2.2 Strategie produkce levanu

Levan je syntetizován jako exopolysacharid (EPS) v extracelulární matrix bakterií různých rodů, jako jsou Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus a Zymomonas (Sarilmiser a kol., 2015). Kromě těchto extrémofilních producentů levanu uvádí Poli et al. (2009) jako producenta levanu Halomonas sp. Další studie se zabývaly potenciálním využitím levanu z Halomonas jako bioflokulantu (Sam et al., 2011), systému pro podávání léčiv na bázi peptidů a proteinů (Sezer et al., 2011, 2015), biokompatibilního tenkého (Sima et al., 2011, 2014), adhezivního vícevrstvého filmu (Costa et al., 2013) a glykanu napodobujícího heparin (Erginer et al., 2016). Na obr. 12.2 je znázorněn obecný postup výroby mikrobiálního levanu.

Obrázek 12.2. Základní kroky následného zpracování levanu.

Mikrobiální EPS se obvykle vyrábějí v aerobních, ponořených fermentačních systémech. Fermentační podmínky, jako je provzdušňování, míchání, pH, koncentrace rozpuštěného kyslíku, teplota, složení média a konstrukce bioreaktoru, mohou určovat vlastnosti produktu a výtěžnost výroby. Proto je pro dosažení vysoké kvality a výtěžnosti produkce nutné provést pro každý organismus propracovanou optimalizaci těchto parametrů (Öner et al., 2016). Například Srikanth et al. (2015) zkoumali vliv fermentačních parametrů včetně počátečního pH, přídavku levanu, koncentrace sacharosy, zdroje dusíku, koncentrace inokula a doby kultivace na syntézu levanu s použitím Acetobacter xylinum NCIM2526 jako produkčního kmene. Optimální podmínky byly stanoveny jako 10, 50-60 a 1,49 g/l pro dusík, sacharosu a inokulum. Výtěžek levanu se znatelně zvýšil po prvních 24 h a maximální produktivity levanu bylo dosaženo po 122 h, když bylo počáteční pH nastaveno na 6,8. Zvýšení počátečního přídavku levanu z 0,1 na 0,4 g/l zvýšilo výtěžnost levanu z 1,22 na 1,65 g/l; cokoli nad 0,4 g/l již nemělo na výtěžnost žádný vliv. Koncentrace inokula mezi 5 % (v/v) a 10 % (v/v) vedly podle očekávání ke změně výtěžnosti levanu a maximální výtěžnosti (1,46 g/l) bylo dosaženo při 7 % (v/v). Koncentrace sacharózy od 20 do 80 g/l ovlivnily výtěžnost levanu. V rozmezí 40-50 g/l se výtěžnost produkce zvýšila, v rozmezí 70-80 g/l se snížila a v rozmezí 20-40 g/l se nezměnila.

Sarilmiser et al. (2015) studovali produkci levanu u halofilního mikroorganismu (Halomonas smyrnensis AAD6T) s použitím různých stimulačních faktorů. Například byly použity různé strategie krmení v různých časových intervalech ve vsádkovém bioreaktorovém systému a bylo testováno více počátečních podmínek v protřepávaných kulturách. Z různých testovaných pH a koncentrací sacharózy bylo maximální výtěžnosti levanu dosaženo při pH 7 (1,345 g/l levanu) a 50 g/l sacharózy (1,320 g/l levanu). Při omezení dusíku a fosforu se koncentrace levanu i biomasa snížily, zatímco hodnoty Yp/x se zvýšily. Dusíkaté pulzní strategie snížily syntézu levanu v důsledku prodloužené doby růstu, sacharózové pulzní strategie výrazně zlepšily růst buněk a produkci levanu a pulzní strategie NaCl neměla na růst žádný vliv. Zajímavé je, že kultury pěstované v přítomnosti kyseliny borité produkovaly nejvyšší koncentrace levanu (8,84 g/l) v kontrolovaných podmínkách bioreaktoru. Toto zlepšení bylo vysvětleno biologickým jevem známým jako quorum sensing (QS), na kterém se podílejí atomy bóru; jedna ze signálních molekul zapojených do QS u H. smyrnensis AAD6T byla později identifikována jako C16-acylhomoserinelakton (Abbamondi et al., 2016).

Molekulární hmotnost levanu je rozhodujícím faktorem pro jeho použitelnost v různých odvětvích včetně potravinářského, kosmetického a lékařského průmyslu (Belghith et al., 1996). Stanovení optimálních podmínek pro výrobu levanu je zásadní pro získání požadované molekulové hmotnosti sloučeniny (Porras-Domínguez et al., 2015). Například Wu et al. (2013) hodnotili jemné modifikace výrobního procesu pro získání různých molekulových hmotností levanu ve vsádkových a krmných systémech, přičemž jako produkční kmen použili Bacillus subtilis (natto) Takahashi. Při použití vysoké (400 g/l) a nízké (20 g/l) koncentrace sacharózy byla získána nižší, resp. vyšší molekulová hmotnost levanu. Tato lineární závislost byla přisuzována účinku sacharosy na enzym levansukrázu. Autoři dospěli k závěru, že molekulová hmotnost levanu závisí na reakčních podmínkách, jako je pH, teplota, rychlost míchání a sacharosa, přičemž sacharosa je nejúčinnějším faktorem určujícím molekulovou hmotnost levanu.

Produkce levanu v systémech s imobilizovanými buňkami je také výhodná, protože tyto systémy využívají relativně snadné navazující procesy, vysokou objemovou produktivitu, pokročilou kontrolu procesu a snížené riziko kontaminace při výrobě EPS (Ürküt et al., 2007). Zavedení této výhodné metody pro výrobu levanu lze využít jako alternativu ke vsádkovým, krmným a kontinuálním procesům (Öner et al., 2016). Například Silbir et al. (2014) testovali produkci levanu ve vsádkových a kontinuálních fermentačních systémech s použitím Zymomonas mobilis B-14023. Kontinuální fermentační produkce probíhala v bioreaktoru s balenou vrstvou využívajícím buňky imobilizované Ca-alginátem. Inkubační doba, počáteční pH a koncentrace substrátu byly tři nejvýznamnější proměnné procesu pro produkci levanu ve vsádkovém systému. Nejvyšší množství levanu (40,2 g/l) bylo vyprodukováno při použití kvasničného extraktu jako zdroje organického dusíku v třepačkových kulturách. Kromě toho byly pro produkci levanu úspěšně použity imobilizované buňky Z. mobilis v kontinuálním fermentačním systému. Nekontrolovatelné poklesy tlaku v systému a narušení Ca-alginátových gelových kuliček byly hlavními omezeními delší doby fermentace.

Přes rozmanitost mikroorganismů produkujících levan zůstávají náklady na výrobu polysacharidu levanu vysoké. To je pravděpodobně největší překážkou v jeho komercializaci (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Fermentační média představují přibližně 50 % výrobních nákladů na mikrobiální proces (Van Hoek et al., 2003); pro mikrobiální výrobu levanu se však dříve používaly levné zdroje uhlíku, jako jsou sirupy a melasa (Özcan a Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) zkoumali melasu z cukrové řepy a škrobovou melasu jako náhradu sacharosy v kulturách Halomonas. K úpravě dostupnosti chemických látek pro produkci levanu bylo použito čiření, pH, kyselina sírová, fosforečnan vápenatý a předúprava aktivním uhlím v různých kombinacích. Bylo zjištěno, že maximální výtěžky levanu byly dosaženy při koncentraci 10 g/l TCPHAC jsou 4,19 a 3,68 g/l. Při použití 30 g/l TCPHAC a HAC bylo dosaženo výtěžků levanu 7,56 a 4,44 g/l. Odstranění těžkých kovů a zvýšení koncentrace železa vedlo v této studii ke snížení integrity buněk a výtěžku levanu. V jiných studiích byla použita melasa z černé cukrové třtiny v kulturách Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb et al., 2015), datlový sirup v kulturách Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab et al., 2010), melasy z cukrové řepy v kulturách Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han a Watson, 1992) a melasy a sirupu z cukrové třtiny v kulturách Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al..), 2007) byly zkoumány jako levné zdroje uhlíku pro produkci levanu.

Biosyntéza levanu v systémech ponořené fermentace je omezena požadavkem buněčného růstu, který nemusí splňovat optimální podmínky pro vysokou aktivitu levansukrázy (Santos-Moriano et al., 2015). Bezbuněčné systémy však toto omezení odstraňují a poskytují další výhody, jako je snadná příprava, možnost opakovaného použití a kontrola změn mikroprostředí (Jang et al., 2001). Z tohoto důvodu je zásadní poskytnout levansukráze optimální prostředí. Například Lu et al. (2014) zkoumali vliv různých faktorů, jako je koncentrace substrátu, reakční doba, teplota a pH, na produkci levanu pomocí rekombinantní levansukrázy v bezbuněčném systému. Pozorovali maximální výtěžek levanu (7,1 g/l) při použití 0,8 M sacharosy, pH 6,5 a 40 °C po dobu 24 h. Výtěžek levanu se zvyšoval souběžně se zvyšováním koncentrace sacharosy z 0 na 0,8 M. Jejich studie ukázala, že rekombinantní enzym vykazuje podobné biochemické vlastnosti jako nativní enzym

.