Lidští účastníci

Experimenty ve Španělsku byly posouzeny a schváleny etickou komisí Univerzitní nemocnice La Fe ve Valencii a dodržovaly zásady Helsinské deklarace a dalších posudků. Experimenty v Berlíně byly schváleny etickou komisí Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA4/012/05). Byly studovány dvě kohorty: jednu tvořilo 65 zdravých dospělých dobrovolníků a druhou 16 pacientů s Usherovým syndromem (typ II) nesoucích různé zkrácené mutace v USH2A. Údaje od tří pacientů byly z této studie vynechány, protože dva pacienti měli dříve diagnostikovaný diabetes a jeden pacient trpěl syndromem karpálního tunelu, který by mohl ovlivnit psychofyzické prahy. Účastníci studie byli testováni pomocí baterie sestávající z devíti psychofyzických testů aplikovaných na kůži. Všichni účastníci obdrželi před účastí ve studii písemné a ústní informace a poskytli písemný souhlas. Žádný z účastníků studie nebyl ve věku <20 let. Byly zdokumentovány následující informace o účastnících: věk, pohlaví, rukopis, sluchová zařízení (sluchadla, kochleární implantáty), závažnost příznaků hluchoty a slepoty a komorbidity.

Kvantitativní senzorické testování člověka

Psychofyzické testování bylo provedeno podle standardizovaného testovacího protokolu kvantitativního senzorického testování Německé výzkumné sítě pro neuropatickou bolest44. Prahy vibrotaktilního vnímání při různých frekvencích byly stanoveny pomocí testu se dvěma možnostmi volby1,2. Zařízení se skládalo z lineárního piezoelektrického aktuátoru (Physik Instrumente, katalogové číslo P-602.1 L), jehož posuny jsou řízeny a kontrolovány zesilovačem/regulátorem (Physik Instrumente, katalogové číslo E-665). Signály byly zpracovány systémem sběru dat PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). Vibrační podnět byl dlouhý 1,8 s a doba náběhu a poklesu na začátku a na konci byla 500, resp. 600 ms, nezávisle na testovací frekvenci nebo amplitudě. Doba trvání podnětu mezi fázemi zapnutí a posunu byla 700 ms. Byla použita sada vibračních podnětů, která se logaritmicky škálovala mezi 18 nm a 45 μm. Pro vibrační testy s frekvencí 10 Hz a 125 Hz byla počáteční amplituda nastavena na 7,18 μm a 2,84 μm. Pohyb sondy jsme za použitých zkušebních podmínek přímo neměřili. Tento piezoelektrický aktuátor vykazuje vysokou věrnost, ale teoreticky by mohlo dojít k amplitudovému útlumu při větších amplitudových posuvech v blízkosti maximální amplitudy pohybu aktuátoru (35 μm). Všichni účastníci však vykazovali psychofyzické prahové hodnoty hluboko pod 35 µm pro všechny testované frekvence (obr. 1c). Všimněte si, že pro měření u zdravých kontrol a účastníků s Usherovým syndromem byl použit naprosto stejný přístroj. Mechanické vibrační podněty byly přenášeny na kůži mezi nehtovým lůžkem a prvním kloubem malíčku. Sonda byla vyrobena ze skla a měla plochou kruhovou kontaktní plochu o průměru 5 mm s mosazným protizávažím, aby bylo zajištěno, že u každého účastníka byla použita stejná míra přídržné síly. Malíček dominantní ruky byl testován na dvou frekvencích (10 Hz a 125 Hz; doba trvání 1,8 s). Účastníci signalizovali detekci vibračního podnětu během jednoho ze dvou časových oken stisknutím tlačítka. Protokol se skládal z konstrukce nahoru-dolů, která zvyšovala nebo snižovala amplitudu podnětu (mezi 18 nm a 45 µm) v závislosti na míře úspěšnosti při plnění úkolu. Bylo provedeno osm změn amplitudy nahoru-dolů (celkem ~40-80 jednotlivých pokusů na sezení) v okolí prahu vnímání, aby se vytvořil průměrný práh vnímání pro každého pacienta. Amplituda vibračních podnětů poháněných piezoelektrickým zařízením byla kalibrována měřením amplitudy posunu sondy pod mikroskopem na krokové přírůstky napětí.

K testování mezí prostorového rozlišení konečků prstů (mediánní inervace) byl použit také test taktilní ostrosti pomocí dvouintervalového testu s nucenou volbou orientace taktilní mřížky s taktilní kostkou ostrosti, která se skládala ze šesti stran s mřížkami o různých šířkách (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 a 6,0 mm)1,2,3 . Účastníci měli zavázané oči a kostka byla umístěna ve vertikální nebo horizontální orientaci proti špičce jejich prstu. Byl použit postup dva dolů a jeden nahoru s 10-15 otočnými body velikosti mřížky. Prahové hodnoty (71 % správných odpovědí) byly vypočteny jako medián z posledních 10 z 15 otočných bodů2. Prahy mechanické detekce byly stanoveny pomocí standardizované sady 23 vláken vFh (Optihair3-Set) se silami mezi 0,25 a 265 mN. VFh byly aplikovány ve vzestupném pořadí na dorzální stranu ruky (radiální inervace) po dobu 1 s, dokud účastník nevnímal hmatový vjem. Poté se pořadí měnilo až do okamžiku, kdy účastník nevnímal hmatový vjem. Za prahovou hodnotu byla považována průměrná síla pěti obrácení. Mechanický práh bolesti byl testován pomocí sady sedmi vážených pinprick stimulátorů (MRC Systems) s hroty 0,25 mm a silou mezi 8 a 512 mN. Byla provedena jednoduchá schodišťová metoda (pravidlo jeden nahoru a jeden dolů), kdy byli pacienti dotazováni, zda podnět vnímají jako ostrost, která vyvolává pocit bodavé bolesti. Podněty byly aplikovány na dorzální stranu ruky po úkolech detekce vFh. Prahová hodnota byla vypočtena z průměru pěti reverzací. Tepelné prahy vnímání tepla a chladu a prahy vnímání bolesti za tepla a chladu byly testovány pomocí termosenzorického analyzátoru TSA II (MEDOC). Termoska měla plochu 9 cm2 , mezní teploty mezi 0 a 50 °C a rychlost změny teploty 1 °C s-1. Termoda byla umístěna na volární straně střední části předloktí (mediální antebrachiální inervace). Pro každý termální test byly provedeny tři po sobě jdoucí pokusy v následujícím pořadí: detekce chladu, detekce tepla a prahové hodnoty bolesti za chladu a bolesti za tepla. Účastníci studie byli požádáni, aby uvedli, v jakém okamžiku začali pociťovat chlad, teplo, chladovou a tepelnou bolest. Prahové hodnoty představovaly průměrnou teplotu tří pokusů v každém testu.

Myši

Všechny pokusy byly schváleny berlínskou etickou komisí pro zvířata (Landesamt für Gesundheit und Soziales) a byly provedeny v souladu s evropskými zákony na ochranu zvířat. Byli použiti samci a samice Ush2a-/- myší a mláďata divokého typu (Ush2a+/+) z pozadí CBA/CaJ ve věku 10 až 30 týdnů11. Všechny anatomické a elektrofyziologické experimenty byly prováděny na přibližně stejném počtu myších samic nebo samců. Pro úkol detekce vibrací byly použity pouze myší samice. Všechny myši byly udržovány v cyklu 12 h světlo:12 h tma.

Anatomie myší tkáně a imunohistochemie

Pro imunohistochemii kůže byly myši eutanazovány inhalací CO2 po dobu 2-4 minut s následnou krční dislokací a byla vypreparována tkáň tlapky a odstraněna podkoží, vazy a připojená svalová tkáň. Vzorky kůže byly roztaženy pomocí hmyzích špendlíků a fixovány po dobu 45 minut ve 4% paraformaldehydu (PFA). Pro řez vibratomem se vzorky tkáně vložily do embedovacích forem (Polysciences, T-8), naplnily se teplou želatinou (20 %, rozpuštěnou v 0,1 M fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS)) a následně se fixovaly ve 4 % PFA přes noc při 4 °C, než se pomocí vibratomu (Leica, VT100S) vyřízly 120 μm řezy. Pro celoplošné barvení byly vzorky kůže nataženy na 2 h v PFA a poté postfixovány při 4 °C po dobu 24 h ve 20% dimethylsulfoxidu a 80% methanolu. Po nařezání nebo postfixaci byly vzorky tkáně třikrát promyty v PBS (0,1 M) a inkubovány 72 h při 4 °C v blokovacím roztoku a primárních protilátkách. Vzorky byly poté třikrát promyty v PBS před 24hodinovou inkubací (4 °C) se sekundárními protilátkami zředěnými v blokovacím roztoku. Tkáň byla poté opět třikrát promyta a zpracována pro čištění tkáně pomocí 2,2′-tjodietanolu (TDE, Sigma-Aldrich). Řezy byly každé 2 h umístěny do zvyšujících se koncentrací TDE, od 10 % do 25 %, 50 % a 97 %, ve kterých byly vzorky uloženy a upevněny na sklíčka a krycí sklíčka.

Polyklonální protilátky zaměřené na Ush2A byly vytvořeny u králíka společností Eurogentec. Byly vytvořeny čtyři protilátky, které se vážou na různé vazebné epitopy na N- a C-konci Ush2A (N-konec: protilátka 1, CSPLYNDKPFRSGDNV a protilátka 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-konec: protilátka 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR a protilátka 2, CIRERPPLVPLQKRMT) a před použitím byly přečištěny z antisér. Všechny čtyři protilátky byly použity společně (1:200) pro protokoly barvení v sekvenčním barvení s kuřecí anti-NF200 (Millipore, 1:1 000), králičí anti-S100 (Dako, 1:1 000) nebo morčecí anti-CK20 (Origene Tech, 1:200). Jako sekundární protilátky byly použity protilátky proti králíkům Alexa Fluor 488 (Invitrogen,1:800), proti slepicím Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), proti myším Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), proti králíkům Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) a proti morčatům Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Snímky s dlaždicovým z-stackem byly získány pomocí konfokálního mikroskopu (Carl-Zeiss, katalogové číslo LSM700) s použitím softwaru Zen2009. NF200+ a S100+ nervová vlákna inervující Meissnerova tělíska a vlasové folikuly byly vizualizovány a spočítány pomocí Fiji/ImageJ. Pro snímky sedacího nervu v elektronovém mikroskopu byla zvířata perfundována a sedací nerv byl vypreparován a fixován ve 4% PFA a 2,5% glutaraldehydu a před vložením do pryskyřice Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) kontrastován tetroxidem osmia. Ultratenké řezy byly pořízeny při zvětšení 5 600×. Myelinizovaná nervová vlákna a nemyelinizovaná vlákna byla spočítána a změřena pomocí softwaru Fiji/ImageJ.

Reprodukovatelnost

Všechny imunohistochemické experimenty a pořízené snímky byly opakovány u více kohort myší v různých dnech a nebyly pořízeny žádné snímky od jednotlivých jedinců, které by nebylo možné reprodukovat. Snímky z elektronové mikroskopie byly pořízeny z různých vrhů v jednom experimentálním cyklu.

Příprava myších kožních nervů a záznamy senzorických aferentů

Záznamy kožních senzorických vláken byly provedeny pomocí preparátu kožních nervů ex vivo. Myši byly eutanazovány inhalací CO2 po dobu 2-4 minut s následnou krční dislokací. V samostatných pokusech byly provedeny tři různé preparáty využívající různé oblasti tlapek: podkožní nerv inervující chlupatou kůži zadní tlapky21; holenní nerv inervující holou kůži zadní tlapky a mediální a loketní nerv inervující holou kůži přední tlapky20. U všech preparátů byla chlupatá kůže končetiny oholena a kůže a nerv byly uvolněny a přeneseny do záznamové komory, kde byly z kůže odstraněny svaly, kosti a šlachy, aby se zlepšila kvalita záznamu. Záznamová komora byla perfundována syntetickou intersticiální tekutinou o teplotě 32 °C: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM glukonát sodný, 5,5 mM glukóza, 7,5 mM sacharóza a 10 mM kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-etansulfonová (Hepes), pH 7,4. Kůže byla připnuta a napnuta tak, aby bylo možné stimulovat vnější stranu kůže pomocí stimulačních sond. Periferní nerv byl veden do sousední komory v minerálním oleji, kde byla z nervu odtržena jemná vlákna a umístěna na záznamovou elektrodu ze stříbrného drátu.

Receptivní pole jednotlivých mechanoreceptorů byla identifikována mechanickým sondováním povrchu kůže tupou skleněnou tyčinkou nebo tupými kleštěmi. Analogový výstup ze zesilovače Neurolog byl filtrován a digitalizován pomocí systému Powerlab 4/30 a softwaru Labchart 7.1 (ADinstruments). K třídění hrotů jednotlivých jednotek bylo použito rozšíření Spike-histogram pro Labchart 7.1. Elektrické podněty (1 Hz, čtvercové impulsy 50-500 ms) byly přivedeny do receptivních polí jednotlivých jednotek, aby bylo možné změřit rychlost vedení a klasifikovat je jako C-vlákna (rychlost <1,2 m s-1), Aδ-vlákna (1,2-10 m s-1) nebo Aβ-vlákna (>10 m s-1). Mechanická stimulace receptivních polí neuronů byla prováděna pomocí piezoelektrického aktuátoru (Physik Instrumente, katalogové číslo P-841.60) a oboustranného nanomotoru (Kleindiek Nanotechnik, katalogové číslo MM-NM3108) připojeného k zařízení pro měření síly (Kleindiek Nanotechnik, katalogové číslo PL-FMS-LS). Kalibrovaná měření síly byla během experimentu pořizována současně pomocí systému Powerlab a softwaru Labchart (rozšířená data, obr. 10).

Jelikož různé typy vláken mají různé vlastnosti ladění podnětů, byly podle typu jednotky použity různé protokoly mechanických podnětů. Nízkoprahová Aβ-vlákna (RAM a SAM) a D-vlákna Aδ byla stimulována piezoelektrickým aktuátorem třemi vibračními stimuly (5 Hz, 25 Hz a 50 Hz, zkreslení vnášené in-series snímačem síly vylučovalo použití frekvencí >50 Hz) se zvyšující se amplitudou v šesti krocích (amplitudy peak-to-peak ~6-65 mN; 20 cyklů na krok) a dynamickou stimulační sekvenci se čtyřmi průběhy rampy a držení s různou rychlostí vychýlení sondy (trvání 3 s; 0.075, 0,15, 0,45 a 1,5 mm s-1; průměrná amplituda 100 mN). Aβ-vlákna SAM a RAM byla klasifikována podle přítomnosti, respektive nepřítomnosti vypalování během statické fáze stimulu typu rampa a držení, jak bylo popsáno dříve20,21 . Jednotlivé jednotky byly navíc stimulovány sérií pěti statických mechanických podnětů s průběhem rampy a držení se zvyšující se amplitudou (trvání 3 s; od ~10 mN do 260 mN). Nízkoprahové SAM, vysokoprahová Aδ-vlákna a C-vlákna byla rovněž stimulována pomocí nanomotoru s pěti ramp-and-hold stimuly se zvyšující se amplitudou20.

Záznamy jednotlivých jednotek z Pacinianových aferentů

Pro posouzení mechanické citlivosti Pacinianových tělísek nacházejících se kolem fibuly byla z dolní končetiny odstraněna kůže a všechny svaly a interoseální nerv byl vypreparován volně z interoseální membrány. Následně byly fibula a tibie, které jsou u myší srostlé podél své distální poloviny, vyjmuty ze zvířete spolu s interoseálním nervem a přeneseny do přizpůsobené komory pro orgánovou lázeň, kde byly upevněny pomocí přizpůsobené miniventilky. Celá pitva se prováděla v ledovém pufru, který obsahoval 108 mM N-methyl-d-glukamin, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM glukonát sodný, 5,5 mM glukózu, 18,5 mM sacharózu a 0,5 mM CaCl2 (upraveno na pH 7,4 pomocí NaOH). Po 10minutovém zotavení byl preparát perfundován okysličeným záznamovým pufrem (35 °C), který se skládal ze 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM glukonátu sodného, 5,5 mM glukózy, 7,5 mM sacharózy a 1,5 mM CaCl2 (upraveno na pH 7,4 pomocí NaOH) a proximální konec interosseálního nervu byl přenesen do olejem naplněné záznamové komory provlečením malým otvorem (průměr ~1 mm), který spojoval komoru orgánové lázně se sousední záznamovou komorou. Po odstranění perineuria byla jednotlivá vlákna uvolněna a připojena k záznamové elektrodě pro záznam akčních potenciálů. Záznamy byly prováděny pomocí systému Neurolog (Digitimer Ltd, katalogová čísla NL100AK a NL104A) a přístroje PowerLab 4SP řízeného programem LabChart 7.1 (AD Instruments). Pro stanovení mechanického aktivačního prahu a frekvenčního ladění paciniánských aferentů byla na distální konec fibuly aplikována série sinusových mechanických podnětů (doba trvání 1 s; lineárně se zvyšující amplituda damp/dt = 30 µm s-1; maximální amplituda 30 µm) se zvyšující se frekvencí (40-480 Hz) pomocí kovové tyčinky (průměr hrotu 1 mm), která byla připojena k piezoelektrickému aktuátoru (Physik Instrumente GmbH, kat. zn. P-840.2).

Úkol učení vnímání vibrací u myší

Nejprve byly myši pro implantaci opěrky hlavy anestetizovány isofluranem (1,5-2 % v O2) a podkožně jim byl aplikován metamizol (200 mg na kg tělesné hmotnosti). Na lebku byla pomocí lepidla (UHU dent) a dentálního cementu (Paladur) implantována podpěra z lehkého kovu. Teplota myší byla monitorována rektální sondou a udržována na 37 °C pomocí vyhřívací podložky. Poté byly myši umístěny do domácí klece s metamizolem (200 mg ml-1) v pitné vodě. Implantované myši byly 3 až 5 dní po operaci zvyklé na opěrku hlavy. Myši byly postupně zvykány v behaviorálním uspořádání na fixaci hlavy. Poté, 1 d po zahájení omezování příjmu vody, podstoupily myši dvě párovací sezení v po sobě jdoucích dnech.

Během párovacích sezení (v délce 30 až 45 min) byla podávána odměna ve formě vody z vodní hubičky v páru s prezentací vibračního podnětu (délka trvání 3 s, 5 Hz, 60 mN) na holou kůži přední tlapy, aby se vytvořila asociace mezi podnětem a odměnou. Vibrační podnět byl na tlapu přiváděn prostřednictvím přizpůsobené skleněné tyčinky s polstrováním o velikosti 2 mm2 připojené k piezoelektrickému aktuátoru (PICMA od společnosti Physik Instrumente, katalogové číslo PL127.11). Vztah mezi napětím a silou byl kalibrován pomocí systému měření síly (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific), který po každém experimentu měřil sinusový profil síly aplikované piezoelektrickým zařízením. Použitý ohybový piezoelektrický aktuátor mohl ve srovnání s jinými skládanými piezoelektrickými systémy přidávat určitý harmonický šum. Kalibrace piezoelektrického zařízení v každém experimentu však zajistila, že podstatné deficity v hmatovém vnímání myší s deficitem Ush2a pravděpodobně nebyly technickým artefaktem.

Po spárování začaly každodenní tréninky, během nichž myši dostávaly malou odměnu vody (4-7 μl) z výlevky, když správně olízly během okna příležitosti na začátku podnětu (3,5 s). Záchytné pokusy, při nichž nebyl předložen žádný podnět a olíznutí bylo počítáno jako falešný poplach, byly prokládány jako 50 % z celkového počtu pokusů. Pokusy nebyly signalizovány žádnou vnější událostí ani podnětem, jak bylo popsáno dříve10 , a byly prováděny v náhodných časových intervalech mezi 3 a 30 s. Pokud myši olízly během okna 2 s před nástupem podnětu, bylo zavedeno zpoždění 3 až 30 s, aby se podpořila asociace podnětu a odměny za vodu. Jedno tréninkové sezení se skládalo z přibližně 60 pokusů (30× podnět + 30× úlovek). Pro posouzení výkonnosti během tréninkových sezení byly porovnány míry zásahů a falešných poplachů. Aby se ověřilo, že myši olizují v reakci na vibrační podnět přední tlapy, bylo na konci výcviku zařazeno jedno sezení, při kterém bylo stimulační zařízení posunuto 3-5 mm pod tlapu, takže nedošlo ke kontaktu s kůží. V dalších experimentálních dnech poté, co se myši úspěšně naučily úkol, byly podávány vibrační podněty s různou amplitudou a frekvencí. Pro vibrace o frekvenci 5 Hz byly ke stimulaci přední tlapy použity síly 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN a 6 mN, přičemž v průběhu každého dne se střídaly dvě různé amplitudy s pokusy o chycení. Například podněty 48 mN a 24 mN a pokusy s chycením se prolínaly během jednoho sezení, které se skládalo z přibližně 100 pokusů (33× podnět 48 mN + 33× podnět 24 mN + 34× chycení). Podněty 6 mN byly testovány během dvou sezení. U vibrací o frekvenci 25 Hz a 125 Hz byly síly 60 mN a 12 mN o stejné frekvenci prokládány pokusy s chycením stejným způsobem během dvou testovacích sezení.

Behaviorální test inhibice párových impulzů u myší

Odezva myší na startle byla hodnocena pomocí systému Startle Response (SR-LAB, San Diego Instruments). Myši byly na přístroj zvyklé 30 minut každý den po dobu 3 d před testováním. Stručně řečeno, reakce myší na startle byly měřeny během celkem 48 pokusů se samostatným impulsem45 (trvání 40 ms, 129 dB) a pokusů s prepulsem + impulsem (20 ms prepulsu o síle 69, 73 nebo 81 dB). Pokusy s předimpulsem probíhaly 200 ms před pokusy s impulsem. Procento inhibice párového impulsu (% PPI) pro každou intenzitu prepulsu bylo vypočteno jako %PPI = 100 × ((samotný impuls) – (prepuls + impuls))/samotný impuls.

Myší vFh a kartáčové behaviorální testy

Myši byly před testováním zvyklé na testovací prostředí po dobu 30 minut každý den po dobu 3 dnů. V experimentálních dnech byly myši umístěny do jednotlivých boxů z plexiskla na vyvýšené plošině z pletiva. Při kartáčovém testu byla levá zadní tlapka pohlazena od paty k patě 2mm hlavičkou štětce 10× v náhodných intervalech. Vypočítalo se procento stažení. V následujících testovacích dnech byly měřeny mechanické nocifenzivní prahy stažení pomocí vFhs. Stručně řečeno, plantární plochy levé zadní tlapy byly stimulovány vlákny vFh a reflexní práh byl stanoven pomocí metody up-down46. V závislosti na reakci zvířete byly na zadní tlapu aplikovány vFh s vyšší nebo nižší silou, aby se vytvořila série šesti až devíti pozitivních nebo negativních reflexních stažení. Tento vzorec odpovědí byl poté převeden tak, že údaje jsou vyjádřeny jako logaritmus průměru 50% prahu reflexního stažení46.

Analýza údajů z lidské psychofyziky

Údaje byly testovány na normalitu a rozdíly v psychofyzickém výkonu pro každý test mezi kontrolními účastníky a pacienty s Usherovým syndromem byly porovnány pomocí nepárového Studentova t-testu nebo Mannova-Whitneyho U-testu. K porovnání jednotlivých individuálních datových profilů s průměrem a s.d. zdravých kontrol byly použity z-transformace. Z-skóre bylo vypočteno pomocí tabulkového procesoru Excel na základě vzorce z = (skóre pacienta – průměr skupiny na s.d. průměru skupiny). Hodnoty z >0 znamenají zisk funkce, což znamená, že účastník je citlivější na testované podněty ve srovnání se zdravými kontrolami. Jednotlivá z-skóre ležící mimo 95% interval spolehlivosti (tj. z-skóre <1,96 nebo >1,96 s.d.) souboru dat zdravých kontrol lze identifikovat. Výkony v každém testu byly testovány v párových srovnáních pomocí Mannova-Whitneyho U-testu a za statisticky významné jsme považovali P < 0,01.

Analýza dat vibračního chování myší

Kiksy byly zaznamenány pomocí senzoru na špičce výtoku vodní odměny. Při stimulačních pokusech byl zásah započítán, když došlo k olíznutí v rámci okna příležitosti (3,5 s) po začátku stimulu. Behaviorální data byla shromažďována pomocí upravených rutin v Lab View při vzorkovací frekvenci 1 kHz a k analýze byly použity upravené skripty v jazyce Python. Během pokusů s chycením došlo k falešnému poplachu, když došlo k olíznutí během stejně dlouhého okna příležitosti. Pro posouzení, zda se myši úspěšně naučily detekční úkol, byla porovnána míra zásahů s mírou falešných poplachů v rámci stejného tréninku pomocí dvoucestné analýzy rozptylu s opakovanými měřeními (ANOVA) s Bonferroniho post-hoc testováním.

Pro kvantifikaci výkonu v detekčních úkolech jsme místo procenta správných pokusů použili d‘ (index citlivosti), abychom zohlednili zkreslení kritérií olizování47. K výpočtu d‘ byl použit následující vzorec: d‘ = z(h) – z(fa), kde z(h) a z(fa) jsou normální inverzní kumulativní distribuční funkce míry shody, resp. falešného poplachu. Aby se zabránilo nekonečným hodnotám d‘, byly v případech, kdy byly hlášeny všechny pokusy (míra = 1) nebo žádný (míra = 0), míry nahrazeny (1½N), respektive (½ N), kde N je počet pokusů, v nichž byl podnět prezentován48. Z-skóre pro míru shody a falešných poplachů bylo vypočteno pomocí programu OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) s funkcí NORMINV. Statistické testy jsme provedli pouze na datech, kde alespoň jeden z genotypů vykazuje d‘ > 1,0, což znamená, že tyto myši podnět ohlásily. Behaviorální data byla shromažďována pomocí upravených rutin v Lab View při vzorkovací frekvenci 1 kHz a k analýze byly použity upravené skripty Python. Přizpůsobené kódy a skripty jsou k dispozici na vyžádání; další informace jsou k dispozici v Nature Research Reporting Summary spojeném s tímto rukopisem.

Běhy při olizování byly vypočítány a vyneseny do grafu jako pravděpodobnost olizování, frekvence prvního olizování (Hz) nebo průměrná latence prvního olizování (s). Tyto míry byly vypočteny následovně: pravděpodobnost olíznutí je pravděpodobnost, že se myš olízne alespoň jednou během okna příležitosti v pokusu s podnětem nebo úlovkem (pokusy s alespoň 1 olíznutím/celkový počet pokusů). V PSTH prvních olíznutí uvádíme binované rozložení latencí prvních olíznutí v podnětových nebo záchytných pokusech. Abychom tyto údaje normalizovali napříč myšmi, vydělili jsme počet prvních líznutí celkovým počtem pokusů. Vydělením hodnoty prvního líznutí šířkou binů jsme vypočítali hodnotu v hertzích (líznutí za s). Průměrná latence prvního olíznutí (s) byla vypočtena sečtením latencí prvního olíznutí v každém pokusu o zásah a vydělením celkovým počtem pokusů.

Analýza dat ze záznamů kožních nervových preparátů

Kutánní jednotky přední a zadní tlapy byly kategorizovány na základě rychlosti vedení a reakcí na mechanické podněty. Mechanické prahy jednotek byly vypočteny jako teplota nebo mechanická amplituda potřebná k vyvolání prvního akčního potenciálu. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí programu GraphPad Prism 6.0 a Pythonu. Statistické testy zahrnují dvoucestné opakované měření ANOVA s Bonferroniho post-hoc testem, Studentovy t-testy, Mannovy-Whitneyho U-testy a Wilcoxonovy párové testy. K posouzení normality dat byly použity Kolmogorovovy-Smirnovovy testy. Hvězdičky v obrázcích označují statistickou významnost: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Analýza dat z elektronové mikroskopie myších nervů

Pro analýzu elektronových mikrofotografií myších sedacích nervů byly počítány počty myelinizovaných a nemyelinizovaných vláken ve 12 řezech na nerv. Celkový počet vláken na nerv byl poté extrapolován z plochy příčného řezu každého nervu.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.