Naše znalosti o původu a buněčné identitě pěnových buněk in vivo jsou nápadně omezené vzhledem k všudypřítomnosti těchto buněk v aterosklerotických lézích a jejich kritické roli v patogenezi lézí, včetně pozdních klinických následků, jako je infarkt myokardu nebo cévní mozková příhoda. V lidských patologických studiích pokročilých lézí1 byly pěnové buňky neboli buňky bohaté na lipidy nejprve identifikovány jako makrofágy pomocí monoklonálních protilátek proti CD68, CD45 a HLA II. třídy (cluster of differentiation 68, cluster of differentiation 45 a lidský leukocytární antigen II. třídy).2 Po nich však rychle následovaly studie se zdokonalenými protilátkami proti aktinu, které uváděly, že buňky hladkého svalstva (SMC) mohou také dávat vznik pěnovým buňkám, a to jak v pokročilých, tak i v časných stadiích lidských lézí.3,4 Nedávné studie naší laboratoře5-7 a dalších8 však ukázaly, že použití samotných markerových genů k určení původu buněk není v kontextu aterosklerotické léze spolehlivým přístupem. Bylo totiž prokázáno, že SMC mohou ztratit své kontraktilní markery a exprimovat makrofágové markery, jako je CD68,5 endotelové buňky a makrofágy mohou projít mezenchymální transformací a exprimovat markery SMC9-11 a některé buňky v lidských lézích exprimují jak CD68, tak ACTA2 (alfa 2 aktin), což dále zkresluje naše představy o původu pěnových buněk v lézích.5,12

Viz doprovodný článek na straně 876

V tomto čísle časopisu Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Wang et al13 předkládají zajímavý důkaz, že 60 až 70 % pěnových buněk v myších aterosklerotických lézích je původu SMC, nikoli leukocytů. Důležité je, že závěry jsou založeny na působivém využití komplementárních metod včetně sledování linie SMC u myší, specializovaných průtokových cytometrických metod, které zachovávají pěnové buňky jak leukocytárního, tak neleukocytárního původu, a na prokázání, že pěnové buňky odvozené od SMC jsou zřejmě negativní pro panleukocytární marker CD45. Toto poslední pozorování je důležité, protože stejná skupina již dříve prokázala, že >50 % pěnových buněk v pokročilých lézích lidských koronárních tepen je ACTA2+ CD68+, ale CD45-, což naznačuje, že hlavním zdrojem pěnových buněk v lidských lézích jsou také buňky neleukocytárního původu, nikoli monocyto-makrofágy, jak se dlouho předpokládalo.14,15 Ačkoli se myší údaje zdají být přesvědčivé, interpretace lidských údajů zůstává kontroverzní, protože je zcela závislá na neprokázaném předpokladu, že všechny pěnové buňky odvozené od leukocytů si v lidských lézích zachovávají expresi CD45. Dalším omezením je nemožnost provést důsledné sledování linií v lidských studiích. Naše laboratoř již dříve vyvinula epigenetickou metodu, která umožňuje detekci buněk odvozených od SMC na základě detekce H3K4diMe (dimethylace lyzinu 4 na histonu 3) promotorové oblasti Myh11 (těžký řetězec myozinu 11) v histologických řezech.6 Tato metoda však bude mít omezenou použitelnost pro analýzu pěnových buněk, protože jak uvádí Wang et al, je prakticky nemožné rozlišit jednotlivé pěnové buňky v pokročilých lézích. Jak by tedy mohla být tato inherentní omezení vyřešena?“

Myslíme si, že řešení bude nalezeno na základě nestranných jednobuněčných analýz RNAseq (scRNAseq) pokročilých lidských lézí v kombinaci s komplementárními studiemi scRNAseq, průtokové cytometrie a hmotnostní cytometrie (CyTOF) pokročilých lézí z aterosklerotických myší sledujících linii SMC. Ačkoli v poslední době proběhla řada scRNAseq studií aterosklerotických lézí, dosud měly podle našeho názoru zásadní omezení, pokud jde o vyřešení desetiletí trvající kontroverze ohledně hlavního buněčného zdroje pěnových buněk. Tato data zdůrazňují jedinečné poznatky, které poskytují nové techniky, ale také nabádají k opatrnosti při interpretaci těchto a dalších studií a naznačují, že další zkoumání identity a vlastností buněk pomocí přísného sledování linií spolu s scRNAseq a pokročilými testy na úrovni proteinů je zásadní oblastí budoucího výzkumu.

Wang et al použili fixaci lipidů s následným barvením BODIPY (bór-dipyrromethen) a průtokovou cytometrii, aby se pokusili kvantifikovat a charakterizovat pěnové buňky v aterosklerotické aortě z myší krmených západní dietou nebo stárnoucích ApoE-/-. Podobnou techniku použili Kim et al16 k izolaci BODIPY+ SSChi pěnových buněk z aterosklerotických myších aort pro analýzu pomocí single cell RNAseq. Důležité je, že obě studie analyzovaly celé aorty, nikoli léze, takže většina analyzovaných buněk nepochází z aterosklerotických lézí jako takových, ale spíše odráží celkové populace buněk v lézích, medii a adventicii. Kim et al se navíc zaměřili na tříděné CD45+ buňky, aby profilovali populace makrofágů v myší aortě, což by samozřejmě vyloučilo pěnové buňky odvozené od SMC, které popsali Wang et al. Tato skupina však v dodatku uvedla data scRNAseq všech pěnových buněk BODIPY+SSChi. Zajímavé je, že tato data ukazují buňky pozitivní na ACTA2 a Sm22a, což by mohly být pěnové buňky neodvozené od leukocytů, které ve své studii popsali Wang et al. Důležité však je, že výsledky scRNAseq nemusí být spolehlivou metodou pro kvantifikaci původu pěnových buněk, protože Winkels et al na základě dekonvoluce objemové RNAseq nalezli důkaz, že standardní techniky scRNAseq nedostatečně vzorkují makrofágy a monocyty o ≈65 %.17 To může být hlavním důvodem, proč by skupiny, které se zajímají zejména o populace makrofágů, měly před analýzou tyto buňky koncentrovat pomocí průtokové cytometrie, což je technika, která byla použita v několika nedávných pracích popisujících leukocyty v aterosklerotických cévách.16-18 Takové přístupy však pravděpodobně ohrožují potenciální sílu scRNAseq při zjišťování rozmanitosti buněčných typů a odhalování významu dosud neznámých buněčných populací pro onemocnění. Naše předsudky se totiž týkají nejen vstupu buněk, ale také interpretace dat scRNAseq, kdy vyšetřovatelé získají celý transkriptom buněčné populace aorty nebo léze a poté přistoupí k pojmenování buněčného typu na základě použití několika známých markerů. To popírá smysl technologie, jejímž účelem je oddělit skupiny na základě stovek nebo tisíců genů, a může to také vést k záměně skupin studujících podobné populace buněk.19,20 Tento druhý problém je obzvláště problematický vzhledem k nyní dobře prokázané nespolehlivosti použití několika konvenčních a známých markerových genů k identifikaci buněčných typů v pozdních stadiích aterosklerotických lézí.5,9-11 Wang a spol. totiž připouštějí, že 20 % pěnových buněk jiných než SMC rovněž neexprimuje CD45, což naznačuje, že mohou pocházet z jiného zdroje nebo z makrofágů, které již CD45 neexprimují. Žádná technika není zcela objektivní, a proto musí být zlatým standardem pro budoucí studie zkoumající identitu buněk v ateroskleróze použití více doplňujících se technik včetně sledování linie, imunohistochemického barvení, průtokové cytometrie, CyTOF a sekvenování.

Nejednoznačnost v identifikaci buněk na základě použití jednoho nebo jen několika markerových genů může mít také kritické terapeutické důsledky. To znamená, že terapie, která může mít příznivé účinky na některé buňky, může mít škodlivé účinky na jiné buňky. To jasně ilustruje nedávný článek naší skupiny v Nature Medicine21 , který nečekaně ukázal, že investice a udržení SMC ve fibrózní čepičce pokročilých aterosklerotických lézí závisí na signalizaci IL-1b a IL-1 receptoru. Naopak je také dobře známo, že IL-1b přispívá k rozvoji aterosklerózy.22 Podobně Wang et al prokázali, že ABCA1 (ATP-vázající kazeta A1) je v CD45-negativních pěnových buňkách downregulována, což podle autorů může být mechanismus jejich akumulace lipidů v čase. Možná, že jemné rozdíly ve schopnosti buněčných typů reagovat na mikroprostředí plaku jsou pro patogenezi léze rozhodující, protože se do pasti dostávají buněčné typy na nesprávném pracovišti. Skutečně postulujeme, že buňky podobné makrofágům odvozené od SMC jsou špatnými náhradami profesionálních fagocytujících buněk a nakonec se zahltí lipidy, ale mají omezenou schopnost se jich zbavit (obrázek).

Shrnem lze říci, že zde uvedené studie Wanga a kol. poskytují důležité spojení mezi pozorováním pěnových buněk v lidských lézích a myších modelech a naznačují nedoceněnou roli SMC při tvorbě pěnových buněk. Závěry Wanga et al poskytují přesvědčivý důkaz, že v této oblasti je zapotřebí mnohem více výzkumu. Doufejme, že díky kombinovanému využití pokročilých modelů sledování linií u myší a objektivnímu transkripčnímu a proteomickému profilování buněk lézí budeme moci přesněji definovat původ a funkce různých typů buněk přítomných v lézích a vyvinout nové účinné terapeutické přístupy ke zvýšení stability plaku a snížení pozdních trombotických komplikací aterosklerózy.

Poznámky

.