Morpholino oligos jsou pokročilé nástroje pro blokování míst na RNA, které brání buněčným procesům. Morpholino oligo se specificky váže na vybrané cílové místo a blokuje přístup buněčných složek k tomuto cílovému místu. Tuto vlastnost lze využít k blokování translace, blokování sestřihu, blokování miRNA nebo jejich cílů a blokování aktivity ribozymů.
Blokování translace: Díky sterickému blokování iniciačního komplexu translace mohou morfolina zcela vyřadit expresi mnoha cílových sekvencí natolik, že po vyčkání na degradaci existujícího proteinu zmizí cílový proteinový pás z Western blotu. Na rozdíl od mnoha typů antisense (např. siRNA, fosforothioáty) morfolina obecně nezpůsobují degradaci svých cílových RNA; místo toho blokují biologickou aktivitu cílové RNA, dokud tato RNA není přirozeně degradována, čímž se morfolina uvolní. To znamená, že RT-PCR není vhodná pro testování blokování translace morfoliny.
Blokování spoje: Blokováním míst zapojených do sestřihu pre-mRNA lze morfolina použít k modifikaci a kontrole normálního sestřihu. Tuto aktivitu lze pohodlně testovat pomocí RT-PCR, přičemž úspěšná modifikace sestřihu se projeví jako změny v pásu produktu RT-PCR na elektroforetickém gelu. Pásek se může posunout na novou hmotnost, nebo pokud modifikace sestřihu spustí rozpad transkriptu zprostředkovaný nesmyslem, divoce sestřihaný pásek ztratí intenzitu nebo zmizí.
Stejně jako všechna činidla pro knockdown genů musí být morfolina aktivně dopravena do většiny buněk. Morfolina lze do kultivovaných buněk dopravit různými metodami, včetně stírání adherentních buněk, elektroporace a dokonce i mikroinjekce. Naše dodávací činidlo Endo-Porter však obecně poskytuje vynikající dodávku do kultivovaných buněk, pokud jde o množství dodaného morfolina na buňku, rovnoměrnou distribuci v celé populaci buněk, reprodukovatelnost dodávky a netoxičnost pro většinu typů buněk při doporučené koncentraci. Pro pokusy na zvířatech se naše Vivo-Morpholinos s připojenou doručovací částí dostávají do buněk z krve po i.v. podání nebo vstupují do buněk ve tkáních obklopujících lokální injekce; jsou to také nejvhodnější antisense oligos pro použití v buněčných kulturách nebo explantátech, protože nevyžadují žádné další činidlo pro cytosolické doručení.
Morfolinové oligo se radikálně liší od přírodních nukleových kyselin, přičemž methylenemorfolinové kruhy nahrazují ribózové nebo deoxyribózové cukerné části a neiontové fosfodiamidátové vazby nahrazují aniontové fosfáty DNA a RNA. Každý morfolinový kruh vhodně umístí jednu ze standardních bází DNA (A,C,G,T) pro párování, takže 25bázové morfolinové oligo se silně a specificky váže na své komplementární 25bázové cílové místo ve vlákně RNA prostřednictvím Watson-Crickova párování. Protože nenabitá páteř oliga Morpholino není rozpoznávána enzymy, je zcela stabilní vůči nukleázám.
Vyzýváme vás, abyste do svých experimentálních úkolů vnesli přesnější a výkonnější nástroj. Zavolejte naší skupině zákaznické podpory na úrovni doktorů věd ve společnosti Gene Tools a začněte používat Morpholinos ve svých studiích. Telefon: (541) 929-7840 ext 1.
- Posouzení doručení
- Rozpustnost a Morpholinos
Stejně jako u všech genových knockdown agentů je efektivní doručení morfolin zásadní. Zatímco potvrzení doručení není rozhodující pro experimenty využívající mikroinjekci do embrya, potvrzení doručení je důležité pro experimenty s kultivovanými buňkami. Naše dodávací činidlo Endo-Porter obecně poskytuje jednoduché a spolehlivé dodání pro většinu typů buněk. Pomocí fluorescenčně značeného morfolina můžete posoudit, zda se vám podařilo dosáhnout dobrého doručení do cytosolu vašich buněk. K tomuto účelu doporučujeme použít naše levné standardní kontrolní oligo značené fluoresceinem.
Při použití fluorescenčního Morpholina k potvrzení doručení začněte s koncentrací 10 mikromolárů Morpholina v kultivačním médiu. To je dostatečně vysoká koncentrace, aby po 16 hodinách bylo fluorescenčně značené Morpholino viditelné v cytosolu pomocí fluorescenčního mikroskopu. Pro pozorování buněk v kultivačních destičkách je nejvhodnější inverzní fluorescenční mikroskop. Pozorujte živé (nefixované) buňky. Použijte suchý objektiv s nejvyšší dostupnou numerickou aperturou, abyste zachytili co nejvíce světla z buněk. Úspěšné dodání se projeví rozptýlenou fluorescencí v celém cytosolu. Bodová fluorescence obvykle naznačuje, že oligo je zachyceno v endozomech, takže bodové skvrny ignorujte a hledejte difúzní fluorescenci.
Pro skutečné experimenty dodávající vaši vlastní sekvenci Morpholino s Endo-Porterem obecně potřebujete koncentraci pouze 1 až 5 mikromolárů pro účinné sterické blokování většiny mRNA.
Ačkoli jsou Morpholino oligos mnohem rozpustnější než jiné neiontové strukturní typy (např. PNA), některá Morpholinos s vysokým obsahem G (>30 %) mají omezenou rozpustnost. Také připojení našeho červeně emitujícího fluoru lissaminu někdy snižuje rozpustnost oliga. Rozpustnost se liší v závislosti na sekvenci oliga a je obtížné ji předpovědět. Níže uvedená doporučení mohou pomoci zachovat aktivitu oliga, pokud má vaše sekvence špatnou rozpustnost.
Pro dlouhodobé skladování jsou vaše zásobní roztoky Morpholino nejlépe skladovány lyofilizované, Další nejlepší volbou je skladování v roztoku při pokojové teplotě. Vytváření zásobních roztoků Morpholino na úrovni 1 milimolaru nebo nižší pomáhá vyhnout se problémům s rozpustností. Cykly zmrazování a rozmrazování nebo dlouhodobé skladování při 4C mohou způsobit vysrážení nebo asociaci morfolínů v kontejnerech a snížit aktivitu roztoku; doporučujeme skladování při pokojové teplotě v těsně uzavřených nádobách, a aby se zabránilo odpařování v případě vadného těsnění lahvičky, je rozumné skladovat zásoby ve vlhkém prostředí, jako je humidor (např. zvonek s otevřenou kádinkou s vodou). Dbejte na to, aby oligo nevyschlo, protože může být obtížné nebo nemožné znovu rozpustit vyschlé oligo (ačkoli lyofilizovaná oliga se rozpouštějí poměrně snadno). Dobré je uchovávat lahvičku v tmavé krabici nebo zabalenou ve fólii, protože fluorem značená oliga mohou na světle fotoblednout.
Agregace v roztoku může časem způsobit pokles biologické aktivity, k čemuž může dojít v roztocích skladovaných při pokojové teplotě. To lze v některých případech zvrátit zahřátím na 5 minut při 65C nebo ve většině případů autoklávováním (použijte cyklus kapaliny). Oligózy jsou velmi tepelně stabilní a snesou několik kol autoklávování bez degradace. Autoklávování často oživí zásobu, která ztratila část aktivity v důsledku agregace oliga.
DNA, RNA a většina činidel pro knockdown genů se během experimentů obvykle skladují v ledové lázni, aby se minimalizovala degradace nukleázami. Vzhledem k tomu, že Morpholinos jsou zcela odolné vůči enzymatické degradaci a vodné roztoky jsou chemicky stabilní po neomezenou dobu (roky) při pokojové teplotě, doporučujeme, abyste během svých experimentů uchovávali zásobní roztoky Morpholinos při pokojové teplotě. Chlazením zásobních roztoků v ledové lázni jednoduše riskujete, že se Morpholino vysráží.
Tato opatření jsou pro většinu sekvencí více než nutná, ale jejich rutinní používání vám pomůže vyhnout se nepříjemným překvapením v případě, že narazíte na sekvenci s nízkou rozpustností.
.