Sestavení a anotace genomu medúzy

Představujeme první de novo sestavený genom medúzy Nomury (Nemopilema nomurai; obr. 1b). Jeho výsledkem je genom o velikosti 213 Mb složený z 255 scaffoldů a délce N50 2,71 Mb, který obsahuje pouze 1,48 % mezer (Additional file 1: Tables S2 and S3). Hybridní sestava Nemopilema byla vytvořena pomocí kombinace technologií sekvenování s krátkými a dlouhými čteními, která se skládala z 38,2 Gb jednomolekulového sekvenování v reálném čase (SMRT) společnosti Pacific Biosciences (PacBio) spolu s 98,6 Gb syntetických dlouhých čtení Illumina s krátkým vložením, mate-pair a TruSeq (Additional file 1: Figures S3-S5; Tables S4-S7). Výsledná sestava vykazuje nejdelší kontinuitu mezi genomy hlístic (Additional file 1: Table S9). Kombinací metod predikce de novo (s využitím transkriptomů tkání medúzy a chapadla) a homologních genů jsme předpověděli 18 962 genů medúz kódujících proteiny (Additional file 1: Tables S10 and S11, Additional files 2 and 3). Tímto postupem byl získán nejvyšší počet jednokopírovaných ortologických genů mezi všemi dosud publikovanými sestavami genomů nebilaterálních metazoí (Additional file 1: Table S12). Bylo zjištěno, že celkem 21,07 % genomu medúzy tvoří transponovatelné elementy, ve srovnání s genomy Acropora digitifera (9,45 %), Nematostella vectensis (33,63 %) a Hydra vulgaris (42,87 %) (Additional file 1: Table S13).

Genom Nemopilema jsme porovnali s genomy jiných hlístic, včetně nedávno publikovaných genomů Aurelia aurita a Clytia hemisphaerica , které všechny pocházejí z převážně přisedlých taxonů, abychom odhalili jedinečné funkce (aktivní pohyblivost), fyzickou strukturu (zvon medúzy) a chemii (jed). Provedli jsme také analýzu transkriptomu medúzy Nemopilema nomurai i medúzy Sanderia malayensis ve třech typech tkání medúzy a čtyřech vývojových stádiích.

Evoluční analýza medúz

Pro identifikaci evolučních znaků specifických pro medúzy jsme zkoumali expanzi a kontrakci genových rodin u jednoho jednobuněčného holozoa a 13 metazoí pomocí 18 458 ortologických genových rodin (viz Doplňkový soubor 1: oddíl 4.1). Z nich 10 434 bylo nalezeno u Nemopilema a 6764 bylo společných pro všechny tři dostupné třídy hlístic (Scyphozoa: Nemopilema nomurai a Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera a Nematostella vectensis ; obr. 2a). Fylogeneze sestavená na základě těchto ortologů odhalila monofyletický klad hlístic, který se oddělil od kmene metazoí ještě před evolucí bilaterií (obr. 2b; Additional file 1: Figure S7). Abychom zjistili, kolik genů se v každé evoluční éře objevilo v genomu medúzy Nomura, vyhodnotili jsme také evoluční stáří genů kódujících proteiny. Při rozdělení genů medúz do tří širokých evolučních ér jsme zjistili, že zatímco většina (80 %) genů je stará (starší než 741 Mya), několik (~ 3 %) je středního stáří (741-239 Mya) a některé (17 %) jsou mladé (od 239 Mya do současnosti; obr. 2c; Additional file 1: Figure S10). Je zajímavé, že normalizace počtu genů podle stáří a délky evoluční éry naznačuje, že obměna genů je nejvyšší v blízkosti současnosti. Celkem genom rodu Nemopilema obsahoval 123 rozšířených a 164 zkrácených genových rodin ve srovnání se společným předkem rodu Nemopilema a Aurelia (obr. 2b; viz Doplňkový soubor 1: oddíl 4.2). Termíny genové ontologie (GO) související se smyslovým vnímáním byly v linii Cnidaria ve srovnání s Bilateria zastoupeny nedostatečně, což přesně odráží méně komplexní smyslový systém cnidarií (Additional file 1: Tables S14 and S15). Nicméně transport neurotransmiterů (GO:0006836, P = 6,01E- 10) byl významně obohacen u linie Scyphozoa ve srovnání se společným předkem Scyphozoa a Hydrozoa (Additional file 1: Tables S16 and S17), pravděpodobně díky rovnováze a zrakovým strukturám, jako je statocysta a ocelli, které jsou u pohyblivých medúz propracovanější než u přisedlých polypů . Ve srovnání se společným předkem Nemopilema a Aurelia vykazovala Nemopilema rozšířené rodiny genů spojených s metalopeptidázovými aktivitami (GO:0008237, P = 2,86E- 14; Additional file 1: Tables S18 and S19). Kromě toho jsme našli 1589 ortologických genových rodin, které jsou specifické pro Scyphozoa. Testy obohacení genů specifických pro scyphozoa ukázaly termíny transport sodíkových iontů, aktivita iontových kanálů a aktivita neurotransmiterových receptorů (Doplňkový soubor 1: Tabulka S20).

Genomický kontext a geny spojené se svaly

Medúzy mají dva základní typy svalů: epiteliomuskulární buňky, které jsou převládajícími svalovými buňkami vyskytujícími se u přisedlých hlístic, a příčně pruhované svalové buňky umístěné v medúzovém zvonu, které jsou nezbytné pro plavání. Abychom pochopili evoluci aktivního plavání u medúz, zkoumali jsme jejich kodonový bias ve srovnání s ostatními metazoany výpočtem obsahu guaninu a cytosinu na pozici třetího kodonu (GC3) (Additional file 1: Figure S13). Předpokládá se, že geny s vysokým obsahem GC3 jsou adaptabilnější na vnější stresy (např. změny prostředí) . Mezi 100 nejlépe hodnocenými geny s vysokým podílem GC3, regulací svalové kontrakce a neuropeptidovými signálními drahami byly GO termíny specifické pro Nemopilema (Additional file 4: Tables S25 and S26). Vápník hraje klíčovou roli při kontrakci příčně pruhovaného svalu u medúz a signální dráha vápníku (GO:0004020, P = 5,60E- 10) vykazovala vysokou úroveň GC3 bias specifických pro Nemopilema. Prvních 500 GC3 genů Nemopilema a Aurelia bylo obohaceno o termíny GO související s homeostázou (např, buněčná chemická homeostáza a transport sodíkových iontů), o nichž předpokládáme, že jsou nezbytné pro aktivaci svalových kontrakcí, které pohánějí pohyblivou dravost medúz (Doplňkový soubor 1: oddíl 5.1; Doplňkový soubor 4: tabulky S27 a S28).

Jelikož bylo zjištěno, že u cnidarií chybí titinový a troponinový komplex, což jsou kritické složky příčně pruhovaných svalů bilaterií, předpokládalo se, že se u těchto dvou kladů vyvinuly příčně pruhované svaly nezávisle . Průzkum genů, které kódují svalové strukturální a regulační proteiny u plžů, ukázal konzervované jádro aktin-myozinového kontraktilního aparátu eumetazoanů sdílené s bilaterii (Additional file 1: Table S32). Stejně jako ostatním cnidariím však i Nemopilema postrádá titinový a troponinový komplex, které jsou klíčovými složkami příčně pruhovaných svalů bilaterií. Také γ-syntrofin, součást dystroglykanového komplexu, u Nemopilemy, Aurelie a Hydry chyběl. Nemopilema a Aurelia však mají α/β-Dystrobrevin a α/ε-Sarcoglycan dystroglycan-associated costamere proteiny, což naznačuje, že několik složek dystroglykanového komplexu bylo ztraceno po rozdělení Scyphozoa-Hydrozoa. Bylo naznačeno, že Hydra prošla sekundárním zjednodušením oproti Nematostelle, která má větší míru specializace typu svalových buněk . Ve srovnání s Hydrou a Nematostellou vykazují Nemopilema a Aurelia střední komplexitu svalových strukturních a regulačních proteinů mezi Hydrou a Nematostellou.

Profilování transkriptomu zvonu medúzy a chapadla

Medúzy zvon a chapadlo jsou morfologicky odlišné a plní diskrétní fyziologické funkce . Vytvořili jsme transkriptomy zvonu a chapadla medúzy Nemopilema a menší Sanderia malayensis, které lze pěstovat v laboratoři, abychom mohli posoudit regulaci vývoje (Additional file 1: Table S29). Testy obohacení vysoce exprimovaných genů ukázaly, že funkční kategorie spojené se svaly (např. svalový myozinový komplex a morfogeneze svalové tkáně) byly obohaceny u zvonu (obr. 3a; doplňkový soubor 5: tabulky S30-S33). Myoziny tvoří nadrodinu motorických proteinů a hrají klíčovou roli ve svalové kontrakci a podílejí se na celé řadě pohybových procesů u eukaryot. Kriticky důležité je, že proteiny rodiny myosinů II, které se nacházejí v buňkách příčně pruhované i hladké svalové tkáně, jsou zodpovědné za vytváření kontrakce ve svalových buňkách . Cnidariové mají jak epiteliomuskulární buňky, tak buňky příčně pruhované svaloviny. Příčně pruhovaná svalovina je důležitou součástí podbřišní části zvonu medúzy, kde její rychlé kontrakce pohánějí jedinečné plavání medúz založené na pohonu. Zjistili jsme, že rodiny genů pro těžký myozinový řetězec typu II (MYH) a lehký myozinový řetězec (MYL) jsou ve zvonu vysoce exprimovány a jsou úzce spojeny s buňkami příčně pruhovaného a hladkého svalstva . Je zajímavé, že Nemopilema a Aurelia vykazovaly největší počty kopií genů MYH a MYL mezi nebilaterálními metazoany (obr. 3c; doplňkový soubor 1: obrázky S14-S17; tabulky S38-40) a šest ze sedmi genů MYH a 12 z 21 genů MYL u Nemopilemy vykazovalo vyšší expresi ve zvonu než v chapadlech s velmi vysokým ~ 8,8násobným, resp. ~ 17násobným nárůstem (obr. 3d). Tyto výsledky naznačují, že kombinace expanze počtu kopií rodin myozinových genů typu II a vysoké exprese genů spojených se svaly potvrdila, že svaly ve zvonu medúzy jsou důležitým faktorem určujícím pohyblivost medúzy.

Naopak analýza genové exprese v chapadlech odhalila vysoké hladiny exprese RNA funkčních kategorií spojených s neurotransmitery (komplex iontových kanálů, postsynapse a aktivita neurotransmiterových receptorů; obr. 3b; Additional file 5: Tables S34-S37); v souladu s anatomií chapadel medúz, která obsahují smyslové buňky a volný plexus neuronální subpopulace na bázi ektodermu .

Tělesné vzorování u medúz

O rané evoluci tělesného vzorování u společného předka metazoí se vedlo mnoho diskusí, zejména pokud jde o vznik a rozšíření rodin genů Hox a Wnt . Celkem 83 homeodomén bylo nalezeno u Nemopilema, zatímco 82, 41, 120 a 148 homeodomén bylo nalezeno u Aurelia, Hydra, Acropora a Nematostella (Additional file 1: Table S41). Pět z osmi Hox genů u Nemopilema je zadního typu, které jsou spojeny s vývojem aborální osy a shlukují se se zadními Hox geny Nematostella, HOXE a HOXF (Additional file 1: Figures S18-S20). Aurelia má šest genů Hox zadního typu, ale nemá geny typu HOXB, C a D (HOX2 u člověka). Ačkoli chybí u Hydry a Acropory, syntézní analýzy genů ParaHox u Nemopilemy ukazují, že gen XLOX/CDX se nachází bezprostředně za GSX ve stejné tandemové orientaci jako u Nematostella, což naznačuje, že XLOX/CDX byl přítomen u společného předka hlístic a následně byl u některých linií ztracen (Additional file 1: Figure S21). Geny související s Hox, EVX a EMX, jsou přítomny také u Nemopilema a Aurelia, ačkoli u Hydra chybí. Vzhledem k velkému množství ancestrální diverzity genů Wnt bylo navrženo, že signalizace Wnt řídila vývoj tělesného plánu u raných metazoí . Nemopilema má 13 ortologů Wnt reprezentujících 10 podčeledí Wnt (Additional file1: Figure S22; Table S42). Wnt9 chybí u všech hlístic, což pravděpodobně představuje ztráty u společného předka hlístic. U plžů došlo k dynamickým liniově specifickým duplikacím podčeledí Wnt, například Wnt8 (Nematostella, Acropora a Aurelia), Wnt10 (Hydra) a Wnt11 a Wnt16 (Nemopilema a Aurelia). Bylo navrženo, že společný shluk genů Wnt (Wnt1-Wnt6-Wnt10) existoval u posledního společného předka členovců a deuterostomů . Naše analýzy genomů hlístic a dvoukřídlých odhalily, že Acropora tento klastr také má, zatímco Nemopilema, Aurelia a Hydra Wnt6 postrádají, což naznačuje ztrátu genu Wnt6 u společného předka Medusozoa (Additional file 1: Figure S23). Dohromady mají medúzy srovnatelný počet genů Hox a Wnt s ostatními hlísticemi, ale dynamický repertoár těchto genových rodin naznačuje, že se hlístice vyvinuly nezávisle, aby přizpůsobily své fyziologické vlastnosti a životní cyklus.

Přechod z polypu na medúzu u medúz

Přechod z polypu na medúzu je u medúz ve srovnání s ostatními přisedlými hlísticemi výrazný. Abychom pochopili genetický základ vzniku struktury medúzy u medúz, porovnali jsme transkripční regulaci mezi hlísticemi a napříč vývojovými stadii medúz (viz doplňkový soubor 1: oddíly 7.1 a 7.2). Sanderiové transkripty jsme sestavili pomocí šesti sdružených vzorků transkriptomů (Additional file 1: Table S43). Sestavené transkripty měly celkovou délku 61 Mb a výsledkem bylo 58 290 izoforem transkriptů a 43 541 jedinečných transkriptů s N50 2325 bp. V průměru bylo 87 % čtení RNA zarovnáno do sestavených transkriptů (Additional file 1: Table S44), což naznačuje, že sestavení transkriptů představuje většinu sekvenovaných čtení. Kromě toho bylo složení proteinových domén obsažených na prvních 20 místech mezi Nemopilema a Sanderia dosti podobné (Additional file 1: Table S45). Abychom získali diferenciálně exprimované geny pro jednotlivá stadia, porovnávali jsme každé stadium s předchozím nebo následujícím stadiem životního cyklu medúzy. Stádium polypa, které představuje přisedlé stádium v životním cyklu medúzy, vykazovalo obohacené termíny související s aktivitou iontových kanálů a energetickým metabolismem (regulace metabolického procesu a metabolický proces aminokyselin; Additional file 1: Table S46). Aktivní krmení v polypu stimuluje asexuální proliferaci buď do dalších polypů, nebo metamorfózu do strobila . Vzhledem k tomu, že anthozoani netvoří medúzu, je asexuální rozmnožovací stadium strobila důležitým stadiem, ve kterém lze studovat metamorfózu z polypa na medúzu. V tomto stadiu byly ve srovnání se stadiem polypa vysoce exprimovány termíny GO související s biosyntetickými a metabolickými procesy amidů (Additional file 1: Table S47). Bylo zjištěno, že RF-amidové a LW-amidové neuropeptidy byly spojeny s metamorfózou u hlístic . Toto zjištění se nám však nepodařilo potvrdit v našich srovnáních stádií strobila a ephyra. V našem systému jsou vzorce genové exprese obou stadií poměrně podobné. U ephyry, uvolněného pohyblivého stadia, byly termíny GO zahrnující biosyntetické a metabolické procesy amidů také vysoce exprimovány ve srovnání se sloučeným stadiem medúzy (Additional file 1: Table S48). U medúzy byly obohaceny termíny extracelulární matrix, metalopeptidázová aktivita a procesy imunitního systému (Additional file 1: Table S49), což odpovídá fyziologii jejich zvonu, chapadel a typů tkání ústního ramene.

U medúzy Aurelia aurita bylo dříve prokázáno, že metamorfóza z polypa na medúzu je silně spojena s geny CL390 a retinoid X receptor (RXR) . Je zajímavé, že CL390 nebyl nalezen u Nemopilema ani u jiných publikovaných hlístic, což naznačuje, že se může jednat o gen induktoru strobilace specifický pro Aurelia. Potvrzujeme však, že RXR je přítomen u Nemopilema a chybí u hlístic bez stadia medúzy (Additional file 1: Figure S24). Signalizace kyseliny retinové (RA) hraje ústřední roli během růstu a vývoje obratlovců , kde reguluje transkripci interakcí s receptorem RA (RAR) vázaným na elementy odpovědi na RA (RARE) blízkých cílových genů. Z genů v signální dráze RA mají Nemopilema enzymy ADH a RALDH, které metabolizují retinol na RA, a RXR a RARE, které aktivují transkripci cílového genu (obr. 4a). Objevili jsme 1630 RARE oblastí Nemopilema s průměrnou vzdáleností 13 Kbp od nejbližšího genu (obr. 4b; Additional file 1: Tables S50 and S51). Zajímavé je, že čtyři zadní Hox geny Nemopilema a dva Hox geny Aurelia se nacházely ve vzdálenosti ± 10 Kbp od RARE, což je mezi nebilaterálními metazoany unikátní (obr. 4c; Additional file 1: Table S52). Tato zjištění společně naznačují, že u raných metazoí byla přítomna signalizace kyselinou retinovou pro regulaci cílových genů pomocí RXR a RAREs a že RXR a RAREs mohou hrát kritickou roli pro metamorfózu z polypa na medúzu .

Identifikace domén souvisejících s toxiny u medúz

Medúzy produkují komplexní směsi bílkovinných jedů pro aktivní odchyt kořisti a obranu . Identifikovali jsme hojné toxinové domény u Nemopilema při porovnání se soubory genů nebilaterálních metazoí v databázi Tox-Prot . Celkem 67 ze 136 toxinových domén bylo zarovnáno s nebilaterálními metazoany; z těchto 67 toxinových domén bylo 52 nalezeno u Nemopilema (Additional file 1: Table S53). Podle očekávání obsahuje genom Nemopilema největší počet jedových nebo toxinových domén ze zahrnutých nebilaterálních metazoí. Mezi tyto domény patří domény reprolysinové (M12B) rodiny zinkových metaloproteáz (PF01421), fosfolipázy A2 (PF05826) a prokineticinu (PF06607) (obr. 5). Také Nemopilema a Aurelia mají 8, resp. 11 domén podobných doméně ShK (PF01549), které jsou u těchto druhů nejhojnější ve srovnání s ostatními nebilaterálními druhy. Zejména zinkové metaloproteázy rodiny Reprolysin (M12B) jsou enzymy, které štěpí peptidy a zahrnují většinu endopeptidáz hadích jedů . Dále bylo zjištěno, že inhibitor serinových proteáz a domény ShK byly hojně nalezeny v transkriptomech medúzy dělové (Stomolophus meleagris) i medúzy krabicové (Chironex fleckeri) , a fosfolipáza A2 je dobře charakterizovaný enzym související s toxiny, který je rozhodující pro produkci složek jedu, vyskytující se u třídy Scyphozoa .

.