PŘÍPADOVÁ ZPRÁVA

Pětiletému chlapci byla v prosinci 1994 diagnostikována akutní lymfoblastická leukemie a byl zařazen do protokolu Fralle 93. Chlapec byl léčen s akutní lymfoblastickou leukemií. Dítě dosáhlo hematologické remise 6 týdnů po zahájení indukční chemoterapie. V následujících letech byl sledován ambulantně a dobře reagoval na léčbu. Při konzultaci v březnu 1997 však měl pacient při perfuzi systémem Port-a-cath febrilní příhodu. Klinické vyšetření neprokázalo žádnou septickou lokalizaci. Počet leukocytů byl 10 860/ml, s absolutním počtem neutrofilů 8 850/ml. Z Port-a-cath byla odebrána jedna sada krevních kultur a aerobní lahvová kultura poskytla žlutě pigmentované kolonie grampozitivních koryneformních tyčinek. Chlapec dostal jednou intravenózně ceftriaxon (1 g) a následně cefadroxil 500 mg dvakrát denně po dobu 7 dnů. Kvůli přetrvávající horečce byl cefadroxil podáván ještě týden a imunosupresiva byla ve stejném období vysazena. Po následující 2 měsíce byla anamnéza pacienta bez pozoruhodností a při příchodu na měsíční návštěvy nebyla provedena žádná kultivace krve. V červnu 1997 se dítě dostavilo ke konzultaci jako subfebrilní a stěžující si na únavu. Fyzikální vyšetření neodhalilo žádné ložisko infekce a počet leukocytů nebyl zvýšen. Byla odebrána jedna sada krevních kultur z Port-a-cath a aerobní lahvička odhalila stejné grampozitivní koryneformní tyčinky, následně identifikované jako Microbacterium sp. Byla diagnostikována katétrová bakteriémie a centrální žilní katétr byl odstraněn. Perioperačně byl intravenózně podán ampicilin (100 mg/kg/den), přičemž první dávka byla podána 24 hodin před operací. Klinický stav pacienta se poté rychle zlepšil. Port-a-cath byl kultivován na Columbia blood agaru. Během 24 h při 37 °C vyrostla čistá kultura žlutě pigmentovaných kolonií nefermentující, grampozitivní, poněkud odbarvené tyčinky. Subkultury se bohužel ztratily a nebylo možné provést další vyšetření.

Kmen izolovaný z krevních kultur pacienta, označený CF36, byl žlutě pigmentovaný, pohyblivý koryneform s oxidativním metabolismem, proteolytickou aktivitou a buněčnými mastnými kyselinami rozvětveného typu. Tyto obecné znaky svědčí pro rod Microbacterium, který zahrnuje jak fermentativní, tak oxidativní druhy, přičemž ty druhé se dříve nazývaly Aureobacterium (13).

Sekvence genu 16S rRNA (rDNA) byla studována pomocí jedné sady primerů pro amplifikaci. Produkty PCR byly přečištěny z agarózového gelu pomocí extrakční soupravy QIAquick gel (Qiagen, Westburg, Nizozemsko). Sekvenční analýza byla provedena na automatickém sekvenátoru DNA 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie) pomocí sady ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction. Každá sekvence byla porovnána se sekvenčními údaji dostupnými v databázích pomocí metody BLAST (10). Fylogenetický strom byl sestaven metodou sousedského spojování (8, 11).

Sekvenování 16S rDNA založené na 1490 nukleotidech kmene CF36 odhalilo nejvyšší úroveň podobnosti 99,5 % se sekvencí M. luteolum DSM 20143T a 99,3 % se sekvencí M. oxydans DSM 20578T. Byl také úzce příbuzný se sekvencemi M. saperdae (99,2 %) a M. liquefaciens (99,1 %) (tabulka (Table1).1). Další čtyři podobné kmeny byly získány z různých vzorků od jiných pacientů, které byly označeny CF7 izolovaný z jedné krevní kultury, CF34 z bronchiálního aspirátu, CF130 z jedné krevní kultury a CF40 z neznámého lidského zdroje. Jeden další kmen, CF128, byl získán ze vzorku zeleniny. Pět kmenů vykazovalo sekvence 16S rDNA podobné sekvencím typového kmene M. oxydans v rozmezí 99,3 až 99,4 % podobnosti, zatímco míra jejich podobnosti s CF36 byla 99,9 až 100 %. Devět dalších klinických izolátů vykazovalo 99,9 až 100 % podobnost s typovým kmenem M. oxydans.

Tyto výsledky nás přiměly provést rozsáhlou studii následujících šesti kmenů: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 a CF130.

Buněčné mastné kyseliny, stanovené podle předchozího popisu (14), vykazovaly u všech kmenů stejný profil. Průměrné procentuální zastoupení hlavních buněčných mastných kyselin bylo následující: 40,3 % anteiso-C15:0 (rozsah 37,1 až 46,0 %), 27 % anteiso-C17:0 (rozsah 22,9 až 31,3 %), 15,7 % iso-C16:0 (rozsah 13,8 až 19,3 %), 9,3 % iso-C15:0 (rozsah 4,6 až 13,9 %) a 4,2 % iso-C17:0 (rozsah 3,0 až 7,2 %).

Analýzu peptidoglykanu buněčné stěny CF36 a CF7 provedl v Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Německo) N. Weiss metodou tenkovrstvé chromatografie podle Schleifera a Kandlera (12). Peptidoglykan byl typu B2β s d-ornithinem jako diaminokyselinou.

Hybridizaci DNA-DNA provedl P. Schumann v DSMZ podle popisu De Ley et al. (3) s modifikacemi Escara a Huttona (4) a Husse et al. (7). Míra homologie DNA kmene CF36 s kmenem M. luteolum LMG 16207T byla pouze 33,7 % a s kmenem M. oxydans DSM 20578T 46,6 %, ale vysoké míry příbuznosti DNA 78,1 %, 81,8 % a 78,2 % bylo dosaženo s kmeny CF7, CF34 a CF40. To bylo v souladu s jejich přiřazením k jednomu druhu. Obsah G+C DNA kmene CF36 byl 69,9 mol %, jak bylo stanoveno v DSMZ.

Šest kmenů byly grampozitivní, pohyblivé, koryneformní tyčinky. Dobře rostly na Columbia blood agaru při 37 °C a barva kolonií byla žlutá. Kmeny byly striktně aerobní, kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Byly schopny hydrolyzovat eskulin a želatinu. Ačkoli sekvenování 16S rDNA ukázalo blízký vztah k M. luteolum, M. saperdae a M. liquefaciens, tyto druhy byly fenotypově zcela odlišné. Žádný z nich nerostl při 37 °C, M. luteolum a M. liquefaciens byly nepohyblivé a M. luteolum a M. saperdae byly neproteolytické. Tato zjištění jsou v souladu s údaji v literatuře (2). Fenotypové vlastnosti kmenů se nejvíce podobaly vlastnostem M. oxydans. Glukóza byla oxidativně okyselena na nízkopeptonovém fenolovém červeném agaru (15). Všechny kmeny rostly při 40 °C, zatímco žádný z izolátů M. oxydans nebyl schopen růstu při této teplotě. Salicin navíc nebyl na rozdíl od M. oxydans okyselen. Nové kmeny bylo také možné odlišit od M. oxydans pomocí asimilačních proužků API 50CH (bioMérieux). Využívaly laktózu a 2-ketoglukonát ne, zatímco u M. oxydans byly reakce opačné. Při použití proužků API ZYM (bioMérieux) oddělily negativní reakce na esterázovou lipázu (C8), α-chymotrypsin a β-glukosidázu šest kmenů od M. oxydans. Fenotypové charakteristiky odlišující nové kmeny od příbuzných oxidativních, pohyblivých, proteolytických druhů Microbacterium rostoucích při 37 °C jsou uvedeny v tabulce Tabulka22.

Citlivost na antibiotika byla testována na Mueller-Hintonově agaru s proužky E-test (PDM, Solna, Švédsko). Rozmezí MIC (mikrogramy na mililitr) bylo následující: penicilin, 1,5 až 2; ampicilin, 1 až 1,5; cefotaxim, 3 až 6; cefalothin, 16 až 24; ciprofloxacin, 1 až 1,5; gentamicin, 2 až 3; vankomycin, 3 až 4; klaritromycin, <0,016.

Fenotypové, chemotaxonomické a genetické studie naznačují, že šest studovaných kmenů patří do rodu Microbacterium, ale tvoří nový druh, pro který je navržen název Microbacterium paraoxydans a který je blízce příbuzný s M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum a M. liquefaciens (obr. (obr. 11).).

Jen několik zpráv se zabývá izolací druhů Microbacterium z klinického materiálu. Většina z nich byla původně zařazena do skupiny CDC A-4 nebo A-5 a i novější izoláty byly zřídka identifikovány na druhové úrovni (1, 5, 6, 9). Pouze v malém počtu případů se ukázalo, že izolát je původcem infekce. Případ endoftalmitidy způsobené mikrobakteriem popsali Funke a kol. a na základě sekvenování 16S rDNA se předpokládalo, že kmen patří k nepopsanému druhu (6). Ve studii Microbacterium spp. vyskytujících se v klinických vzorcích bylo několik kmenů identifikováno jako M. arborescens a M. imperiale, ale genetické potvrzení nebylo provedeno (5). U pacientů s nádorovým onemocněním byla hlášena nozokomiální epidemie bakteriémie způsobené Microbacterium, ale původce nebyl identifikován na druhové úrovni. Hlavním rizikovým faktorem v této studii byl centrální žilní katétr (1). Nedávno byly hlášeny dva případy bakteriémie způsobené katétrem, které byly identifikovány pomocí sekvenování 16S rDNA. Jeden izolát byl z 99,4 % příbuzný M. oxydans a druhý byl z 98,7 % příbuzný M. trichothecenolyticum, ale formální identifikace na druhové úrovni nebylo dosaženo (9).

Kmen CF36 byl izolován z krevních kultur pacienta v intervalu několika týdnů, a přestože organismus izolovaný z vyjmutého katétru bylo možné identifikovat pouze částečně, je pravděpodobné, že opakovaná bakteriémie souvisela s katétrem, což potvrzuje, že intravaskulární katétry představují rizikový faktor infekce těmito organismy. Jejich původcem může být kůže pacienta, ale vzhledem k tomu, že přirozeným prostředím mikrobakterií je neživé prostředí, nelze vyloučit, že kontaminovaná perfuzní tekutina osídlila katétr pacienta.

V průběhu posledních desetiletí jsme v naší laboratoři shromáždili 30 izolátů mikrobakterií lidského původu. Všechny tyto kmeny byly identifikovány pomocí souboru fenotypových a chemotaxonomických charakteristik a pomocí sekvenování 16S rDNA. Zdaleka nejčastěji izolovaným druhem byl M. oxydans, který představoval přibližně třetinu kmenů (9 z 30), následovaný M. paraoxydans (5 kmenů); M. aurum a M. lacticum byly zastoupeny po 4 kmenech. Zbývajících osm kmenů bylo rozptýleno mezi několik druhů, s jedním izolátem M. foliorum, jedním izolátem M. schleiferi, jedním izolátem M. testaceum a pěti izoláty, které neodpovídaly žádnému popsanému druhu.

Ačkoli se mikrobakterie zřídka podílejí na lidských onemocněních, počet relevantních izolátů nalezených v nozokomiálním prostředí se zvyšuje. Ačkoli bylo v rodu rozpoznáno více než 30 druhů, je pravděpodobné, že pouze omezený počet z nich je izolován z klinických vzorků. Přesnější identifikace lidských izolátů nám může pomoci lépe pochopit, které druhy jsou náchylné stát se oportunními patogeny.

.