Nástup „precizní“ medicíny se vyznačuje mnoha novými zlepšeními v diagnostických, prognostických a léčebných metodách a režimech. V rámci této iniciativy se klade důraz na minimalizaci množství tkáně potřebné k testování prostřednictvím méně invazivních a bezpečnějších postupů. Jednou z metod, která v posledních letech vzbudila značný zájem, je „tekutá biopsie“. Ačkoli se definice přesného významu tohoto pojmu liší, lze si ji obecně představit jako odběr vzorku tělní tekutiny k testování relevantních biomarkerů, které slouží jako informace pro léčbu pacienta. Nejčastěji se používá pro odběr periferní krve za účelem analýzy cirkulujících nádorových deoxyribonukleových kyselin (DNA) bez buněk.

První popis cirkulující DNA bez buněk v lidské krvi pochází z roku 1948, ale v širší vědecké komunitě vzbudil jen malou pozornost 2. V roce 1977 vědci zjistili přítomnost abnormálně vysokých hladin bezbuněčné DNA (cfDNA) v plazmě a séru pacientů s rakovinou ve srovnání s kontrolními zdravými pacienty a předpokládalo se, že tato cfDNA představuje především cirkulující nádorovou DNA (ctDNA)1,5 . Od tohoto původního popisu další výzkumy zjistily, že zvýšená cfDNA obecně odráží množství patologických procesů, včetně maligních a benigních nádorových stavů, zánětlivých onemocnění, cévních mozkových příhod, traumat a sepse. Během těchto procesů mohou být nukleové kyseliny vylučovány do krve apoptotickými a nekrotickými buňkami nebo řízeným vylučováním živými buňkami2,11. Ačkoli se bezbuněčná DNA často používá jako synonymum pro cirkulující nádorovou DNA, je třeba mít na paměti, že ve vzorku může být přítomna i cirkulující nenádorová a nehumánní DNA.

Ačkoli v současné době dominuje DNA, mezi další složky tekuté biopsie patří ribonukleové kyseliny (RNA), cirkulující nádorové buňky (CTC), extracelulární vezikuly (EV) a nádorové trombocyty (TEP). Posledně jmenované složky jsou hlavně předmětem výzkumného zájmu. Vzhledem k tomu, že se provádí více translačního výzkumu, mohou mít tyto další složky tekuté biopsie v budoucnu stále větší klinické využití. Přehled těchto složek přesahuje rámec tohoto článku a čtenář je odkázán na článek Batth et al. pro další čtení.

Technologické úvahy

Do nedávné doby nebyla dostupná technologie dostatečně citlivá pro detekci ctDNA a její smysluplné využití. Na rozdíl od molekulárních testů prováděných na tělních tekutinách pro detekci nukleových kyselin virů a jiných mikroorganismů, které využívají relativně velké množství nukleových kyselin, jsou fragmenty cirkulujících nádorových nukleových kyselin přítomny ve zlomku normální nenádorové cfDNA. ctDNA jsou obvykle malé fragmenty DNA v rozmezí 140-170 párů bází (bp)3 a typ nádoru, progrese, zátěž, míra proliferace a terapie ovlivňují množství ctDNA ve vzorku. Kromě toho, ačkoli je ctDNA v plazmě a séru relativně stabilní, je během několika hodin odstraněna z oběhu játry a ledvinami3,4. Nicméně pokrok v preanalytických procesech a purifikačních metodách umožnil úspěšný záchyt, amplifikaci a sekvenování ctDNA.

Metody, které se v současné době používají k detekci nebo měření ctDNA, lze obecně rozdělit do dvou kategorií: založené na polymerázové řetězové reakci (PCR) a založené na sekvenování nové generace (NGS). Testy založené na PCR mají obecně rychlejší dobu provedení a jsou levnější, ale obvykle mohou vyhodnotit pouze jednu nebo několik specifických mutací najednou (omezená možnost multiplexování). Přístupy založené na PCR lze dále rozdělit na metody, které obohacují mutantní sekvence ve srovnání s divokým typem (nemutantními), a metody, které dosahují kvantifikace pomocí kompartmentalizace. Příkladem druhé skupiny je „digitální PCR“, která se začíná široce používat pro detekci a kvantifikaci specifických, známých mutací v ctDNA. PCR je kompartmentalizována do tisíců malých individuálních reakčních objemů, a to buď na čipu, nebo vytvořením kapiček vody v oleji. Každý oddíl nebo kapka buď obsahuje cílový templátový fragment, nebo ne, a produkuje fluorescenční signál, pokud je v daném objemu přítomen příslušný templátový fragment. Počítáním jednotlivých fluorescenčních objemů lze odhadnout počet specificky cílených molekul templátu ve vzorku. U více testovaných cílů najednou (multiplexování) lze specifickým variantním sekvencím přiřadit různé fluorescenční signály.

Přístupy založené na sekvenování nové generace umožňují posoudit mnohem širší rozsah možných mutací, protože sekvenování může odhalit mutace vyskytující se kdekoli v zachycených oblastech. Aby bylo možné zaměřit se na oblasti genomu náchylné k mutacím, lze knihovny NGS připravit z plazmatické DNA pomocí metod ligací/hybridního záchytu nebo metod cíleného obohacení PCR. Frakce variantních alel jsou v tekutých biopsiích obecně mnohem nižší než v tkáňových biopsiích, často <1 %, takže oblasti zájmu musí být sekvenovány hlouběji než při NGS primární nádorové tkáně. Kromě toho je třeba provést rozsáhlou optimalizaci preanalytických a analytických procesů, aby se maximalizoval vstupní vzorek a snížily chyby PCR a sekvenování. Významnou výhodou přístupů NGS je možnost dosáhnout mnohem širšího mutačního pokrytí (simultánní analýza tisíců možných mutací). Není tedy nutná předchozí znalost specifických mutací nádoru. Ve srovnání s jednoduššími metodami založenými na PCR jsou však techniky NGS dražší, časově náročnější a technicky náročnější.

Výhody a nevýhody

Výhody tekutých biopsií spočívají převážně v mnohem menší invazivitě postupů při jejich získávání oproti standardním biopsiím nádorů. Vezměme si například postup při biopsii plicního útvaru. Pokud se útvar nachází v místě, které je přístupné intervenční radiologii nebo chirurgické biopsii, existuje riziko pneumotoraxu nebo krvácení, nehledě na náklady na udržování operačního sálu, ve kterém se operace provádí. Tekuté biopsie také umožňují častější a sériové odběry vzorků v průběhu času, což umožňuje lépe rozlišit chování nádorů i jejich odpověď na léčbu. Například v jedné studii u pacientů s kolorektálním karcinomem, u nichž byla později radiograficky prokázána dobrá odpověď na léčbu, došlo po prvních dvou týdnech léčby k poklesu hladin ctDNA o >90 %9. Ukázalo se, že to umožňuje stratifikovat riziko recidivy po resekci s kurativním záměrem. V jiné studii měly pacientky s karcinomem prsu s detekovatelnou ctDNA po resekci 25násobně vyšší riziko recidivy10. Tyto koncepty jsou analogické testování, které se v současnosti provádí u hematologických malignit, jako je chronická myelogenní leukémie (CML) a sériové testování na přítomnost fúzních transkriptů BCR-ABL. A konečně, v případech, kdy není k dispozici tkáňová biopsie, lze molekulární profilování nádorů stále provádět pomocí tekuté biopsie.

Důležitou nevýhodou tekuté biopsie je nutnost získání počáteční histologické diagnózy pomocí tkáňové biopsie. Laboratoře provádějící tyto testy musí mít na paměti vhodné využití testu a možnost „nadměrné interpretace“ v klinickém kontextu. Nízká frekvence variant v periferní krvi může vést k vyššímu počtu falešně negativních výsledků a vyžaduje podstatně větší technické úsilí a odborné znalosti k získání spolehlivých výsledků.

Současné a nové aplikace

Klinické využití tekuté biopsie se od roku 2014, kdy byla k dispozici první komerčně dostupná multigenová platforma pro tekutou biopsii, výrazně zvýšilo. Několik testů je komerčně dostupných a schválených úřadem FDA a některé z nich jsou pojišťovnami považovány za dostačující pro nárok na léčbu. Například v roce 2016 schválila FDA test cobas® EGFR Mutation Test v2 k určení způsobilosti pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic k léčbě některými inhibitory tyrozinkinázy EGFR . Přijetí tekuté biopsie k vyloučení pacientů z cílené léčby zaznamenalo mnohem pomalejší klinické přijetí, většinou kvůli obavám z falešně negativních výsledků a obecně dostupné nádorové tkáni 3 . K rostoucímu klinickému využití přispěli také pacienti a lékaři, kteří chtějí identifikovat cílené mutace pro off-label použití nebo zařazení do klinických studií.

Mezi nově vznikající využití tekutých biopsií patří jejich použití jako doplňku k mutačnímu profilu tkáňové biopsie, hodnocení odpovědi na léčbu, sledování reziduální nemoci, detekce recidivy onemocnění a sledování vzniku rezistentních mutací 3 .

Budoucí směry

Očekávaná specifičnost mutací pro nádorová onemocnění činí z ctDNA atraktivní biomarker pro včasnou detekci nádorových onemocnění, což by mohlo mít obrovský dopad na péči o pacienty. Jelikož je však známo, že nádory v časných stadiích uvolňují velmi málo DNA, je třeba překonat mnoho technických problémů. Ačkoli tekutá biopsie může být atraktivním nástrojem pro screening rakoviny u asymptomatických pacientů, bude třeba takové aplikace pečlivě a promyšleně zvážit, aby se zabránilo nadměrnému utrpení pacientů a nákladům v důsledku falešně pozitivních výsledků. V krátkodobém horizontu může být tekutá biopsie užitečnější pro potvrzení malignity u pacientů s již klinicky nebo radiograficky patrnými lézemi.

Závěr

Literatura zaměřená na testování ctDNA se rychle rozšiřuje a vyvíjí. Mezi probíhající oblasti zkoumání patří preanalytické procesy, faktory ovlivňující míru detekce ctDNA a prospektivní klinické studie. Je pravděpodobné, že budeme svědky převažující role ctDNA v klinické péči, protože pokračující výzkum CTC, cfDNA/RNA a extracelulárních vezikul poskytne větší rozlišení snímku stavu nádoru získaného pomocí tekutých biopsií 4.

.