k účinné léčbě povrchových mykóz způsobených Candida spp. rezistentními na flukonazol a jinými kvasinkami rezistentními na azoly. Bohužel TTO může být při požití vysokých dávek potenciálně toxický, a proto by se TTO neměl podávat perorálně. Akutní orální toxicita TTO je podobná orální toxicitě jiných běžných esenciálních olejů, jako je například eukalyptový olej . Lipofilní povaha TTO, která mu umožňuje pronikat do vnějších vrstev kůže, posiluje nejen antiseptické účinky, ale také možnost toxicity TTO v důsledku dermální absorpce. TTO může při vyšších koncentracích způsobit podráždění kůže a u predisponovaných jedinců může vyvolat alergické reakce . Zhang a Robertson pozorovali ototoxický účinek 100% TTO . Toxicita TTO je závislá na dávce a většině nežádoucích účinků lze předejít použitím TTO ve zředěné formě . TTO není mutagenní ani genotoxický .

Zvyšuje se zájem nejen o aktivitu přírodních látek proti rezistentním mikrobům, ale také o synergické interakce mezi těmito látkami a konvenčními léčivy . Flukonazol je jedním z azolových antimykotik široce používaných jak k profylaxi, tak k terapii infekcí vyvolaných kandidami . V této studii jsme zkoumali změny v aktivitě flukonazolu vůči flukonazol-rezistentním kmenům C. albicans po vystavení subletálním koncentracím TTO nebo terpinen-4-olu. Použili jsme výhradně kmeny rezistentní k flukonazolu, protože identifikace synergické léčby těchto kmenů by byla obzvláště důležitá. Testovali jsme subletální koncentrace TTO a terpinen-4-olu, protože jsme očekávali, že koncentrace nižší než MIC oslabí buněčnou strukturu, aniž by došlo k usmrcení buněk, což usnadní působení flukonazolu a následně potlačí rezistenci C. albicans vůči flukonazolu. Naše výsledky ukazují, že krátké (0,5 h) vystavení kmenů C. albicans rezistentních vůči flukonazolu subletální koncentraci TTO (1/4 MIC TTO) nemělo žádný vliv na antimykotickou aktivitu flukonazolu. Vystavení buněk C. albicans subletální koncentraci TTO a následné ošetření flukonazolem však inhibovalo rezistenci k flukonazolu u 87,5 % testovaných kmenů. Tyto výsledky naznačují, že existuje synergická interakce mezi flukonazolem a TTO proti C. albicans rezistentnímu vůči flukonazolu. TTO byl použit k permeabilizaci membrán kvasinkových buněk, což výrazně zvýšilo citlivost k flukonazolu. TTO se usazuje v lipidové dvojvrstvě membrány, čímž narušuje její strukturu, což má za následek zvýšenou propustnost a zhoršenou fyziologickou funkci. TTO také inhibuje tvorbu zárodečných trubic nebo přeměnu mycelia u C. albicans a inhibuje dýchání u C. albicans v závislosti na dávce. Houbové buňky vystavené působení TTO nakonec prasknou. Subletální koncentrace TTO rovněž oslabují vitalitu buněk Candida spp. Mechanismus antifungální aktivity flukonazolu je odlišný. Bylo prokázáno, že flukonazol zasahuje do enzymu C-14α-demetylázy závislého na cytochromu P-450, který je zodpovědný za produkci ergosterolu. Narušení syntézy ergosterolu způsobuje strukturální a funkční změny v buněčné membráně houby, které předurčují buňky houby k poškození. Inhibice cytochromových oxidačních a peroxidačních enzymů je další antifungální aktivitou flukonazolu . Bylo popsáno několik mechanismů rezistence k flukonazolu u izolátů C. albicans: zvýšená produkce lanosterol 14α-demetylázy kódované genem ERG11 a snížení afinity lanosterol 14α-demetylázy k flukonazolu v důsledku mutací v genu ERG11 a defekt Δ5-6 desaturázy kódované genem ERG3 způsobující ztrátu funkce v ergosterolové dráze. Dalším mechanismem rezistence k flukonazolu u C. albicans je aktivní transport léčiv přes plazmatickou membránu pomocí „efluxních pump“, který vyžaduje expresi genů CDR1/2 a MDR1 . Poškození buněčné membrány vyvolané TTO může narušit funkci „efluxních pump“, a tím učinit houbovou buňku citlivější k flukonazolu .

Naše údaje ukazují, že in vitro existuje synergický účinek subletálních koncentrací TTO a flukonazolu proti kmenům C. albicans rezistentním k flukonazolu. U standardního kmene C. albicans ATCC 10231 rezistentního k flukonazolu a čtyř klinických kmenů C. albicans se však citlivost k flukonazolu nezvýšila. Pravděpodobnou příčinou tohoto účinku byly rozdíly v mechanismech rezistence těchto kmenů k flukonazolu. V naší studii in vitro byla hlavní složka TTO terpinen-4-ol aktivnější než TTO a silně zvyšovala aktivitu flukonazolu proti všem studovaným kmenům C. albicans rezistentním k flukonazolu. Mondello et al. stejně jako Ninomiya et al. pozorovali, že in vivo byly TTO a terpinen-4-ol podobně účinné proti kandidóze způsobené azol-rezistentním C. albicans. Mechanismy, které jsou základem synergie mezi flukonazolem a TTO, neobjasnili. Yu et al. potvrdili synergismus mezi flukonazolem a triklosanem proti klinickým izolátům C. albicans rezistentním na flukonazol. Liu et al. pozorovali synergický účinek mezi flukonazolem a glabridinem proti C. albicans související s účinkem glabridinu na buněčný obal. Ahmad et al. popsali synergickou aktivitu thymolu a karvakrolu s flukonazolem proti izolátům Candida. Oba monoterpeny inhibovaly eflux o 70-90 %, což ukazuje na jejich vysokou účinnost blokovat lékové transportní pumpy.

Předchozí studie také hodnotily aktivitu TTO proti různým mikroorganismům v kombinaci s jinými antimikrobiálními látkami. Byl pozorován synergický účinek itrakonazolu a TTO v termosenzitivním gelu používaném k léčbě vaginální kandidózy . Synergické účinky byly pozorovány také mezi éterickými oleji a ciprofloxacinem, gentamicinem, cefiximem a pristinamycinem . V diskovém difuzním testu s C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii a C. parapsilosis se kolem disků impregnovaných TTO a amfotericinem B objevily větší zóny inhibice růstu než kolem disků obsahujících pouze TTO . Ve studii Staphylococcus aureus se objevily větší zóny inhibice růstu kolem disků impregnovaných TTO a dalšími esenciálními oleji ve srovnání s disky impregnovanými pouze TTO .

Syntetický účinek antimikrobiálních látek byl rovněž prokázán pomocí časových křivek zabití. Krátká předběžná úprava Pseudomonas aeruginosa látkou, která narušuje cytoplazmatickou membránu (karbonylkyanid m-chlorfenylhydrazon, nonapeptid polymyxinu B nebo kyselina ethylendiamintetraoctová), zvýšila baktericidní aktivitu TTO, což se projevilo zvýšenou rychlostí usmrcení mikroba v křivkách časového zabíjení . Ve studii s použitím metody E-test však Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus a koaguláza-negativní stafylokoky (CoNS) vystavené subletálním koncentracím TTO po dobu 72 hodin vykazovaly zvýšenou rezistenci vůči gentamicinu, streptomycin, chloramfenikol, tetracyklin, erytromycin, trimethoprim, ampicilin, kyselinu fusidovou, mupirocin, linezolid a vankomycin . Zvýšená antimikrobiální aktivita byla pozorována při kombinaci esenciálních olejů s jejich izolovanými složkami (např. terpinen-4-ol z Melaleuca alternifolia) a při kombinaci TTO s ionty stříbra .

Index frakční inhibiční koncentrace (FIC), označovaný také jako FICI, se používá k určení, zda jsou dvě látky synergické nebo antagonistické. Hodnoty FIC lze interpretovat různě, obecně však platí, že index FIC nižší než 0,5 znamená synergismus a index FIC vyšší než 4 znamená antagonismus . Hodnota indexu FIC pro TTO a tobramycin byla 0,37 pro Escherichia coli a 0,62 pro Staphylococcus aureus, což naznačuje, že tyto dvě látky jsou synergické . Menší synergický účinek byl pozorován při léčbě Candida albicans pomocí TTO a amfotericinu B a Klebsiella pneumoniae pomocí TTO a ciprofloxacinu. TTO a ciprofloxacin vykazují antagonistické účinky proti Staphylococcus aureus . Neexistuje synergický účinek mezi TTO a lysostafinem, mupirocinem, gentamicinem nebo vankomycinem proti meticilin-rezistentním kmenům Staphylococcus aureus. Ve skutečnosti index FIC ukázal, že TTO a vankomycin jsou antagonistické .

Výsledky této studie a dalších předchozích studií ukazují, že kombinace přírodních látek, jako je TTO, a konvenčních léčiv, jako je flukonazol, může pomoci léčit obtížné kvasinkové infekce. K identifikaci antimikrobiální aktivity přírodních léčivých látek a odhalení synergických interakcí s běžně používanými antimikrobiálními látkami jsou však zapotřebí další studie in vitro.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.

Poděkování

Autoři by rádi poděkovali společnosti MELALEUCA v Gliwicích (Polsko) za laskavé poskytnutí oleje z australského čajovníku získaného z Melaleuca alternifolia, společnosti Polfarmex v Kutně (Polsko) za laskavé poskytnutí flukonazolu a mikrobiologické laboratoři LABOMED v Gliwicích (Polsko) za laskavé poskytnutí klinických kmenů Candida albicans použitých v této studii.

Poděkování

Autoři by rádi poděkovali společnosti MELALEUCA v Gliwicích (Polsko) za laskavé poskytnutí klinických kmenů Candida albicans použitých v této studii.