Synonyma

Neesterifikované mastné kyseliny (NEFA), volné mastné kyseliny, nenasycené mastné kyseliny

Fyziologie

Neesterifikované („volné“ nebo nenasycené) mastné kyseliny (NEFA) jsou hlavní složkou triglyceridů (tukových zásob v těle), které se skládají ze tří mastných kyselin spojených s glycerolovou páteří. U zdravých zvířat (pokud přijímají potravu nebo nejsou ve stavu energetického nedostatku) pocházejí NEFA především z rozkladu triglyceridů přijatých v potravě prostřednictvím chylomikronů (lipoproteinová lipáza uvolňuje NEFA ze zbytků chylomikronů). Za podmínek hladovění nebo negativní energetické bilance je však hlavním zdrojem NEFA hydrolýza tukových zásob v těle.

Hydrolýzou uložených triglyceridů (tuku) v tukové tkáni pomocí hormonálně citlivé lipázy se uvolňují NEFA a glycerol. Hormonálně citlivá lipáza (která se nachází v cytosolu adipocytů) je stimulována různými hormony, včetně glukagonu (který se uvolňuje z α-buněk v pankreatických ostrůvcích v reakci na nízkou hladinu glukózy) a kortikosteroidů. Po uvolnění z tuků nebo chylomironů mohou být NEFA využity jako zdroj energie v mnoha tkáních, včetně kosterního svalstva a hepatocytů. V hepatocytech se jejich osud liší v závislosti na energetických potřebách, hormonální rovnováze a dostupnosti substrátu, tj. mohou být využity k výrobě energie (prostřednictvím Krebova cyklu), přebaleny do triglyceridů a exportovány jako lipoproteiny s velmi nízkou hustotou (VLDL) nebo uloženy v játrech jako triglyceridy (jejichž nadbytek může způsobit jaterní lipidózu) nebo přeměněny na ketony.

Metodika

Primární metodou pro měření koncentrace NEFA v séru je kolorimetrická enzymatická metoda, která se používá na Cornellově univerzitě.

Typ reakce

Blanked end-point reaction. Blanking snižuje vliv hemolýzy na koncentraci NEFA.

Postup používaný na Cornellově univerzitě

V prvním kroku této třístupňové reakce acyl-CoA syntetáza (ACS) katalyzuje acylaci NEFA na (koenzym A) CoA, což vede ke vzniku acyl-CoA. Peroxid vodíku pak vzniká oxidací acyl-CoA katalytickým působením acyl-CoA oxidázy (ACOD). Nakonec peroxid vodíku v přítomnosti peroxidázy (POD) umožňuje oxidativní kondenzaci 4-aminoantipyrinu s 3-methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-anilinem (MEHA) za vzniku modrofialového konečného produktu s maximem absorbance při 550 nm. Koncentrace NEFA je přímo úměrná naměřené optické hustotě barvicího produktu.

Reakce jsou uvedeny níže:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA synthesasa > Acyl-CoA + AMP + pyrofosfát

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidasa > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrin + MEHA peroxidáza > modrofialový komplex+ 3H2O

Měřicí jednotky

Koncentrace NEFA se měří v mEq/L (konvenční jednotky) nebo mmol/L (jednotky SI). Přepočet jednotek se získá z následujícího vzorce:

mEq/L x 1= mmol/L

Uvažování o vzorku

Typ vzorku

Sérum nebo EDTA plazma. Sérum/plazma by měly být co nejdříve po odběru odděleny od buněk a sérum/plazma umístěny do samostatné zkumavky. Stejně tak se nedoporučují zkumavky s corvacem (oddělovačem séra), protože hodnoty v těchto zkumavkách jsou mírně (ale výrazně) vyšší ve srovnání se zkumavkami bez antikoagulantu (červený vršek).

Anticoagulant

EDTA. Hodnoty jsou méně stabilní v heparinu, který také poskytuje vyšší výchozí koncentrace než EDTA nebo sérum a hodnoty NEFA se skladováním zvyšují (Stokol a Nydam 2005).

Stabilita

Stabilní v hovězím séru nebo EDTA plazmě při 4 °C po dobu 72 hodin. Stabilní ve zmrazeném hovězím séru po dobu 1 měsíce (-70 °C). Hodnoty se zvyšují během 24-48 hodin po skladování při 24°C v séru nebo EDTA plazmě. Koncentrace NEFA se po skladování rychle zvyšuje v heparinu. (Stokol a Nydam 2005).

Doporučení pro odběr vzorků u dojnic v přechodu

• Anticoagulant: Červený vršek (sérum) nebo fialový vršek (EDTA). Vyhněte se zkumavkám s heparinem (zelený vršek) a corvacem (sérový separátor). Oddělte od buněk co nejdříve, uchovávejte v chladu, aby se minimalizovaly falešné změny ve výsledcích (NEFA jsou obzvláště nestabilní), předejte co nejdříve do laboratoře.
• Doba odběru:
  • Předběžný odběr NEFA:
  • Postpartální NEFA: Odebírejte vzorky od krav 2-14 dní před otelením: Vzorky odebírejte od krav 3-14 dní po porodu. Měření poporodních NEFA i BHB se provádí v energetickém profilu přechodných krav pro hodnocení energetického stavu laktujících krav v Laboratoři klinické patologie na Cornellově univerzitě.
• Počet krav: Pro testování na úrovni stáda by měly být odebrány vzorky minimálně od 12 zvířat ze stáda (popis testu v části interpretace testu níže). Může se jednat o směs jalovic a krav >2 parity.
• Sdružené vzorky: Sdružování jednotlivých vzorků od krav za účelem posouzení energetického stavu stáda se NEDOPORUČUJE. Studie na Cornellově univerzitě ukázaly, že výsledky ze sdružených vzorků jsou méně citlivé než vyšetření jednotlivých krav (minimálně 12 zvířat ve stádě) při použití NEFA před porodem nebo po porodu pro zjištění nadměrné negativní energetické bilance u dojnic v přechodu.

Interference

• Lipémie, ikterus: Neznámý účinek (u skotu vzácný).
• Hemolýza: V závislosti na metodě použité laboratoří hemolýza buď sníží, nebo zvýší hodnoty NEFA. Při slepé metodě používané na Cornellově univerzitě silná hemolýza (hemolytický index > 800 jednotek) mírně sníží koncentrace NEFA v krvi skotu. Lipemické a ikterické interferenty nemají u metod používaných na Cornellově univerzitě podstatný vliv na koncentraci NEFA.
• Vzrušení/cvičení/stres: Tyto podmínky, které vyvolávají uvolňování katecholaminů nebo ACTH, zvyšují koncentrace NEFA stimulací lipolýzy prostřednictvím hormonálně citlivé lipázy. Tyto podmínky by měly být při odběru krevních vzorků pro měření NEFA minimalizovány.
• Načasování odběru vzorků: Hodnoty NEFA budou pravděpodobně vyšší u krav, které přicházejí na denní krmení (pravděpodobně budou v určitém stupni negativní energetické bilance), než u krav, které byly právě nakrmeny (u těchto krav bude lipolýza inhibována). Doporučuje se odběr těsně před krmením.

Interpretace testu

Testování NEFA se většinou provádí u mléčného skotu, aby se zjistilo, zda je stádo v nadměrné záporné energetické bilanci. Používá se spíše jako test na úrovni stáda než na úrovni jednotlivých zvířat a výsledky se interpretují s ohledem na mezní koncentraci nebo procento zvířat s hodnotami nad mezní hodnotou oproti hodnotám nad horní referenční hranicí. Měření NEFA lze provést u jakéhokoli jiného druhu zvířat jako marker nadměrné negativní energetické bilance. Nejčastěji se provádí u velbloudů (u kterých se za těchto okolností vyvíjí jaterní lipidóza), jiných přežvýkavců (např. koz, ovcí), aby se zjistilo, zda jsou ohroženi ketózou, a u koní (při metabolickém syndromu koní). Všimněte si, že koncentrace pod referenční mezí nejsou klinicky relevantní.

Zvýšené koncentrace

• Fyziologické: Cvičení vyvolává uvolňování katecholaminů a ACTH, což stimuluje hydrolytickou aktivitu hormonálně citlivé lipázy, která podporuje mobilizaci tuků za účelem uspokojení nadbytečných energetických potřeb. Tento proces zvyšuje koncentraci NEFA v krvi.
• Rozdíly mezi plemeny: Několik studií ukázalo, že NEFA jsou u jerseyských krav po porodu nižší než u holštýnských krav, proto pokyny vypracované pro holštýnské krávy (viz níže) nemusí být použitelné pro jerseyské krávy (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Negativní energetická bilance u dojnic: Dojnice v peripartálním (přechodném) období jsou vždy ve stavu záporné energetické bilance v důsledku vysokých energetických nároků vyvíjejícího se plodu a produkce mléka (zejména při důrazu na selekci na vysokou mléčnou užitkovost). Tento stav negativní energetické bilance však může být nadměrný a postižené krávy jsou v časném poporodním období ohroženy gastrointestinálními (posunuté abomasum), metabolickými (klinická ketóza) a infekčními (např. metritida) chorobami. Praktičtí dojiči proto často monitorují stáda dojnic na nadměrnou negativní energetickou bilanci testováním NEFA, a to buď samostatně u krav před porodem nebo po porodu, nebo jako součást metabolického profilu u krav po porodu. Výsledky těchto testů lze interpretovat na úrovni jednotlivých krav (tj. hodnota NEFA nad určitou mezní hodnotou znamená nadměrnou negativní energetickou bilanci) nebo na úrovni stáda (tj. podíl testovaných krav má hodnoty NEFA nad určitou mezní hodnotou). Zjištění nadměrné záporné energetické bilance u jednotlivých krav (a co je důležitější) ve stádě naznačuje potřebu změn ve výživě (např. zvětšení krmného prostoru pro lůžko, zvýšení energetické hustoty krmné dávky) a managementu krav v období přechodu, aby se snížily energetické nároky a stresy krav v období přechodu. Následující pokyny pro interpretaci vycházejí ze studií provedených na Cornellově univerzitě a platí pro vzorky odebrané „ohroženým“ holštýnským kravám krmeným TMR mezi 2-14 dny před otelením (předporodní NEFA) nebo 3-14 dny po otelení (poporodní NEFA). Při hodnocení stád krmených celkovou směsnou krmnou dávkou (TMR) na subklinickou ketózu doporučujeme odebrat vzorky alespoň od 12 „rizikových“ krav (Ospina et al. 2013).
  • Testování na úrovni krav
    • Prepartální NEFA: U holštýnských dojnic (krmených TMR) s hodnotami NEFA > 0,30 mEq/L při vyšetření 2-14 dní před otelením je zvýšený výskyt onemocnění po otelení (posunuté abomasum, metritida/zachycená placenta a klinická ketóza), snížená mléčná užitkovost a snížená reprodukční výkonnost v prvních 30 dnech v mléce.
    • Postpartum NEFA: U holštýnských dojnic (krmených TMR) s hodnotami NEFA > 0,60-0,70 mEq/L při vyšetření 3-14 dní po otelení je zvýšený výskyt onemocnění po otelení (posunuté abomasum, metritida/zachycená placenta a klinická ketóza), snížená mléčná užitkovost a snížená reprodukční výkonnost v prvních 30 dnech v mléce. Ve studiích Cornell byly NEFA po otelení skutečně lepším prediktorem než koncentrace β-hydroxybutyrátu po otelení nebo NEFA před otelením.
  • Testování na úrovni stáda
    • Předporodní NEFA: Na úrovni stáda existuje významně zvýšené riziko metabolických a infekčních onemocnění po otelení, snížené produkce mléka nebo snížené reprodukční výkonnosti, pokud >15 % testovaných krav před otelením má hodnoty NEFA >0,30 mEq/L. Všimněte si, že jak je uvedeno výše, sdružování vzorků od jednotlivých krav se pro testování na úrovni stáda nedoporučuje.
    • Postpartální NEFA: Na úrovni stáda existuje významně zvýšené riziko metabolických a infekčních onemocnění po otelení, snížené produkce mléka nebo snížené reprodukční výkonnosti, pokud >15-20 % testovaných krav po otelení má hodnoty NEFA > 0,70 mEq/L. Všimněte si, že jak je uvedeno výše, sdružování vzorků od jednotlivých krav se pro testování na úrovni stáda nedoporučuje.
• Jaterní lipidóza u mléčného skotu: V jedné studii měl poměr NEFA:cholesterol >0,2 (jednotky SI) poměr šancí 9,9, že zvíře bude mít jaterní lipidózu (definovanou jako >10 % obsahu lipidů v játrech), přičemž tato mezní hodnota byla pro diagnostiku jaterní lipidózy citlivější (63 % s 85 % specificitou) než BHB, samotná NEFA nebo aktivita AST (>120 U/L) (na základě plochy pod křivkou operační charakteristiky přijímače nebo AUC). U zvířat v této studii však bylo měření krve provedeno v různých obdobích po ukončení laktace (Mostafavi et al. 2013).
• Negativní energetická bilance u malých zvířat: Ta se vyskytuje především u diabetes mellitus. Ve stavu nedostatku inzulinu nebo inzulinové rezistence dochází ke ztrátě inhibice hormonálně citlivé lipázy. Regulační nerovnováha aktivity hormonálně senzitivní lipázy zvyšuje mobilizaci tuku z tukové tkáně do jaterní tkáně a zvyšuje koncentraci NEFA.
• Negativní energetická bilance u velbloudů: Nemocní, stresovaní velbloudi, zejména březí samice, jsou ohroženi vznikem jaterní lipidózy. Měřením NEFA lze zjistit, zda jsou v negativní energetické bilanci. U velbloudů s NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al. 2001) je zvýšené riziko lipidózy. Anorektičtí velbloudi mají často NEFA zvýšené, ale pod touto hodnotou a lipidóza se u nich nemusí vyvinout.