Úvod

Přítomnost obratlů je charakteristickým rysem tělesného plánu obratlovců. Kostra obratlů se může skládat z řady párových neurálních oblouků, které kryjí míchu, párových hemálních oblouků, které uzavírají ocasní tepnu a žílu, a u mnoha čelistnatých obratlovců (gnathostomů) z řady středů, které nahrazují notochord jako převládající opěrnou strukturu. Obratlová centra jsou velmi variabilní z hlediska morfologie a složení tkání a pravděpodobně se vyvinula nezávisle u mnoha různých linií gnathostomů, včetně tetrapodů, teleostovitých ryb a chrupavčitých ryb . Tato zjevná evoluční konvergence vyvolává otázky ohledně embryonálního původu prvků obratlové kostry u všech gnathostomů.

U tetrapodů jsou všechny součásti obratlové kostry odvozeny od somitů: přechodných, bilaterálních bloků segmentovaného paraxiálního mezodermu, které se tvoří dorzálně v embryonálním trupu. Somity se dělí na dorzální a ventrální subdivize, které dávají vzniknout pojivové tkáni a svalovině trupu („dermomyotom“), resp. kosterní tkáni („sklerotom“). Pokusy se sledováním buněčných linií pomocí chimér kuřat a křepelek a injekcí fluorescein-dextranu nebo štěpů z GFP-transgenních dárcovských embryí axolotla ukázaly plně somitický původ kostry obratlů u těchto taxonů, přičemž buňky somitického původu byly obnoveny ve vyvíjejících se obloucích a vznikajících chrupavkách středu.

Naproti tomu u teleostů s paprskoploutvými rybami se zdá, že kostra obratlů má dvojí embryonální původ s příspěvkem jak paraxiálního mezodermu, tak notochordu. Centra obratlů teleostů se skládají z vnitřní vrstvy (chordacentrum) a vnější vrstvy, obě složené z kosti, která vzniká intramembranózní osifikací . Chordacentrum teleostů vzniká nejprve vylučováním proteinů kostní matrix (např. SPARC, kolagen typu I) z buněk „chordoblastů“, které se nacházejí v epitelu notochordu . U zebřiček testy in vitro ukázaly, že kultivované buňky notochordu mají schopnost vylučovat kostní matrix, a ablační pokusy prokázaly, že při absenci notochordu se chordacentra netvoří . Chordacentra teleostů jsou následně obklopena relativně pozdě se vyvíjející vrstvou membránové kosti odvozené od paraxiálního mezodermu . Navíc mutanti zebřiček s defektem somitového vzoru mají normálně se vyvíjející chordacentra, ale vykazují hluboké defekty neurálního a hemálního oblouku, což ukazuje na pravděpodobný paraxiální mezodermální původ tkání oblouku .

K určení, zda je dvojí původ obratlových center specifickým rysem kostry obratlů u teleostů, nebo obecným rysem u gnathostomů, který se u tetrapodů ztratil, jsou zapotřebí údaje o embryonálním původu obratlů u outgroup ke kostnatým rybám (tj. Osteichthyes: skupina, která zahrnuje tetrapodi a teleosty). Chrupavčité ryby (Chondrichthyes: žraloci, rejnoci, rejnoci a holohlavci) zaujímají klíčové fylogenetické postavení jako sesterská skupina ke kostnatým rybám, a údaje z této linie proto mohou být použity k odvození primitivních vývojových podmínek posledního společného předka gnathostomů. Již dříve jsme ukázali, že každý obratel u rejnoka malého (Leucoraja erinacea) se skládá z hřbetního neurálního oblouku, dvou sad hřbetních chrupavek, které uzavírají míchu (neurální a interkalární oblouk), jednoho hemálního oblouku a ventrálně vybíhajícího trnu a třívrstevného středu (obr. 1) . Zde používáme experimenty mapování osudu somitů a notochordů a také hybridizaci mRNA in situ pro geny kódující proteiny kosterní matrix k testování embryonálního původu kostry obratlů rejnoka. Ukázali jsme, že všechny složky kostry obratlů rejnoka pocházejí z paraxiálního mezodermu, bez důkazů o buněčném nebo matrixovém příspěvku notochordu. Vezmeme-li v úvahu údaje z kostnatých ryb, ukazují naše zjištění na obecný a pravděpodobně primitivní paraxiální mezodermální původ páteře u čelistnatých obratlovců.

Materiál a metody

(a) Mapování osudu somitů

Embrya rodu Leucoraja erinacea byla získána z Marine Biological Laboratory (MBL) ve Woods Hole, MA, a uchovávána v průtočném mořském stole při teplotě přibližně 16 °C do S24. V pouzdře vajíčka byla žiletkou naříznuta chlopeň a embryo a žloutek byly přeneseny do Petriho misky. Embrya byla anestetizována v roztoku MS-222 (100 mg l-1 ethyl 3-aminobenzoát methanesulfonátu-Sigma-Aldrich) v mořské vodě. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 v ethanolu) byl zředěn 1 : 10 v 0,3 M sacharóze a vstříknut do ventrálních částí somitů (jeden až tři vpichy na embryo) pomocí vytažené skleněné kapilární jehly a tlakového injektoru Picospritzer (obr. 2a). Embrya byla poté vložena do obalů na vajíčka a vrácena na mořský stůl, kde se vyvíjela přibližně 7 nebo 12 týdnů. Embrya byla poté fixována 4% PFA, jak je popsáno v Criswell et al. .

(b) Mapování osudu notochordu

Embrya byla uchovávána výše popsaným způsobem až do S14, kdy bylo v obalu vajíčka nad embryem vyříznuto malé okénko. CM-DiI byl mikroinjektován do notochordového trojúhelníku, jak je popsáno výše (obrázek 2b). Okénko bylo poté utěsněno skořápkou dárcovského vajíčka a gelem Krazy Glue™ (obrázek 2c) a vajíčka byla vrácena na mořský stůl, kde se vyvíjela dalších 16-18 týdnů před fixací (jak je popsáno v Criswell et al. ).

(c) Ověření umístění injekcí CM-DiI

Pro ověření správného umístění injekcí CM-DiI byla tři embrya s injekcí somitu fixována ihned po injekci a tři embrya s injekcí notochordu byla fixována 5 dní po injekci (dpi). Embrya byla fixována ve 4% paraformaldehydu v PBS přes noc při 4 °C, 3× 15 minut oplachována v PBS a barvena DAPI v koncentraci 1 µg ml-1 přes noc při pokojové teplotě. Embrya injikovaná somitem byla zobrazena na světelném mikroskopu Zeiss a embrya injikovaná notochordem byla zobrazena na světelném mikroskopu Zeiss nebo konfokálním mikroskopu LSM 780.

(d) Histologie a hybridizace mRNA in situ

Embrya L. erinacea značená CM-DiI byla zalita do parafínu a rozřezána na tloušťku 8 µm podle popisu v O’Neill et al. pro histologickou analýzu. Před vložením byla embrya demineralizována v 10% EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) po dobu 14 dnů. Histochemické barvení bylo provedeno podle protokolu Massonova trichromu podle Wittena a Halla . In situ hybridizační experimenty pro Col1a1 (GenBank přístupové číslo MG017616) a SPARC (GenBank přístupové číslo MG017615) byly provedeny na řezech podle popisu v O’Neill et al. , s úpravami podle Gillis et al. .

Výsledky

(a) Somitický příspěvek ke všem složkám skeletu obratlů rejnoka

Pro testování somitického příspěvku ke skeletu obratlů rejnoka jsme mikroinjektovali CM-DiI do ventrálních částí somitů (tj. předpokládaného sklerotomu – obr. 3a) embryí rejnoka ve stadiu (S) 24 (Ballard et al. ). Fokální značení somitů (bez kontaminace notochordů) bylo potvrzeno světelným mikroskopem u embryí fixovaných bezprostředně po injekci (obrázek 3b; n = 3). Do 50-52 dpi (S31) vřetenovité buňky vyvíjející se areolární tkáně centra obklopovaly notochord a preskeletální mezenchym kondenzoval kolem neurální trubice a kaudální tepny a žíly. U všech embryí analyzovaných v tomto stadiu (n = 5) byl CM-DiI nalezen ve vřetenovitých buňkách vyvíjející se areolární tkáně (obr. 3c), což svědčí o jejich somitickém původu.

V 109 dpi (S34) jsou obratle plně vyvinuté, s neurálním, interkalárním a hemálním obloukem a třívrstevným středem (obr. 1). U embryí analyzovaných v tomto stadiu (n = 4) byly CM-DiI pozitivní buňky nalezeny v celém skeletu obratle. CM-DiI pozitivní buňky byly nalezeny v chrupavce neurálních (n = 3 obratle u tří embryí) a hemálních oblouků (n = 6 obratlů u čtyř embryí; obr. 3d,e), jakož i ve vnitřní vrstvě chrupavky (obr. 3f); n = 2 obratle u dvou embryí), střední areolární tkáně (obr. 3g; n = 3 obratle u tří embryí) a vnější chrupavky středu (obr. 3h; n = 3 obratle u tří embryí). Celkově tato zjištění prokazují somitický příspěvek ke všem hlavním složkám kostry obratlů rejnoka.

(b) Žádné důkazy o notochordálním příspěvku ke kostře obratlů u rejnoka

Pro testování buněčného příspěvku notochordu ke kostře obratlů rejnoka jsme provedli sérii experimentů s mapováním osudu notochordu. U chrupavčitých ryb pochází notochord z malé trojúhelníkové oblasti progenitorových buněk („notochordový trojúhelník“), která se objevuje na zadním okraji blastodiscu v S12 . U embryí rejnoka jsme notochordový trojúhelník fokálně označili pomocí CM-DiI v S14 (obrázek 4a) a lokalizaci barviva v notochordu jsme potvrdili v 5 dpi (přibližně S17) pomocí konfokální mikroskopie. U tří embryí zkoumaných v S17 byl CM-DiI nalezen buď pouze v notochordu (n = 2), nebo v notochordu a nervové tkáni (n = 1) (obrázek 4b). V žádném případě nebyly buňky značené CM-DiI zjištěny v paraxiálním mezodermu.

Proto jsme označili trojúhelníky notochordu několika embryí rejnoka v S14 a tato embrya jsme chovali do 116-129 dpi (S34 – v té době se již plně diferencovala kostra obratle). CM-DiI byl získán v notochordu (obr. 4c,c′) a notochordovém epitelu (obr. 4d,d′) meziobratlových oblastí osového sloupce (n = 5). U tří embryí byly CM-DiI pozitivní buňky nalezeny ve zbytcích epitelu notochordu, které přetrvávají ve středu středu, kde je notochord téměř zcela nahrazen vnitřní vrstvou středové chrupavky, ale ve vnitřní vrstvě samotné chrupavky nebyly nalezeny žádné CM-DiI pozitivní chondrocyty. V ostatních složkách axiálního sloupce nebyly pozorovány žádné chondrocyty značené CM-DiI. Tyto experimenty tedy neposkytují žádný důkaz o buněčném příspěvku notochordu ke kostře obratle.

U teleostů vylučují buňky chordoblastu v epitelu notochordu složky matrix, které tvoří acelulární kost chordacentra. Ačkoli rejnoci nemají chordacentrum, areolární tkáň rejnočího centra mineralizuje a v místě svého vzniku přiléhá k epitelu notochordu . Abychom ověřili, zda buňky notochordového epitelu přispívají matrixovými složkami do tkáně centra u rejnoka, charakterizovali jsme expresi genů kódujících proteiny kostní matrix Col1a1 a SPARC ve vyvíjejícím se centru rejnoka. V notochordovém epitelu jsme nezjistili transkripci Col1a1 (obr. 5a) ani SPARC (obr. 5b). Tyto transkripty byly lokalizovány spíše ve vřetenovitých buňkách areolární tkáně (obr. 5a,b). Tato zjištění naznačují, že zdrojem extracelulární matrix mineralizované tkáně centra obratlů rejnoka jsou buňky samotné areolární tkáně odvozené od paraxiálního mezodermu – a nikoliv epitel notochordu.

Diskuse

Naše experimenty s mapováním osudu somitů ukazují, že presumptivní sklerotom přispívá ke všem složkám obratlů u rejnoka, včetně nervového a hemálního oblouku a všech tkání třívrstevného obratlového centra. I když je možné, že DiI může po injekci difundovat extracelulární matrix a kontaminovat tkáně sousedící se zamýšleným cílem (např. notochord), kontrolovali jsme tuto možnost zobrazením podskupiny embryí krátce po injekci, abychom ověřili přesnost našeho značení, a provedením doplňkových experimentů mapování osudu notochordu. V posledním případě jsme zjistili, že značení progenitorových buněk notochordu pomocí CM-DiI vedlo výhradně ke značení notochordu a notochordového epitelu bez příspěvku k obratlovým tkáním. U teleostovitých ryb chordoblastové buňky v epitelu notochordu exprimují geny kódující proteiny kostní matrix kolagenu typu I a SPARC a jsou pravděpodobně zdrojem kostní matrix pro nejstarší vrstvu obratlového centra. Vzhledem k tomu, že rejnoci mají také mineralizovanou vrstvu uvnitř obratlového centra, snažili jsme se otestovat expresi Col1a1 a SPARC během vývoje obratlů rejnoka pomocí mRNA in situ hybridizace. Zjistili jsme, že tyto geny jsou exprimovány výhradně v somiticky odvozených vřetenovitých buňkách areolární tkáně (předchůdce mineralizované střední vrstvy centra – Chriswell et al. ), nikoli v epitelu notochordu. Tato zjištění naznačují, že buňky a matrixové komponenty obratlového centra rejnoka jsou výhradně paraxiálního mezodermálního původu.

Při posouzení spolu s údaji z kostnatých ryb náš průkaz somitického původu obratlového skeletu rejnoka naznačuje, že tato tkáň byla pravděpodobně jediným, primitivním zdrojem tkání obratlového skeletu u gnathostomů, přičemž podíl notochordu na kostech centra představuje odvozený stav teleostů (obr. 6). Důkazy z raných fosilních čelistnatých a bezčelistnatých ryb silně naznačují, že kostra obratlů u posledního společného předka gnathostomů sestávala pouze z řady nervových oblouků a přetrvávajícího notochordu, bez centra . U několika linií gnathostomů, včetně elasmobranchů chrupavčitých ryb, teleostů a tetrapodů, se následně nezávisle na sobě vyvinula centra . V době svého vzniku byly obratlové centrály elasmobranchů a tetrapodů odvozeny výhradně z paraxiálního mezodermu , ale s nezávislým vznikem centrály teleostů byla do centrály začleněna vnitřní vrstva acelulární kosti pocházející z notochordu.

Ještě však není jasné, zda je tento specializovaný stav teleostů mezi paprskoploutvými rybami ojedinělý. Navzdory nedávným změnám ve fylogenetických vzorcích , se obratlová centra velmi pravděpodobně vyvinula nezávisle u více linií paprskoploutvých ryb, které nejsou teleosty (např. u garsů a bichirů ). Není však jasné, zda notochord přispívá tkání k různým formám center pozorovaných u těchto taxonů. Komplexní analýzy embryonálního původu obratlových tkání u strategicky vybraných rybích taxonů jsou potřebné k lepšímu vyřešení evoluční a vývojové sestavy rozmanité škály axiálních skeletů, pravděpodobně klíčové charakteristiky, obratlovců obecně.

Etika

Všechny experimentální práce byly provedeny v souladu s protokoly schválenými Výborem pro péči o zvířata a jejich použití v MBL.

Dostupnost dat

Sekvenční data spojená s geny v této studii jsou k dispozici v GenBank (Col1a1 přístupové číslo MG017616 a SPARC přístupové číslo MG017615).

Příspěvky autorů

K.E.C. koncipovala studii, provedla histologii, mapování osudu a in situ hybridizační experimenty a vypracovala rukopis; M.I.C. koordinovala studii a přispěla k rukopisu; J.A.G. navrhla části studie, koordinovala studii a pomohla napsat rukopis. Všichni autoři dali konečný souhlas k publikaci.

Konkurenční zájmy

Autoři neprohlašují žádné konkurenční zájmy.

Financování

Tato studie byla podpořena National Science Foundation DDIG (DEB 1501749), University of Chicago/Marine Biological Laboratory Graduate Student Research Award, Company of Biologists Travelling Fellowship a Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762) pro K.E.C.; stipendium Royal Society University Research Fellowship (UF130182), grant Isaac Newton Trust (14.23z) a výzkumná stipendia Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowling a Laura and Arthur Colwin pro J.A.G.; a grant National Science Foundation (DEB 1541491) a výzkumné prostředky University of Chicago pro M.I.C.

Poznámky

.