Úvod

4-hydroxy-l-prolin (hydroxyprolin) je neproteinogenní aminokyselina, která má molekulovou hmotnost 131,13 g/mol a je syntetizována posttranslační hydroxylacíprolinu během biosyntézy kolagenu (obr. 1). Při vyšetřování fyziologického a patologického metabolismu kolagenu se nejčastěji využívá měření hydroxyprolinu v plazmě, moči a tělesné tkáni. Stanovení hydroxyprolinu proto poskytuje užitečné informace pro diagnostiku a prognózu onemocnění způsobených poruchami metabolismu kolagenu (1). Mezi tyto stavy patříhypertyreóza, hyperparatyreóza, akromegalie, Pagetova choroba, osteomalacie, křivice, Marfanův syndrom, osteogenesis imperfecta, sklerodaktylie, dermatomyozitida a Cushingův syndrom (2).

Fibróza, která se vyskytuje v játrech, plicích, ledvinách,kůži a dalších orgánech, má schopnost vyvinout se v chronickou hepatitidu, jaterní sklerózu, rakovinu jater, plicní fibrózu aglomerulonefritidu (3). Proto je velmi důležitá prevence rozvoje a snížení závažnosti fibrózy u pacientů. Hydroxyprolin působí jako důležitýdiagnostický ukazatel závažnosti fibrózy.

Měření hydroxyprolinu v plazmě, moči a tělesné tkáni je možné pomocí kolorimetrických metod,vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a průtokových injekčníchanalýz (4-6). Tyto metody však vyžadují velké objemy vzorků vzhledem k jejich nízké citlivosti. Kromě toho HPLCvyžaduje dlouhou dobu separace každého vzorku. V posledních letech se objevuje kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS), která je výhodná pro svou vysokou citlivost a krátkou separační dobu. LC-MS se využívá k měření nízkých koncentrací léčiv v séru a moči s kontaminovanými látkami (7-9). Cílem této studie bylo použít novou metodu LC-MS k měření hydroxyprolinu. Jako indikátor fibrózy byl pomocí LC-MS změřen hydroxyprolin v játrech a plicích potkaního modelu fibrózy a porovnán s předchozími výsledky získanými pomocíPLC a kolorimetrických metod.

Materiál a metody

Etické prohlášení

Protokol studie byl schválen etickou komisí Harbin Medical University (Harbin, Čína). Součástí protokolu byl standardní postup pro získání písemného informovaného souhlasu, který byl schválen etickou komisí HarbinMedical University.

Reagencie

Dimethylnitrosamin (DMN) a hydroxyprolin byly získány od společnosti Nacalai Tesque Inc. (Kjóto, Japonsko). Nembutal byl zakoupen od společnosti Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japonsko) ableomycin byl získán od společnosti Nihon Kayaku Inc. (Tokio, Japonsko). Všechny ostatní chemikálie byly reagenční kvality.

Příprava modelu plicní a jaterní fibrózy u potkanů

Model plicní fibrózy byl vytvořen u pětitýdenních potkanů kmene Wistar injekcí bleomycinu (BLM, 0,30U/100 g, i.p.) do trachey v anestezii nembutalem (50 mg/kg).Zdravým potkanům byl podán 0,9% fyziologický roztok (kontrola).

Model jaterní fibrózy byl vytvořen u sedmitýdenních potkanů Wistar jednorázovou injekcí DMN (40 mg/kg, i.p.). Kontrolní skupinou byli normální zdraví potkani, kterým byl podán0,9% fyziologický roztok (kontrola). Příprava modelu plicní jaterní fibrózy a odběrové tkáně vycházela zmetod popsaných v předchozích studiích (10,11).

Měření hydroxyprolinu u potkaního modelu plicní fibrózy kolorimetrickou metodou

Levá plíce byla odstraněna, zvážena (~0.3 g) a homogenizována v 5% roztoku kyseliny trichloroctové (x10 objemů) pomocí buněčného homogenizátoru (Eilard, Berlin, Německo) při 8 000 × g (4 °C) po dobu2 min v ledové lázni. Buňky byly centrifugovány (2 500 × g, 4 °C) po dobu 20 min a supernatant byl dvakrát promyt destilovanou vodou. Poté byla na začátku zcela přidána 6 N HCl při 110 °C a reagovala 16 h. Po dokončení reakce byl přidán toluen (3 ml) a směs byla míchána 20 min. Po odstředění (3 000 × g, 20 °C) po dobu 10 min byla organická vrstva sebrána a přidán p-dimethylaminobenzaldehyd.Hydroxyprolin ve vzorku byl detekován pomocí multiplatinového spektrometru (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) při 560 nm.

Měření hydroxyprolinu v játrech pomocí HPLC

Levá plíce byla odebrána, zvážena (~0,3 g) a homogenizována v 5 ml ethanolu pomocí buněčného homogenizátoru (Eilard) při 8000 × g (4 °C) po dobu 2 min v ledové lázni. Homogenát byl centrifugován (2 500 × g, 4 °C) po dobu 20 min a supernatant byl odebrán. Získaná kapalina (1 ml) se zahřívala 8 h při 60 °C, dokud nebyla suchá. Po rozpuštění zbytku ve 40 μl ethanolu a 80 μl boritanového pufru (0,1 M, pH 8) bylo přidáno 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazanu (100 mM) jako fluorescenční činidlo. Reakce se nechala probíhat při pokojové teplotě 15 h ve tmě. Poté bylo přidáno 840 μl kyseliny chlorovodíkové (6 mol/l) k ukončení reakce. Po odstředění (2 500 × g, 20 °C) po dobu 20 min byl supernatant odebrán pro HPLCanalýzu.

Byl použit systém Hitachi L6000 HPLC (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA).Detekce byla provedena pomocí fluorescenčního spektrometru Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japonsko; excitace při 475 nm, emise při 530 nm). Kolona (HitachiHigh-Technologies Corporation) byla YMC Pack ODS-AQ (150 × 6,0 mmID) při pokojové teplotě. Mobilní fází byl acetonitril: voda (gradient 35:65-50:50 po dobu 15 min) a průtoková rychlost byla 1 ml/min.

Měření hydroxyprolinu vplicní a jaterní organizaci pomocí LC-MS

Levá plíce byla vyjmuta, zvážena (~0,5 ml/min) a následně rozpuštěna.3 g) a homogenizována v 5% roztoku kyseliny trichloroctové (x10 objemů) pomocí buněčného homogenizátoru (Eilard) při 8 000 × g (4 °C) po dobu 2 min v ledové lázni. Buňky byly centrifugovány (2 500 × g, 4 °C) po dobu 20 min. Supernatant byl dvakrát promyt destilovanou vodou. Poté byl přidán 6 N HCl při 110 °C po dobu 16 h a vzorky byly připraveny k měření. Játra byla vyjmuta, zvážena (~0,3 g) a homogenizována v 5 ml ethanolu pomocí buněčného homogenizátoru (Eilard) při 8 000 × g (4 °C) po dobu 2 min v ledové lázni. Homogenát byl centrifugován (2 500 × g, 4 °C) po dobu 20 min, supernatant byl odebrán a vzorky připraveny k měření.

Koncentrace hydroxyprolinu byla stanovena metodou LC-MS pomocí systému LC-MS2020 (Shimadzu Corp.,Kyoto, Japonsko). Pokud jde o LC, mobilní fáze byla 5 %CH3CN-10 mM CH3COONH4. Kolona byla Shin-pack VP-ODS (průměr 150 × 2 mm). Průtoková rychlost byla 0,2 ml/min. Pokud jde o MS, byla použita atmosférická chemická ionizace (APCI). Byla použita také detekce pozitivních iontů. Napětí sondy bylo 4,5 kV a proud sondy byl 4,2 μA. Teplota sondy APCI byla 250 °C a elektronové napětí na zakřivené desolvační linii (CDL) bylo -30,0 V. Teplota CDL byla 250 °C a teplota bloku 20 °C. Napětí předpětí pro Q-mřížky 1, 2 a3 bylo 5,0, 25,0 a 35,0 V. Napětí VF elektronů Q-array bylo 150,0 V.

Statistická analýza

Rozdíly mezi skupinami byly zkoumány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu. Pokud nebyl zjištěn významný rozdíl, byl rozdíl mezi skupinami zkoumán metodouBonferroni. Korelace byly zkoumány pomocí oboustrannéhot-testu. P<0,05 bylo považováno za statisticky významný rozdíl.

Výsledky

Měření koncentrace hydroxyprolinu pomocí LC-MS

MS chromatogram hydroxyprolinu

Hmotnostní spektrum hydroxyprolinu je uvedeno naobr. 2. MS hydroxyprolinestandardu (80 pg/ml) vedla k fragmentovým píkům s molekulovou hmotností 173,0 (molekulový ion + kyselina octová-voda) vzniklýmpřidáním k amonné kyselině octové pro zvýšení počtu iontovýchmolekul (molekulové množství, 131,15) a iontové síly.

LC-MS chromatogram hydroxyprolinu

LC podmínky byly následující: Mobilní fáze, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolona, Shin-pack VP-ODS (průměr 150 × 2 mm); průtoková rychlost, 0,2 ml/min a ultrafialová (UV) detekce při 230 nm. MS byla provedena ionizační metodouAPCI a detekce iontů byla pozitivní.

Chromatogram LC-MS-selected ion monitoring (SIM) hydroxyprolinu (m/z, 173,0) je uveden na obr. 3. Jak bylo pozorováno u hydroxyprolinestandardu, byl pozorován pík při 1 ng/ml v retenčním čase 2,213 min. Ostrý pík byl rovněž pozorován při 50 ng/ml. Při koncentraci 1 μg/ml,což byl 1000násobek standardní koncentrace, byl ve spektru LC-UV (230 nm) zaznamenán malý pík.

Citlivost detekce LC-MS tohydroxyprolinu

Standardní křivka LC-MS-SIM hydroxyprolinu (m/z, 173,0; molekulový ion + kyselina octová-voda) je uvedena na obr. 4. Při použití metody plochy píku pro standardní křivku vykazoval hydroxyprolin ostrý pík při 35 ng/ml (obr. 3). Přikoncentracích <35 ng/ml však nebyla pozorována korelace mezi plochami píků. Od 35-560 ng/ml byla pozorována korelace mezi plochami píků a standardní křivka byla přímka. Při koncentracích 60 a 80 μg/ml byly plochy píků téměř identické. Korelace mezi plochami píků nebyla pozorována při koncentracích >60 μg/ml.

ChromatogramLC-MS a MS spektrumhydroxyprolinu v modelu plicní a jaterní fibrózy u potkanů

Obr. 5 ukazuje chromatogramLC-MS a MS spektrum se SIM detekcíhydroxyprolinu (m/z 173,0; molekulární ion + kyselina octová-voda) v modelu plicní fibrózy u potkanů. V LC-MSchromatogramu plic byl podobně jako v případě hydroxyprolinestandardu pozorován výrazný pík při m/z 173,0 při době setrvání 2,213 min. Hydroxyprolin byl v hmotnostním spektru identifikován v at/z 131,15.

Obr. 6 znázorňuje LC-MS chromatogram a MS spektrum se SIM detekcí hydroxyprolinu (m/z 173,0; molekulový ion + kyselina octová-voda) ve fibrotické jaterní tkáni potkanů. Jak bylo pozorováno u standardu hydroxyprolinu, v LC-MS chromatogramu a MS spektru byl zaznamenán pík s retenčním časem 2,213 min.

Koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni (kolorimetrické a LC-MS metody)

Kolorimetrické a LC-MS metody použité pro stanovení koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni potkanů jsou porovnány na obr. 7. Každý sloupec představuje průměr ± směrodatnou odchylku devíti experimentů. Podle kolorimetrické metody byla koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni potkanů ve skupině s BLM (652,3±70,0 μg/levá plíce) významně vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou (547,1±52,3 μg/levá plíce; P<0,05). Podle metody LC-MS měla skupina s infuzí BLM(610,9±50,3 μg/levá plíce) významně vyšší hodnotu ve srovnání s kontrolní skupinou (493,3±53,5 μg/levá plíce; P<0,05).Koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni potkana měřená metodou LC-MS však měla nižší hodnotu ve srovnání s hodnotou měřenou kolorimetrickou metodou.

Koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni potkana měřená kolorimetrickou metodou a metodou LC-MS je porovnána na obr. 8. Byla zjištěna korelace mezi kolorimetrickou a LC-MS metodou pro stanovení koncentracehydroxyprolinu v plicní tkáni kontrolní skupiny (r=0,972). Podobně byla zjištěna korelace mezi kolorimetrickou a LC-MS metodou pro stanovení koncentrace hydroxyprolinu v plicní tkáni skupiny s BLM (r=0,918).

Koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni potkanů metodami fluorescenčního značení a LC-MS

Na obr. 9 je znázorněno hodnocení koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni potkanů metodami fluorescenčního značení a LC-MS. Podle metody fluorescenčního značení byla koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni potkana skupiny s DMN (105,4±36,5 μg/g) významně vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Také podle analýzyLC-MS vykazovala skupina s DMN (190,4±70,3 μg/g) významně vyšší hodnotu ve srovnání s kontrolní skupinou (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). Koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni potkanů měřená metodou LC-MS však byla vyššíve srovnání s koncentrací měřenou metodou fluorescenčního značení.

Koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni potkanůhodnocená metodami fluorescenčního značení a LC-MS spolu korelujína obr. 10. Koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni kontrolní skupiny hodnocená pomocí fluorescenčního značení korelovala s koncentrací získanou metodou LC-MS (r=0,957). Také koncentrace hydroxyprolinu v jaterní tkáni skupiny s DMN získaná metodou fluorescenčního značení korelovala s koncentrací získanou metodou LC-MS (r=0,981).

Diskuse

Hydroxyprolin je typ aminokyseliny, která se nachází valbumenu. Prolinový zbytek v bílkovině je hydroxylován4-monooxgenázou za vzniku kyseliny 4-hydroxy-2-oxoglutalové, která jev lidském tělekonvertována na alanin a glycin prostřednictvím kyseliny 4-glutamové. V každém vnitřním tělesném orgánu může zánět a fibróza vést k hromadění složek extracelulární matrix (ECM) (12), za patologických podmínek však může docházet k další fibróze v játrech, plicích a ledvinách (13,14).Chronická hepatitida a jaterní skleróza jsou spojeny s fibrózoua mají také úzkou souvislost s rakovinou jater (15).

V plicích je závažnost fibrózy závislá na typu pneumonie (16).plicní fibróza obvykle doprovází intersticiální pneumonii(17). Fibróza ve vnitřních orgánechje způsobena proliferací složek ECM ukládanýchmyofibroblasty. Pochopení vývoje fibrózy zahrnujevyšetření koncentrace kolagenu. Koncentrace hydroxyprolinu je spojena s kolagenem jako ukazatelem závažnosti fibrózy (18-20). Hydroxyprolin je důležitý jako ukazatel onemocnění způsobeného proliferací kolagenu (jako infibróza) a poruchou metabolismu.

V posledních letech se ukázalo, že LC-MS je vysoce citlivá detekční metoda (7,8,21).LC-MS se skládá z LC a MS komponenty a rozhraní, které je spojuje. LC část je identická s konvenční HPLC. Vzorek je ionizován v části rozhraní. Ionizace termosprejemprodukovala nestabilní (těkavé) produkty, a proto byl použit APCI (který ionizuje materiál, ale ne rozpouštědlo, po nebulizaci rozpouštědlem za atmosférického tlaku). Ionizaci elektrosprejem (ESI)lze použít k ionizaci molekul s vysokou polaritou a vysokou molekulovou hmotností, což je ideální pro složku rozhraní. v této studii však ESI nebyla přizpůsobena k tématu měření hydroxyprolinu v tělesných vzorcích, protože ESI nebyla v případě ionizace doprovázena termosprejem. Jednodušší postup byl změřit hydroxyprolin v kombinaci sNa+ přidáním dalšího Na+ do vzorku.

MS spektrum hydroxyprolinu vykazovalo píky m/z 173,0 a 131,15. M/z 173,0 byl identifikován jako pík představující sůl kyseliny octové pocházející z amonné kyseliny octové, která byla přidána do mobilní fáze pro zvýšení iontové síly. Kromě toho, vzhledem k tomu, že srovnávací síla m/z 131,15 a 173,0 je ve spektru MS přibližně stejná, byl v MSchromatogramu vybrán iont m/z 173,0, aby se zabránilo interferenčnímu píku mobilní fáze.

V MSchromatogramu hydroxyprolinestandardu v koncentraci 1 ng/ml byl při měření SIM pozorován pík s m/z 173,0 . V UV spektru (230 nm) hydroxyprolinu při koncentraci 1 μg/ml, která byla 1000× vyšší než standardní koncentrace, byl pozorován malý pík (měření bylo provedeno ve stejnou dobu jako LC měření).

Při koncentraci <35 ng/ml nebyla mezi oblastmi píků pozorována silná korelace mezi různými metodami a nebylo možné vytvořit standardní křivku. Byla vyslovena hypotéza, že analyt mohl být ovlivněn píkem mobilní fáze, protože hydroxyprolin má poměrně nízkou molekulovou hmotnost (131,15). Kromě toho se retenční čas píku mohl stát nestabilním v důsledku polarity rozpouštědla při nízkýchkoncentracích (koncentrace hydroxyprolinu <35 ng/ml).

Předpokládalo se, že je možné měřit koncentrace látek až na úrovni pg/ml. Pro pík hydroxyprolinu v MS chromatogramu byl retenční čas krátký (2,213 min). Schopnost hydroxyprolinu udržet se na koloně ODS byla slabší, než se původně navrhovalo. relativní síla iontů ve spektru MS při m/z 131,15a 173,0 byla přibližně stejná, a proto si interferenční pík mobilní fáze vybral ion m/z173,0. V LC-MS chromatogramu hydroxyprolinu v plicní a jaterní tkáni byl pozorován ostrý pík m/z 173,0 při době zdržení 2,213 min, stejně jako u hydroxyprolinestandardu. S ohledem na MS spektrum byl potvrzen pík molekulárního iontu hydroxyprolinu (m/z 131,15).

Měření koncentrace hydroxyprolinu v plicní a jaterní tkáni pomocí LC-MS bylo porovnáno s koncentrací získanou kolorimetrickou metodou i fluorescenční metodou pomocí HPLC z předchozí studie naší skupiny. Byla zjištěna vysoce významná pozitivní korelace. Hodnota koncentrace hydroxyprolinu v plicích získaná kolorimetrickou metodou je však vyšší než hodnota získaná metodou LC-MS. Navíc koncentrace hydroxyprolinu v játrech získaná fluorescenční metodou pomocí HPLC byla nižší ve srovnání s hodnotou získanou metodou LC-MS(u které se předpokládá vysoká absorbance všech složek ve vzorku při konstantní vlnové délce 560 nm).

Závěrem lze říci, že hydroxyprolin, jako indikátoribrózy, byl v předchozíchstudiích naší skupiny měřen kolorimetrickou a HPLC metodou. Srovnáním v této studii bylo zjištěno, že výhodnější je metoda LC-MS, která se vyznačuje jednoduchým postupem, vysokou citlivostí (hladina pg) a krátkou dobou separace. Pro potvrzení těchto výsledků je třeba provést další šetření s většími objemy vzorků.

Poděkování

Autoři děkují M. Kusunose, M. Ono aA. Hamadovi (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi,Japonsko) za poskytnutí několika činidel použitých v této studii, užitečnýchpodnětů a technických znalostí. Tato práce byla financována Odborem veřejného zdraví provincie Heilongjiang (č. 2013365) vČíně.

	Kitchener RL a Grunden AM: Funkce prolidázy v metabolismu prolinu a její lékařské a biotechnologickéaplikace. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013. zobrazit článek : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H and MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M and Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry fordetermination of underivatized amino acids. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. Zobrazit článek : Google Scholar
	Jemal M and Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G and Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al:LC-MS-based metabolomics in the clinical laboratory. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Zobrazit článek : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004: (In Japanese).
	Muiznieks LD and Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Z pohledu vláknitých proteinů. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM and Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR a Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM and Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ and Brown KK: Acuteinterstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in relation tothe changes in hydroxyproline and retinoid levels of the liver inrats. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. Zobrazit článek : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Zobrazit článek : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R a Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.