Biologické testy bradykininu a příbuzných kininů
Kininy jsou silné hypotenzní látky u všech studovaných druhů zvířat (54). Nejběžnějším testem in vivo pro tyto peptidy je již dříve popsaný test krevního tlaku potkanů. Vazodilatační účinky kininů se měří v izolovaných perfundovaných orgánech s intaktním endotelem podle postupu popsaného v oddíle IV. Relaxační účinek kininů v arteriálních cévách se hodnotí in vitro v psí krční tepně (57) metodou popsanou Regolim a Barabém (34). Venokonstrikční účinek se měří in vitro v králičí krční žíle (42) podle postupu shrnutého níže.
Žíly odebrané králíkům (1,0-2,0 kg) se nařežou na helikoidní proužky široké 2 mm a dlouhé 2 cm a zavěsí se v Krebsově roztoku (okysličeném při 37 °C) obsahujícím inhibitor konvertujícího enzymu (kaptopril, 10 μM), aby se zabránilo degradaci kininů (34). Kontrakce tkáně v reakci na kininy se zaznamenávají, jak bylo popsáno dříve, a obvykle se měří úplné křivky koncentrace-odpověď, aby se vyhodnotila afinita kininů a jejich antagonistů. Bylo prokázáno, že králičí jugulární žíla obsahuje podtyp receptoru B2 (B2A) (tabulka V).
Nejčastěji používaným nevaskulárním preparátem je ileum morčete, které se odebírá morčatům o hmotnosti 250-350 g a připravuje se jako podélný hladký svalový proužek podle Ranga (37). Tkáň je in vitro suspendována v Krebsově roztoku (okysličeném při 37 °C) a změny jejího napětí se měří tak, jak je popsáno výše pro izolované cévy (viz oddíl I). Pro charakterizaci podtypu receptoru B2B se používá preparát z ilea morčete (tabulka V).
Receptory B1 se studují pomocí proužku králičí aorty, který se připravuje a zpracovává stejným způsobem jako v případě angiotenzinu. Tkáň je téměř necitlivá na kininy, zejména na desArg9BK, agonistu receptoru Bt, na začátku experimentu. Citlivost tkáně se zvyšuje v průběhu několika hodin (až 6-10 h) inkubace, jak se de novo tvoří receptory B1 (55). Kontraktilní účinky kininů se zaznamenávají a analyzují pomocí stejných přístrojů a přístupů popsaných v oddíle I pro angiotenzin. Králičí tkáně lze senzibilizovat na desArg9BK předběžným ošetřením zvířat lipopolysacharidem (LPS), který se aplikuje intravenózně 5 h před usmrcením zvířete (56). Byl zkoumán mechanismus vzniku receptoru B1 působením LPS (60, 61). Aorty a další tkáně odebrané králíkům ošetřeným LPS reagují na desArg9BK od začátku inkubace in vitro (56). Podobně psí renální arterie spontánně exprimují receptory B1 a vykazují vysokou citlivost na desArg9BK (62).
K charakterizaci kininových receptorů v izolovaných orgánech bylo použito několik sloučenin s využitím biologických odpovědí (kontraktilních) tří preparátů (tabulka V). Bradykininy a kallidin jsou silnými stimulátory králičí jugulární žíly (RJV) a ilea morčete (GPI), zatímco desArg9BK a Lys,desArg9BK jsou neaktivní. Opačné pořadí účinnosti je pozorováno u králičí aorty (RA). desArg9BK je antagonistou pouze na RA. Na těchto základech Regoli a Barabé (54) navrhli hypotézu dvou kininových receptorů, B1 (RA) a B2 (RJV, GPI a mnoho dalších preparátů a testů), které byly původně charakterizovány pouze agonisty (54) a následně (viz níže) byly charakterizovány antagonisty. Antagonisté receptoru B2 byli identifikováni Vavrekem a Stewartem (63) a následně vylepšeni různými badateli (64-66) záměnou Pro3 za hydroxyprolin (Hyp), přidáním d-Arg na N konec, substitucí Phe8 za Leu a záměnou dipeptidu Pro7-Phe8 za d-Tic-Oic (67-69). V tabulce V je uveden prototyp každé řady antagonistů, který ukazuje, že b-2-thienyl-elanin (Thi) není v polohách 5 a 9 nutný, zatímco Hyp3 a d-Arg0 jsou důležité pro afinitu, zejména na RJV. Substituce Phe8 Leu, přidaná k ostatním modifikacím, vede k d-ArgBK, který a) téměř postrádá agonistickou aktivitu a b) je aktivní na RJV, méně aktivní na GPI a poměrně slabý na RA (B1), a je tedy poměrně selektivní pro místo B2. Rozdíl mezi hodnotami pA2 (o dvě logaritmické jednotky) mezi RJV a GPI je určujícím zjištěním pro navrhované (tabulka V) rozdělení receptorů B2 na B2A (RJV) a B2B (GPI). D-ArgBK je kompetitivní antagonista, rychle reverzibilní in vivo i in vitro a liší se od Hoe 140, který je nekompetitivní (nerovnovážný), pravděpodobně proto, že má prodlouženou interakci s místy B2A i B2B (59, 67, 68, 70). Rozdíl mezi B2A a B2B podporují výsledky získané s posledními dvěma sloučeninami (tabulka V), které se liší zbytkem ve třetí poloze. Přítomnost Hyp podporuje antagonismus (pA2 7,6) na B2A a částečnou agonistickou aktivitu na B2B, zatímco Tyr3 dává silný agonismus na B2A a poměrně dobrý antagonismus (čistý antagonista) na B2B. Tato nová klasifikace byla uvedena v přehledovém článku (71). Funkční místa kininů jsou tedy B a B2 (uvažuje se o dvou podtypech). Bylo navrženo několik dalších receptorů (B3, B4 a B5) (72-74), ale jejich existence nebyla prokázána solidními experimentálními daty (viz kritický přehled v Ref. 59). Kininy indukované uvolňování histaminu z peritoneálních mastocytů potkana je nespecifický jev, který se přisuzuje kationickému charakteru kininů (75, 76).
.