Leishmanióza psů (CanL) je protozoární infekce/nemoc způsobená Leishmania infantum (synonyma: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi) vysoce rozšířená ve všech zemích Středomoří, kavkazské a blízkovýchodní oblasti Starého světa, jakož i na několika územích Latinské Ameriky (Dantas-Torres et al., 2012). Výsledky infekce u psů se pohybují od subklinických po klinické a od mírného po závažné onemocnění. Ačkoli se parazit může příležitostně přenášet i nevektoriálními způsoby (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), hlavní cestou přenosu je kousnutí infikovanou flebotomní písečnou mouchou. Přibližně od 7 dnů po infikované krevní moučce se u kompetentních přenašečů mohou v předžaludku vyvinout infekční promastigoti rodu Leishmania, kteří jsou při následné krevní moučce vyvrhováni do kůže savčího hostitele (Bates, 2007). Subkliničtí i nemocní jedinci mohou být pro přenašeče infekční; pravděpodobnost, že neúměrně přispějí k dalšímu přenosu („super-spreader“ efekt), se však zvyšuje s délkou trvání a závažností CanL (Courtenay et al., 2014).

Phlebotomus perniciosus je hlavním kompetentním přenašečem L. infantum v celé západní části Středomořské pánve, včetně jižní Evropy a severozápadní Afriky (European Centre for Disease Prevention and Control, 2019). P. perniciosus je navíc zástupcem větší taxonomické skupiny, podrodu Larroussius, kterou tvoří morfologicky, geneticky a biologicky blízké příbuzné druhy působící jako kompetentní přenašeči L. infantum ve středním a východním Středomoří, jako jsou Phlebotomus neglectus a Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Použití lokálních pyretroidů je všeobecně považováno za přístup první volby k ochraně zdravých psů před kousnutím písečnými mouchami infikovanými leishmaniemi (Maroli et al., 2010), zatímco management infikovaných/infekčních psů je složitým úkolem, protože neexistuje široký konsenzus ohledně postupu, který je třeba zvolit. V ideálním případě by měla být individuální veterinární péče při zvládání patologie CanL kombinována s opatřeními, jejichž cílem je zabránit šíření parazita prostřednictvím vektoru. Tato opatření jsou obzvláště důležitá v rámci programů kontroly zoonotických VL, které se v současné době provádějí v několika endemických zemích. Na jedné straně se majitelé zdráhají investovat do pyretroidních přípravků pro již infikované nebo nemocné psy, na druhé straně mají antileishmaniální terapie pouze dočasnou účinnost, aby důsledně snížily nakažlivost psa písečnými mouchami (Miró et al., 2017). Izoxazoliny jsou novou třídou sloučenin zaměřených na centrální nervový systém a nervosvalové spoje členovců tím, že blokují ligandem řízené chloridové kanály, a způsobují tak smrt členovce (Weber & Selzer, 2016). Řada sloučenin byla registrována jako veterinární léčiva na ochranu společenských zvířat proti blechám a klíšťatům s dlouhými poločasy in vivo, které poskytují týdny až měsíce ochrany po jednorázovém perorálním podání (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Tyto vlastnosti přitáhly pozornost k možnému využití isoxazolinů pro kontrolu nemocí přenášených vektory u lidí (Miglianico et al., 2018). Pokud jde o létající hmyz, bylo zjištěno, že míra i doba trvání insekticidní účinnosti se mezi komerčně dostupnými isoxazoliny při podávání psům liší, například proti Triatoma infestans (Loza et al., 2017) nebo písečné mouše Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a), přičemž fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) se ukázal jako nejaktivnější sloučenina s ohledem na výše uvedené parametry účinnosti. V nedávné době bylo v klinické studii léčby psů fluralanerem proti písečným muškám využito kolonizovaného P. papatasi jako cílového druhu (Gomez et al., 2018b). Tento druh však nelze považovat za vhodný model písečné mouchy. Je tomu tak především proto, že P. papatasi není kompetentním přenašečem L. infantum, neboť je refrakterní vůči střevnímu vývoji tohoto parazita. Navíc dřívější studie o lokálních pyretroidech pro psy (Maroli et al., 2010) naznačují, že P. papatasi by mohl být méně citlivý na sloučeniny cílené na centrální nervový systém písečných much než P. perniciosus. Například spot-on přípravek s 50 % permethrinu a 10 % imidaklopridu usmrtil 29 % P. papatasi oproti 49 % P. perniciosus. Tyto úvahy nás vedly ke stanovení nástupu a trvání insekticidní účinnosti proti P. perniciosus po nakrmení psů ošetřených fluralanerem.

Byla provedena paralelně koncipovaná, negativně kontrolovaná, randomizovaná, zaslepená, jednocentrová studie účinnosti. Experimentální psi, skládající se ze samců bíglů ≥ 6 měsíců starých v době zařazení, pocházeli z výzkumné kolonie v Mohammedii v Maroku; studie v životní fázi byla provedena v zařízeních Clinvet. Dospělí jedinci P. perniciosus pocházeli ze španělského kmene udržovaného od června 2012 v zařízení lékařské entomologie Istituto Superiore di Sanità v Itálii při teplotě 28 ± 1 °C a relativní vlhkosti 75-80 %. Pískomilové byli certifikováni jako bezpatogenní a adaptováni na podmínky hromadného chovu se šesti nezávislými podliniemi kolonií. Tří- až devítidenní exempláře byly shromážděny z příslušných vznikajících klecí a rozděleny v podobném věkovém poměru do válcových plastových nádob (400 ml) opatřených těsným víkem, které bylo perforováno a otvor zakryt jemnou gázou držící kousek vaty nasáklé roztokem glukózy. Počet písečných mušek v každé nádobě byl dostatečný pro jednoho psa, přičemž bylo přidáno několik dalších exemplářů jako náhrada za úhyn, ke kterému došlo před pokusy. Květináče byly vloženy do vzduchotěsných plastových sáčků opatřených zvlhčeným filtračním papírem. Sekundární obal se skládal z předehřáté nádoby opatřené zařízením pro prodlouženou stabilitu teploty a digitálním záznamníkem teploty, obklopené pevnou kartonovou krabicí. Krabice byly do Maroka odeslány letecky a doručení proběhlo přibližně do 3 dnů od odeslání. Po doručení byl zkontrolován teplotní záznam a plastové sáčky byly ponechány neotevřené při teplotě 25 ± 3 °C až do vystavení psů. Zvenčí bylo provedeno hrubé posouzení mortality písečných mušek v nádobách a za přijatelnou pro použití byla považována mortalita ≤ 10 % na nádobu. Nakonec byl v době pokusů každý pes vystaven stejné homogenní populaci písečných much stárnoucích 7-14 dní.

Dvacet sedm dní před ošetřením bylo 14 psů plemene bígl uspáno přípravkem Domitor® (Vetoquinol, Lure, Francie) a jejich hlava byla po dobu 1 hodiny vystavena kousancům přibližně 40 samic P. perniciosus v klecích spolu s pěti samci pro podporu kousavého chování s cílem posoudit individuální atraktivitu pro vektor v těchto experimentálních podmínkách. Psi byli seřazeni v sestupném pořadí na základě počtu živých krevních vzorků; dva psi s nejnižším počtem byli ze studie vyloučeni a do studie bylo zařazeno dvanáct psů, kteří byli rozděleni do dvou skupin po šesti psech (skupiny 1 a 2). V den 0 byli psi ze skupiny 2 léčeni perorální dávkou fluralaneru (žvýkací tablety Bravecto®) v uvedené dávce 25 až 56 mg/kg tělesné hmotnosti, zatímco psi ze skupiny 1 zůstali neléčeni. Specifická zdravotní pozorování byla prováděna 1, 2 a 6 hodin po podání fluralaneru poslednímu psovi. Expozice psů přibližně 40-60 samicím P. perniciosus (plus 5-10 samcům) byla provedena paralelně pro obě skupiny, za podobných teplotních a vlhkostních podmínek ve dvou místnostech, ve dnech 1., 28. a 84. (původně se uvažovalo o průběžném hodnocení v období přibližně 50-60 dnů po léčbě, což však nebylo možné z technických a logistických důvodů). Primárním kritériem pro stanovení účinnosti byla míra přežití písečných mušek plně krmených ošetřenými psy ve srovnání s muškami plně krmenými kontrolními psy, přičemž vzorky částečně nebo okrajově krmené krví nebyly brány v úvahu. Aby bylo možné optimálně a trvale porovnávat obě skupiny exemplářů písečných much, byly samičky jednotlivě odebírány z expozičních klecí jemným odsáváním z úst a shromažďovány ve skupinách po ≤ 10 exemplářích v plastových nádobách vyložených sádrou. Květináče byly poté umístěny do krabic s nasycenou glukózou a zvlhčeným filtračním papírem a následně udržovány při teplotě 26 °C. Hodnocení životaschopnosti se provádělo po 6 hodinách (s výjimkou 1. dne) a poté ve 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin po ukončení expozice. Pro posouzení obecné životaschopnosti šarže mouchy písečné použité v každém pokusu byly výše popsané postupy použity jak na krmené, tak na nekrmené samice.

Statistická významnost výsledků insekticidní účinnosti, vyjádřená jako podíl živých nakrmených písečných mušek ze skupiny 2 oproti těm ze skupiny 1, byla vypočtena pomocí lineárního smíšeného modelu zahrnujícího studijní skupinu jako fixní efekt a randomizační blok jako náhodný efekt, přičemž hladina významnosti byla stanovena na α = 0,05 (oboustranně). Model použil Kenward-Rogersovu úpravu pro určení stupňů volnosti jmenovatele.

V 1. den bylo hodnoceno 78 vzorků krmených krví z celkového počtu 159 živých samic odebraných od psů ze skupiny 2 oproti 64 vzorkům krmeným krví/169 živým samicím od psů ze skupiny 1.

V 1. den bylo hodnoceno 78 vzorků krmených krví z celkového počtu 159 živých samic odebraných od psů ze skupiny 1. V den 28 bylo hodnoceno 199/341 živých samic ze skupiny 2 oproti 146/310 samicím ze skupiny 1. V den 84 bylo hodnoceno 240/326 živých samic ze skupiny 2 a 206/339 živých samic ze skupiny 1. V den 84 bylo hodnoceno 240/326 živých samic ze skupiny 2 a 206/339 živých samic ze skupiny 1. V den 84 byly hodnoceny živé samice ze skupiny 2. Tabulka 1 uvádí průměrné podíly přežívajících jedinců P. perniciosus po přijetí krevní moučky u ošetřených a neošetřených jedinců. První den od ošetření bylo prokázáno několik úhynů mezi nakrmenými písečnými muškami již v době odběru z expozičních klecí skupiny 2, ačkoli žádný z exemplářů skupiny 1. Do 24 hodin byli všichni krví nakrmení jedinci ze skupiny 2 mrtví na rozdíl od 11 % krví nakrmených jedinců ze skupiny 1. Na rozdíl od skupiny 2, kde byl úhyn prokázán, byl úhyn u skupiny 1, kde byl úhyn prokázán. Dvacátý osmý den bylo přežívání jedinců krmených psy ze skupiny 2 výrazně nižší než u jedinců ze skupiny 1 již 6 h po podání krevní moučky; opět všichni jedinci krmeni krví ze skupiny 2 byli ve 24 h mrtví, na rozdíl od 3 % jedinců krmených krví ze skupiny 1. U jedinců ze skupiny 1 bylo přežívání výrazně nižší. V 84. dni přežívala až do konce pozorování řada jedinců, kteří byli krmeni ošetřenými psy, s velkými rozdíly v rámci skupiny; jejich míra přežití klesala od 24 h a od 48 h byla výrazně nižší ve srovnání s jedinci krmenými kontrolními psy, přičemž vypočtená insekticidní aktivita přesahovala 50 % až do 96 h pozorování.

Podíl přeživších nekrmených písečných mušek odebraných z expozičních klecí byl rovněž hodnocen až 96 h po expozici každého psa. Byly obecně zvýšené a vyšší ve srovnání s hodnotami u jedinců krmených krví a vykazovaly určité rozdíly mezi jednotlivými dny expozice psa, i když ne tolik mezi experimentálními skupinami v každé expozici. To může odrážet rozdíly v úmrtnosti mezi jednotlivými šaržemi, které se obvykle vyskytují mezi generacemi kolonizovaných pískomilů, a možná i různé podmínky přepravy. Požití krve bylo jedinou proměnnou spojenou se 100% mortalitou písečných much u psů ošetřených fluralanerem (obr. 1).

Předkládaná studie, i když neporovnává různé druhy písečných much, poskytuje další důkaz, že citlivost k insekticidním přípravkům pro psy zaměřeným na centrální nervový systém písečných much, může být vyšší u P. perniciosus než u P. papatasi. Při použití stejného složení a dávek fluralaneru ve studii zahrnující bígly vystavené tomuto druhu zaznamenali Gomez et al. (2018b) částečné přežití krví krmených samic P. papatasi (v řádu 6-7 %) již 17.-31. den po ošetření, které se zvýšilo na přibližně 25 % ve 45. dni.

Je zde > 5denní prodleva, kdy je písečná moucha po požití infikované krevní moučky infekční. Studie systémových insekticidů u písečných mušek proto představují technickou výzvu, pokud jde o udržení vysokého a trvalého přežití kontrolních vzorků krmených krví a zjištění jakýchkoli opožděných insekticidních účinků, které mají stále potenciál blokovat přenos. Tato výzva se liší od většiny běžných studií s ošetřením proti krmení, kdy jsou písečné mouchy usmrceny operátory ihned po expozici psa a vyhodnoceny jako krví krmené/nekrmené. K zajištění smysluplné interpretace a statistické významnosti rozdílů v přežívání mezi léčenými a kontrolními skupinami (např. během sestupné fáze koncentrace léčiv v psí plazmě) jsou nutná dlouhodobá hodnocení. Použití psí krve ex vivo od léčených i kontrolních psů v systémech umělého krmení může být náchylné k bakteriální kontaminaci, a tudíž může vést k rychlému úhynu všech nakažených pískomilů, což umožňuje pouze úzké časové okno pro rozlišení mezi aktivními a neaktivními léčivy (Gomez et al., 2018a). V této studii byla míra přežití kontrolních exemplářů krmených krví velmi uspokojivá, v rozmezí 61-81 % po 96 hodinách po krmení krví.

Farmakokinetika fluralaneru v plazmě psů po jednorázovém perorálním podání vykazovala pravidelný sestupný trend až do přibližně 100 dnů po podání, kdy se stává nedetekovatelnou (Kilp et al., 2014). Je zajímavé, že teoretické střední rozmezí přibližně 40-100 ng fluralaneru/ml plazmy, odpovídající 84 dnům po léčbě, bylo stále schopno usmrtit > 50 % P. perniciosus do 48 h po podání krevní stravy. Proto je pravděpodobné, že i střední plazmatické koncentrace, jako jsou koncentrace očekávané mezi 28. a 84. dnem od ošetření, poskytují zvýšenou insekticidní aktivitu proti přenašeči, a proto je třeba provést nové studie, které by to potvrdily. Na druhou stranu výsledky této studie s ohledem na tři časové body jasně ukazují souvislý trend snižování účinnosti v průběhu celé studie.

Závěrem lze říci, že léčba psů fluralanerem představuje slibnou metodu pro snížení fondu infikovaných vektorů v endemickém prostředí zoonotických VL. Kromě toho by použití fluralaneru v kombinaci s preventivním lokálním ošetřením pyretroidy, pokud to není kontraindikováno z hlediska bezpečnosti psa (Walther et al., 2014), mohlo přinést výhody pro psy ve vysoce rizikových oblastech.