Strategie používané při regulaci diferenciálně reagujících genů

Mezinformace genové regulace morfogenní signalizací musí poskytovat způsob, jak převést malé rozdíly v síle signálu na prahové reakce, při nichž změny v genové expresi typu „vše nebo nic“ umožňují výběr diskrétních buněčných identit ve vyvíjející se tkáni. Již před více než jednou generací byly navrženy strategie, které by mohly tento jev vysvětlit (Monod a Jacob, 1961), a některé z těchto myšlenek se začínají znovu objevovat na základě novějších molekulárních studií. Pokusíme se tyto strategie rozdělit do obecných konstrukčních rysů, které mohou vysvětlit rozdílnou regulaci genů pomocí stupňované signalizace (obr. 2). Je zřejmé, že se tyto kategorie překrývají a jejich seznam není úplný. Je zřejmé, že většina, ne-li všechny dobře prostudované morfogenní dráhy využívají ke kontrole exprese cílových genů kombinaci těchto mechanismů. Pro ilustraci klíčových rysů každé z těchto strategií jsme nastínilipříklady jejich využití při interpretaci specifických morfogenních drah.

Afinita k vazebnému místu

Hlavní mechanismus, který byl hojně zkoumán, využívározdílů v afinitě transkripčního efektoru k vazebným místům s různými sekvencemi DNA (obr. 2A). Paradigmatem tohoto jevu je gradient Dl v raném embryu drozofily, který řídí DV vzorování a gastrulaci prostřednictvím aktivace a represe cílových genů v závislosti na koncentraci(Stathopoulos a Levine,2004). Rozsáhlé studie specifických enhancerů, které reagují na různé prahové hodnoty Dl, odhalily podrobný obraz mechanismu genové regulace. Na základě jejich reaktivity na Dl byly cílové geny rozděleny do různých kategorií. Geny typu I, jako jestwist (twi), jsou aktivovány v předpokládaném mezodermu, kde jsou maximální hladiny jaderného Dl (obr. 1C). Enhancer těchto genů má tendenci mít vazebná místa s nízkou afinitou k Dl, která jsou obsazena pouze při nejvyšší koncentraci Dl, což omezuje expresi genů typu I na presumptivní mezoderm (Jiang a Levine, 1993). Pro srovnání, enhancery genů typu II, jako je rhomboid(obr. 1C), obsahují vazebná místa s vysokou afinitou k Dl, která jsou vázána a aktivována nižšími hladinami Dl, které jsou přítomny ve ventrálním neuroektodermu(Ip et al., 1992a). Nedávná počítačová analýza velkého souboru enhancerů reagujících na Dl z genomů D. melanogaster a příbuzných druhů potvrdila, že afinita k Dl je hlavním faktorem určujícím expresní domény cílových genů Dl(Papatsenko a Levine, 2005). vysoce afinitní vazebné místo Dl však nemusí nutně vést k aktivaci transkripce, pokud je Dl přítomen. V některých případech může Dl navázaný na místo s vysokou afinitou také potlačovat transkripci, což naznačuje, že při určování reakce genů na Dl hraje významnou roli také architektura enhanceru (Stathopoulos a Levine,2004). Navíc kooperativní interakce mezi Dl a dalšímifaktory také významně ovlivňují reaktivitu některých genů.

Druhým příkladem je interpretace gradientu Bcd, který je zodpovědný za regulaci genové aktivity podél anteroposteriorní (AP) osy v embryu Drosophily. Dřívější studie interpretace Bcdidentifikovaly afinitu vazebných míst Bcd jako klíčovou determinantu pro stanovení hranice exprese cílového genu hb(obr. 1B). Snižující se afinita Bc vede k expresi omezené více dopředu, kde jsou hladiny Bc vyšší. Proto byl navržen model interpretace gradientu Bcd, v němž geny s anteriorně omezenou expresí mají ve svém enhanceru vazebná místa Bcd s nízkou afinitou, a proto vyžadují pro obsazení a aktivaci vysokou koncentraci Bcd. Naopak místa s vyšší afinitou v enhanceru hb umožňují expresi v postrannějších polohách, kde je koncentrace Bcd nižší(Driever et al., 1989;Struhl et al., 1989). Na podporu tohoto modelu má gen orthodenticle, který je regulován enhancerem s nízkou afinitou Bcd, úzký expresní vzorec(Gao et al., 1996)(obr. 1B).

Nejen v precelulárním embryu využívá odpověď genů na aktivaci transkripčních faktorů afinitu vazebných míst. Tentomechanismus je relevantní i v konvenčnějších podmínkách po celulizaci,jako je interpretace extracelulárního gradientu Dpp v embryuDrosophily. V reakci na maximální úroveň signalizace Dpp v dorzální střední linii embrya je cílový gen Race exprimován v úzkém pruhu buněk v předpokládané amnioseróze (obr. 1D). Enhancer odpovědný za tuto aktivitu obsahuje nízkoafinitní vazebná místa pro Mad, transkripční efektor Dpp. Změna těchto míst za účelem zvýšení jejich afinity k Madu rozšiřuje související expresní vzorec na vzorec charakteristický pro geny, které reagují na nižší práh signalizace Dpps (Wharton et al.,2004).

Kombinační vstupy

Afinita k vazebným místům může vysvětlit některé z výpadků morfogenního gradientu; obecně však samotná afinita nestačí k řízení celého komplexu transkripčních odpovědí. Například afinita vazebných míst Bcd sice určuje hranice exprese hbcílového genu (Driever et al.,1989; Struhl et al.,1989), ale výpočetní studie většího vzorku regulačních modulů Bcdcis ukazuje, že u většiny existuje slabá korelace mezi silou vazebných klastrů Bcd a hranicemi exprese agenu. Navíc se zdá, že pouze několik cílových genů je aktivováno samotným Bcd a exprese těchto genů je omezena na nejpřednější části embrya, které obsahují maximální hladiny Bcd (Ochoa-Espinosa a kol., 2005), jak bylo pozorováno u syntetického reportéru obsahujícího pouze vazebná místa Bcd (Crauk a Dostatni, 2005). u mnoha genů není hlavním určujícím faktorem pro interpretaci pozičních informací absolutní afinita k Bcd. Místo toho mohou o interpretaci gradientu Bcd rozhodovat jiné prvky v promotorech genů a integrace pozitivních a negativních transkripčních vstupů od proteinů navázaných na tyto prvky. U genů aktivovaných ve střední a postranní oblasti embrya má většina enhancerů cílových genů Bcd tendenci mít další vstupy od transkripčních faktorů Hb, Caudal (Cad) a/nebo Krüppel (Kr) (Ochoa-Espinosa etal., 2005). Hb a Cad jsou mateřsky exprimovány a zygoticky aktivovány a potlačovány Bcd na transkripční a translačníúrovni (Driever aNusslein-Volhard, 1989; Dubnau a Struhl, 1996; Rivera-Pomaret al., 1996). Hb i Cad zvyšují transkripční aktivaci závislou na Bcd (La Rosee etal., 1997; Simpson-Brose etal., 1994). Proto může gradient Bcd fungovat spolu s Hbandem nebo Cadem tak, že vytváří širokou doménu, kde může docházet k aktivaci enhancerů, a rovnováha pozitivních a/nebo negativních vstupů od těchto a dalších transkripčních faktorů by určovala hranice expresní domény (Ochoa-Espinosa et al., 2005). transkripční represor Kr může být jedním z takových negativních vstupů, který stanovuje ostrou zadní hranici některých cílů Bcd (Kraut a Levine, 1991). Kromě vazebných míst pro jiné transkripční efektory ovlivňuje genovou expresi také uspořádání vazebných místBcd a údaje naznačují, žeBcd se váže na DNA kooperativně. Vazba Bcd na místo s vysokou afinitou proto potencuje vazbu na sousední místo s nízkou afinitou(Burz et al., 1998). Exprese proteinu Bcd s mutací, která narušuje kooperativitu v embryu, vede k přednímu posunu expresních vzorců cílových genů, jako je např. ashb, a ke snížení ostrosti jejich zadních hranic(Lebrecht et al., 2005).

Integrace vstupů od Dl a od jiných transkripčních faktorů rovněžovlivňuje odpověď genů podél osy DV embrya drozofily. Analýza enhancerů cílových genů Dl u různých drozofilů(Papatsenko a Levine, 2005)odhalila, že stejně jako prahové geny typu I mají tendenci mít nižší afinitu k Dl než geny typu II, existuje u těchto promotorů podobný trend pro afinitu dalšího transkripčního faktoru, Twi. Prahové genotypy typu II mají navíc tendenci mít pevnou orientaci a vzdálenost mezi místy Dl a Twi. To odpovídá výskytu synergických interakcí mezi transkripčními faktory Dl a Twi, které jsou důležité pro aktivaci cílů typu II v neurektodermu, kde jsou hladiny Dl a Twi nízké(Papatsenko a Levine, 2005).Zesilovače typu II mají běžně další pozitivní vstup od aktivátoruSuppressor of Hairless(Erives a Levine, 2004) a negativní vstup od represoru Snail. snail je cílový gen Dl, který je aktivován v presumptivním mezodermu(Ip et al., 1992b), čímž vylučuje expresi genů typu II z mezodermu(Kosman et al., 1991). Na rozdíl od enhancerů typu II existuje negativní korelace mezi kvalitou míst Dl a Twi u enhancerů typu I, tj. dobré místo Dl je spojeno se špatným místem Twi a naopak. To naznačuje, že u těchenhancerů, kde jsou špičkové úrovně Dl a Twi, fungují aktivátory kompenzačním způsobem (Papatsenko aLevine, 2005). Důležité je, že studie se syntetickými enhancery také ukazují, že přítomnost míst Twi a Dl vede k ostřejšímu expresnímu vzorci ve srovnání se slabším, rozmazaným vzorcem, který je pozorován u samotného Dlal (Szymanski a Levine,1995). Je tedy zřejmé, že kromě afinity vazebných míst k hlavnímu transkripčnímu efektoru morfogenu je důležitýmdeterminantem prahových odpovědí integrace pozitivních a negativních vstupů na enhancer (obr. 2B).

Feed-forward loops

Zapojení kombinatorických vstupů do řízení diferenciální genovéexprese umožňuje vznik komplexních regulačních vztahů mezi odpovídajícími geny. Jedním z takových vztahů je smyčka feed-forward(obr. 2C), jejíž příklad byl nedávno popsán pro aktivaci Race signalizací Dpps. Kromě afinity vazebných míst Mad v enhanceru Race (Wharton et al.,2004) hraje při aktivaci Race klíčovou roli transkripční faktor Zerknüllt (Zen). Zen a Mad se vážou na sousední místa v enhanceru Race a pro aktivaci Race je nezbytná přímá interakce mezi nimi (Xuet al., 2005). zen je sám o sobě gen regulovaný Dpp, který závisí na vrcholové hladině signalizace Dpp (Rushlow et al., 2001). K indukci genu Race je tedy zapotřebí, aby špičkové hladiny signalizace Dpp aktivovaly vysoké hladiny genu Mad a indukovaly expresi genu Zen, které společně fungují při aktivaci genu Race (Xu et al., 2005). Tento typ regulační genetické sítě, v níž transkripční faktor X aktivuje transkripční faktor Y a společně X a Y aktivují cílový gen Z, se označuje jako smyčka feed-forward (Lee et al., 2002).

Smyčka Mad-Zen feed-forward může představovat obecnou strategii, která se používá k aktivaci dalších špičkových cílových genů Dpp (Xu et al., 2005). Je jisté, že smyčky feed-forward fungují i v jiných genových sítích reagujících na morfogen. Například Twi, který funguje s Dl a reguluje geny podél osy DV, je sám kódován genem reagujícím na Dl(Jiang a Levine, 1993). Výskyt smyček typu feed-forward při interpretaci morfogenních gradientů raných embryí drozofily naznačuje, že jeho typ regulačního okruhu je pro interpretaci gradientů obzvláště vhodný. Údaje z jiných systémů ukazují, že smyčky typu feed-forward jsou užitečné pro rozlišení nestálých vnějších signálů, aby se zajistilo, že aktivace nastane pouze v reakci na trvalou signalizaci, a tím poskytují prostředek k vyrovnávání malých výkyvů signálu(Shen-Orr et al., Navíc požadavek koincidence, který je vlastní smyčkám feed-forward, může také zajistit vysoce citlivé reakce na malé změny v úrovni signálu (Goldbeter a Koshland, 1984), což je vlastnost, která by umožnila vytvářet prahové reakce v reakci na malé změny v počáteční síle signálu.

Pozitivní zpětná vazba

Autoregulace nebo smyčky pozitivní zpětné vazby (viz obr. 2D) v reagujících genech mohou rovněž hrát roli při interpretaci gradientu a poskytovat mechanismus pro vytváření všech nebo žádných odpovědí při prahových úrovních signalizace. Dobře charakterizovaným příkladem je regulace Hoxb4 v zadním mozku bezobratlých (Gould et al.,1998; Gould et al.,1997). Gradient kyseliny retinové (RA) určuje polohu podél osy AP formujícího se zadního mozku obratlovců a je zodpovědný za určení přední hranice indukceHoxb4. RA aktivuje jaderné receptory RA (RAR) a tyto receptory se vážou na definovanou enhancerovou oblast v lokusu Hoxb4 a aktivují jeho expresi. V raných fázích vývoje zadního mozku tento mechanismus vytváří difuzní přední hranici exprese Hoxb4. Druhý enhancerový prvek, pozdní enhancerový prvek, v rámci lokusu Hoxb4 reaguje na samotný protein Hoxb4. Proto v pozdějších vývojových stadiích po indukci Hoxb4 zprostředkované RA tento element reaguje na indukovaný Hoxb4 a je dostatečný k usměrnění exprese tohoto genu až k normální přední hranici genové exprese. Odstupňovaná aktivita RA tedy iniciuje expresi Hoxb4, autoregulace zprostředkovaná Hoxb4 zpřesňuje a udržuje jeho expresi v průběhu vývoje zadního mozku. Hoxb4 reguluje RARβ podobným způsobem, což naznačuje, že mezi těmito proteiny existuje vzájemný pozitivní zpětnovazební okruh, který vytváří a udržuje diskrétní hranice exprese Hoxb4(Serpente et al., 2005).

Křížová represe

Represivní interakce mezi morfogenem regulovanými geny jsou rovněždůležité pro interpretaci gradientu (obr. 2E). Dobře prostudovaným příkladem je podíl křížové represe na rozdělení neuroektodermu Drosophily do tří sloupců podél osy DV (Cowdena Levine, 2003). Toto rozdělení je zprostředkováno třemi homeoboxovými transkripčními faktory (Vnd, Ind a Msh), které vymezují ventrální, intermediální a dorzální sloupce. Rozdílné prahové hodnoty Dlsignalizace indukují tyto geny, ale vznik odlišných sloupců genové exprese, které jsou ohraničeny náhlými přepnutími v expresi každého homeodoménového proteinu, závisí na asymetrických křížových regulačních interakcích mezi těmito proteiny. Tímto způsobem homeodoménové proteiny exprimované ve více ventrálních doménách potlačují proteiny exprimované více dorzálně. Zvýšení signalizace Dl má tedy za následek postupnou aktivaci každého genu a odpovídající represi genů indukovaných nižšími hladinami aktivity Dla – proces, který byl označen jako „ventrální dominance“.

Nervová soustava obratlovců vykazuje variaci tohoto regulačního motivu, která zahrnuje využití vzájemné křížové represe nebo reciproční negativní zpětné vazby mezi dvojicemi genů. Buňky neurální trubice obratlovců reagují na odstupňovanou signalizaci Shh regulací exprese řady transkripčních faktorů, které zahrnují homeodoménové ortology Vnd, Ind aMsh (Briscoe a Ericson,2001). Na základě způsobu regulace signalizací Shh se tyto transkripční faktory dělí do dvou skupin, označovaných jako proteiny třídy I a II. Exprese každého proteinu třídy I je zhášena při odlišných prahových hodnotách aktivity Shh; naopak exprese proteinů třídy II závisí na signalizaci Shh. In vivo rozdělují expresní vzorce těchto genů ventrální neurální trubici na ostře ohraničené domény, které připomínají domény pozorované u drozofily, přičemž ventrální hranice většiny proteinů třídy I odpovídá dorzální hranici exprese proteinu třídy II. Toho je dosaženo selektivními křížově-represivními interakcemi mezi komplementárními dvojicemi proteinů třídy I a třídy II exprimovaných v sousedních doménách (Briscoe et al.,2001; Briscoe et al.,2000). V nervovém systému obratlovců i drozofil (Cowden a Levine,2003) represivní interakce stanovují prahové hodnoty genové odpovědi a vytvářejí ostré hranice genové exprese, které zajišťují, že každá progenitorová doména exprimuje odlišnou sadu transkripčních faktorů. Tentomechanismus převádí gradient poziční informace na diskrétní změny v genové expresi typuall-or-none.

Princip křížových regulačních interakcí je pozorován i v jinýchvývojových tkáních, což naznačuje, že může představovat obecnou strategiipoužívanou k interpretaci odstupňované poziční informace. Gradient Bcd určuje expresní domény genů Gap, které umísťují geny pro párové pravidlo a polaritu segmentů, nezbytné pro segmentaci embrya (Jäckle a kol.,1986; Kraut a Levine,1991). Zdá se, že asymetrické i reciproční represivní interakce mezi Gap geny tvoří složitý obvod. Silná reciproční represe mezi dvojicemi genů zajišťuje vzájemnou exkluzivitu exprese, zatímco asymetrická represe předních Gap genů zadnějšími geny vede k přednímu posunu jejich zadních hranic (Jaeger et al., 2004;Monk, 2004) (obr. 2E). Tato zjištěnízdůrazňují dynamický rys interpretace gradientu Bcd, kdy prostorové domény genové exprese mohou být přemístěny následnými asymetrickýmirepresními interakcemi mezi Gap geny.

Reciproční gradient represoru

Společným rysem mnoha morfogenních gradientů je vytvoření inverzního gradientu transkripčního represoru, který je reciproční vůči transkripčnímu efektoru aktivovanému signálem(obr. 2A). V případě signalizace Shhand Wnt primární transkripční efektory těchto drahpředstavují transkripční represi v nepřítomnosti signalizace, ale při signalizaci se mění na transkripční aktivátory(Giles et al., 2003;Jacob a Briscoe, 2003). Součástí signalizace je pak vytvoření gradientu transkripčního aktivátoru s opačným gradientem represoru, což je strategie, která by mohla zvýšit změny transkripční aktivity zprostředkované morfogenem. Varianta této strategie je použita při výkladu gradientu Dpp v imaginálním disku křídla drozofily. Zde se zdá, že hlavní úlohou signalizace Dpp je vytvoření recipročního gradientu represorového proteinu Brinker (Brk). Mad a Medea přímo potlačují Brk v komplexu s transkripčním faktoremSchnurri (Pyrowolakiset al., 2004) a citlivost na potlačení Brk určuje hranice exprese prahových odpovědí Dpp, včetně spalt(sal) a optomotoricky slepých (omb) (Muller et al., 2003). exprese omb je potlačena u klonů mutantů mad z důvodu dereprese Brk. U klonů s dvojitou mutací brk mad však dochází k ektopické aktivaci omb, což naznačuje, že pro expresi omb je jediným požadavkem signalizace Dpp potlačení Brk. Naproti tomu exprese maximální úrovně sal vyžaduje pozitivní vstup ze strany Smads (Affolter et al.,2001; Barrio a de Celis,2004). V jiných vývojových kontextech bylo zjištěno, že Mad a Brk soutěží o stejná vazebná místa (Affolter a kol., 2001), i když význam této skutečnosti pro vytvoření domén exprese cílových genů křídel je nejasný.

.