Použili jsme zdroje živin glukózy, glukózy a glutaminu k rozluštění toku uhlíku v buňkách K562 a změn v reakci na léčbu BaP. Celkově jsme pozorovali největší množství inkorporace značek do ribozových částí a laktátu (podrobnosti o distribuci značek viz a doplňkový soubor 1: obrázek S1). Jak je znázorněno na obr. 1, lze očekávat, že inkorporace značek do Krebsova cyklu vznikajících z glukózy povede ke dvěma výrazně odlišným vzorcům značení metabolitů Krebsova cyklu v závislosti na tom, zda fragment C2 vstupuje prostřednictvím pyruvátkarboxylázy (PC) nebo pyruvátdehydrogenázy (PDH). Z pyruvátu vzniklého z glukosy vznikne glutamát prostřednictvím PDH, ale glutamát prostřednictvím aktivity PC. Vzhledem k tomu, že aktivita PC produkuje z pyruvátu oxaloacetát, lze očekávat malát pocházející z PC, zatímco produktem PDH bude malát nebo malát.

Spektra NMR ukazují, že velké množství aspartátu a malátu je odvozeno od PC

Jak je uvedeno na obr. 2, jsou pozorovány významné rozdíly mezi buňkami zpracovávajícími glukózu po dobu 3 vs. 24 h pro rezonance malátu a aspartátu. Tyto rozdíly se projevují převážně ve změně NMR-spojovacích konstant. Velikost těchto vazebných konstant závisí na povaze přilehlého atomu uhlíku: skupina karboxylové kyseliny poskytuje mnohem větší vazebnou konstantu než skupina CH2. Spojovací konstanta pro skupinu 13C1 13C2 v aspartátu nebo malátu je přibližně 50-60 Hz, zatímco spojovací konstanta pro skupinu 13C2 13C3 je přibližně 35-40 Hz.

Pro 24hodinové značení ukazuje obr. 2 zdánlivé vazebné konstanty 53 Hz pro C2 malátu a aspartátu. Tato velká zdánlivá vazebná konstanta ukazuje, že převažuje vazba C2 se sousední skupinou karboxylové kyseliny C1. Tento vzorec vazby 13C1 13C2 (a také 13C3 13C4, viz doplňkový soubor 1) vyplývá z aktivity PDH a pravděpodobně také z metabolitů, které při delší době značení procházejí vícekrát Krebsovým cyklem.

Při krátké 3hodinové době značení jsou pro C2 pozorovány menší zdánlivé konstanty vazby 47 a 41 Hz (obr. 2 a doplňkový soubor 1: obr. S1), což ukazuje, že dominuje vazba na sousední methylen C3. Přítomnost molekuly 13C2 13C3 při kratších dobách značení ukazuje, že produkt vznikající při aktivitě PC dominuje při kratších dobách značení.

Je třeba poznamenat, že pozorované rozdělení signálu nepředstavuje přesné skalární vazebné konstanty ve směsi značených sloučenin. Nicméně pozorovaná změna jasně naznačuje vyšší množství produktu PC při kratších dobách značení jak u malátu, tak u aspartátu.

Další důkaz aktivity PC v subspektrech uracilu

Při syntéze pyrimidinů de novo se uracil tvoří z aspartátu přes karbamoyl-aspartát, orotát a dihydroorotát. Proto by se vzorce značení v aspartátu měly odrážet v signálech pyrimidinového kruhu. Doplňkový soubor 2: Obrázek S2 ukazuje očekávané inkorporace značek pro uracil. Při syntéze báze uracilu v UDP z aspartátu je určení 13Cs následující: C1, C2 a C3 aspartátu se stanou C10, C11 a C12 UDP, zatímco C4 se ztratí (viz doplňkový soubor 2). Ve spektrech HSQC lze přímo pozorovat pouze C11 a C12, protože C10 nemá navázaný proton.

U vzorků značených glukózou bude aspartát odvozený od PC značen C2C3. Ten je v UDP převeden na značený fragment C11C12. Aspartát odvozený od PDH však může být značen na C1C2 nebo C3C4. To se převede na fragment C10C11, resp. izolovaný C12 v uracilu. Proto spektra C12 vypovídají o relativním množství aktivity PC vs. PDH; PC dává u C12 dublet, zatímco PDH dává u C12 singlet.

Všechna spektra vykazovala jak singlet, tak dubletní signál u C12 (obr. 3). Intenzita dubletu oproti singletu se však mezi údaji za 3 a 24 h změnila trojnásobně, což opět naznačuje posun od značení pomocí PC ke značení pomocí PDH v čase. Z několika metabolitů vyplývá, že existuje paralelní aktivita PC i PDH, ale produkt PC je primárně směrován do produktů přímo navázaných na oxaloacetát, čímž vzniká vysoké pozorované množství produktu PC do těchto metabolitů při krátkodobé expozici. Pouze při delší době značení je produkt PDH pozorován v levé větvi Krebsova cyklu.

BaP-indukovaný malonát pochází z následné aktivity PC v buňkách K562

Ukázali jsme, že malonát může vznikat z oxaloacetátu chemickou přeměnou pod vlivem peroxidu vodíku, a v naší předchozí studii jsme naznačili, že akumulace malonátu v reakci na léčbu BaP je způsobena léčbou indukovaným zvýšením ROS působících na oxaloacetát . Vzorky byly obohaceny o malonát, aby se potvrdilo naše přiřazení methylenových 1H/13C rezonancí malonátu v HSQC spektrech (viz doplňkové soubory 3 a 4). Následně nám v této studii náš přístup založený na stopování umožnil zvážit původ pozorovaného malonátu.

Jak ukazuje obr. 4a, očekávalo by se, že malonát odvozený od ROS vzniklý z oxaloacetátu, který byl vytvořen přímo z pyruvátu činností PC za použití glukosy jako zdroje živin, bude značen v polohách C1 a C2. V alternativní situaci, kdy aktivita PDH přemění pyruvát na acetyl-coA při vstupu do Krebsova cyklu, by se očekávalo, že přeměna vzniklého oxaloacetátu na malonát zprostředkovaná ROS dá vzniknout dvěma produktům se značkou v poloze C1 nebo v poloze C1 a C2 v poměru 1:1, protože Krebsovým cyklem prochází symetrický sukcinát a fumarát (viz také obr. 1).

Obrázek 4b ukazuje reprezentativní 1D řez ze spekter HSQC vzniklých z buněk ošetřených 24 h glukózou značenou BaP a jasně demonstruje generování silného malonátového signálu vyvolaného léčivem. V odpovídajících HSQC spektrech vzniklých z buněk značených glukózou po 24 h ošetření BaP jsme pozorovali jasný dublet (obr. 4c znázorněn jako červené píky) s rozštěpením 58 Hz, což svědčí o značené skupině CH2 spojené s uhlíkem kyseliny karboxylové. To je jasná indikace malonátu značeného C1,C2 (nebo C2,C3) se značkou pouze v jedné ze dvou skupin karboxylové kyseliny. U malonátu značeného ve všech třech polohách, který by mohl vzniknout při vícenásobném průchodu Krebsovým cyklem, by se očekávalo, že bude vykazovat triplet na C2 v 13C-rozměru HSQC spekter, protože alespoň určité procento by bylo značeno v obou COO skupinách (AX2 spojovací vzor). Proto nepřítomnost centrálního signálu v HSQC velmi svědčí o tom, že malonát pochází z předcházející aktivity PC. Nepřítomnost malonátu pocházejícího z vícenásobných Krebsových cyklů a aktivity PDH podporuje také skutečnost, že malonát vznikající při 24hodinovém značení buněk ošetřených BaP glukózou vykazoval pouze singlet (obr. 4c znázorněný jako modrý pík).

Abychom dále prokázali, že malonát vyvolaný léčivem pochází z downstream aktivity PC, získali jsme 13C-1D-spektra, ve kterých jsme mohli pozorovat COO rezonance malonátu přímo (obr. 4d). Referenční spektrum 10 mM kyseliny malonové ve stejném pufru (pH 7), jaký byl použit pro buněčné extrakty, potvrdilo frekvenci COO rezonance (obr. 4d).

Očekává se, že značení zprostředkované PC poskytne dublet na C1 (pocházející z malonátu), zatímco značení zprostředkované PDH poskytne směs 50:50 dubletu pocházejícího z malonátu a singletu pocházejícího z malonátu (obr. 4a). Přestože byla získaná spektra i po 24 hodinách pořízení zašuměná, vykazovala jasný dublet bez zbytkového signálu uprostřed (obr. 4d), což potvrzuje, že produkt značení pocházející z PC je dominantní. Z toho usuzujeme, že malonát skutečně pochází z přeměny oxaloacetátu zprostředkované ROS pocházející zcela nebo alespoň převážně z aktivity PC a nevykazuje žádný příspěvek možného produktu PDH ani po 24 h značení. Kontrolní pokusy s použitím glutaminu jako zdroje uhlíku ukázaly pouze minimální inkorporaci značení do malonátu. Ukázalo se, že malonát produkovaný z glukosy je převážně značen prostřednictvím PC. Tyto dvě skutečnosti společně silně naznačují, že malonát je produkován převážně z glukózy prostřednictvím glykolýzy a vstupu pyruvátu do TCA cyklu zprostředkovaného PC.

Důkaz paralelní aktivity PDH

Tabulka 1 porovnává 1 J CC spojovací konstanty a vzorce intenzity multipletů pozorované v souborech dat s 3 a 24 h značením. V obou souborech dat za 3 i 24 h je značení na C4 glutamátu mnohem větší než značení na C4 a rozdělení pozorované na C4 naznačuje spojení s C5. To silně naznačuje, že značení zprostředkované PDH je pro glutamát v obou časových bodech dominantní. Citrát C2 je rozštěpen velkou vazbou na C1, což opět silně naznačuje, že značení zprostředkované PDH je dominantní. Tyto vzorce značení naznačují jasnou převahu produktů PDH pro pravou větev Krebsova cyklu vedoucí od citrátu ke glutamátu.

Výpočetní analýza multipletů

Řezky z 1H-13C-HSQC byly také kvantitativně analyzovány simulací 13C-NMR spekter pro směs různých izotopomerů pomocí softwaru pyGamma z programu NMRLab . V případě glutamátu analýza multipletů potvrdila, že značení zprostředkované PDH bylo dominantní ve 3. i 24. hodině bez ohledu na ošetření BaP. U aspartátu multipletová analýza potvrdila, že došlo k posunu od značení zprostředkovaného PC ve 3 h směrem ke značení zprostředkovanému PDH ve 24 h. Simulovaná spektra jsou uvedena v doplňkovém souboru 5: obrázek S4 a tabulka 2 potvrzuje kvalitativní výsledky pro aspartát a glutamát.

.