Bakteriální kmeny a podmínky růstu

Bakteriální kmeny jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Escherichia coli byla kultivována na deskách s Luriovým bujónem (LB) nebo v tekutém LB médiu doplněném 200 µg ml-1 erytromycinu při 37 °C. Transformace E. coli s plazmidovou DNA byla provedena pomocí chemicky kompetentních buněk. S. pneumoniae sérotyp 2 D39 a sérotyp 4 TIGR4 a jejich izogenní mutanty byly kultivovány na deskách Columbia blood agar (Oxoid) obsahujících erytromycin (5 µg ml-1) a/nebo chloramfenikol (5 µg ml-1) nebo kultivovány v Todd-Hewittově bujónu doplněném 0,5% kvasničným extraktem (THY; Roth), resp. chemicky definovaném médiu (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Kultivace pneumokoků na krevním agaru nebo v tekutých kulturách probíhala při 37 °C a 5 % CO2 bez míchání.

Konstrukce mutantů

Pro konstrukci pneumokokových mutantů tacL v D39 a TIGR4 byl použit fragment DNA sestávající ze S. pneumoniae D39 spd_1672 a jeho vzestupné a sestupné doprovodné oblasti byly amplifikovány pomocí PCR z genomové DNA s použitím primerů SPD1672_OLup_for a SPD1672_OLdwn_rev (primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2). Vyčištěné produkty PCR byly klonovány do pUC18 a výsledným plazmidem byly transformovány chemicky kompetentní buňky E. coli DH5α. Rekombinantní plazmid pNH1 obsahující požadovaný insert DNA byl přečištěn a použit jako templát pro inverzní PCR reakci s primery InvrevKpnISPD1672 a InvforPstISPD1672. Odstraněná sekvence genu byla nahrazena genem ermB, amplifikovaným pomocí PCR z vektoru pTP1 s použitím primerů InvrevKpnIErm a InforPstIErm. Konečný rekombinantní plazmid byl použit k transformaci a mutagenizaci pneumokoků. Účinnost transformace byla hodnocena pomocí konečného rekombinantního plazmidu oproti jinému plazmidu s delecí genu (pro deleci genu cbpL) u S. pneumoniae D39Δcps 44. Pozoruhodné je, že účinnost transformace se výrazně zvýšila u delece tacL (2,8 kolonií na ng plazmidu pro cbpL vs. 29,8 kolonií na ng plazmidu pro tacL).

Izogenní mutanty byly doplněny in trans systémem založeným na pBAV1CpE; pBAV1CpE byl modifikován z pBAV1K-T5-gfp45 výměnou genu rezistence vůči kanamycinu za gen rezistence vůči chloramfenikolu a promotoru T5 za promotorovou oblast erytromycinu (pE), která obsahuje ribozomální vazebné místo a start kodon. Kompletní gen spd_1672 byl amplifikován pomocí PCR s použitím primerů 1672_com_for a Spd1672_com_rev a přečištěný fragment byl klonován do pBAV1CpE. Výsledný plazmid pBAV-tacL byl použit k transformaci izogenních mutant tacL. Delece tacL i in trans komplementace byly ověřeny pomocí qRT-PCR (doplňkový obr. 3).

Kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)

Enkapsulovaný a neenkapsulovaný kmen D39 divokého typu, mutant s deficitem tacL a komplementovaný mutant byli kultivováni v THY do střední log fáze (A 600 = 0,35-0,45) a sklizeni pro izolaci RNA pomocí soupravy EURx GeneMatrix Universal RNA purification kit (roboklon). Kvalita RNA byla zkontrolována elektroforézou v agarosovém gelu a standardní PCR s použitím primerů EnoRT_F a EnoRT_R (viz doplňková tabulka 2). Syntéza cDNA byla provedena pomocí SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) a hexameric_random primerů (GE Healthcare) podle pokynů výrobce. Kvalita cDNA byla kontrolována pomocí PCR s použitím primerů EnoRT_F a EnoRT_R a koncentrace byla měřena nanodropem. cDNA byla do dalších testů skladována při -20 °C. Pro qRT-PCR experimenty byly použity StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) a SYBR® Green Master Mix (Biorad) v kombinaci s tacL specifickými primery a také enolase-primery jako kontrola (viz doplňková tabulka 2). Pro analýzu dat byl použit software StepOne (v. 2.3, Life Technologies). Konečné výsledky jsou prezentovány jako velikost fluorescence (ΔRn) vynesená proti počtu cyklů PCR.

Sekvenování a bioinformatická analýza

Sekvenování: 1 ng purifikované chromozomální DNA ze S. pneumoniae kmenů D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), a TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) byly použity k přípravě jednotlivých knihoven podle sady Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Bioanalyzátor Agilent Technology 2100 sloužil k ověření značení a konečného rozložení velikosti fragmentů knihovny na vysoce citlivém DNA čipu. Pro čištění knihoven DNA byly použity kuličky AMPure XP. Konečná sdružená knihovna byla použita na soupravu MiSeq Reagent v3 600cycle kit a sekvenována na systému MiSeq jako 300cyklový běh s párovým zakončením. Konečný pool knihoven byl obohacen o 5% kontrolní knihovnu PhiX. Bylo dosaženo hustoty klastrů 847 ± 25 (K mm-2), přičemž 96,46 ± 1,48 % klastrů prošlo specifikacemi filtru. Z celkového počtu 21,1 milionu čtení prošlo specifikacemi filtru 20,3 milionu čtení (94,7 %), což vedlo k získání 12,52 Gbp sekvenčních dat. Indexová čtení byla rovnoměrně rozložena mezi šest jednotlivých vzorků. Vygenerované soubory FASTQ byly podrobeny další bioinformatické analýze, jak je uvedeno níže.

Detekce a anotace SNP: Pro S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL byla detekce SNP provedena jednotlivě pomocí „snippy“ (https://github.com/tseemann/snippy; parametr: minimální podíl pro důkaz varianty: 60 %; minimální pokrytí místa varianty: ≥5 sekvencí čtení). Jako referenční genom byl použit Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) nebo Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

Výsledné SNP pro každou skupinu mutantů (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) a (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) byly sloučeny a porovnány. Pokrytí genomu bylo odhadnuto pomocí programu qualimap46 s použitím stejných referenčních genomů jako pro detekci SNP.

Izolace pneumokokových teichoových kyselin

Extrakce a izolace LTA: Purifikace LTA byla provedena v podstatě tak, jak je popsáno jinde7, ale pro optimalizaci výtěžku pnLTA byl upraven jeden specifický detail. Pneumokokové buňky byly resuspendovány v citrátovém pufru (50 mM, pH 4,7) a třikrát rozrušeny francouzským lisem (Constant Cell Disruption System, sériové číslo 1020) při 10 °C a tlaku 20 kPSI. Do spojených supernatantů byl přidán SDS na konečnou koncentraci 4 %. Roztok byl inkubován 30 minut při 100 °C a poté byl míchán přes noc při pokojové teplotě. Roztok byl centrifugován při 30 000×g po dobu 15 min při 4 °C. Peleta byla čtyřikrát promyta citrátovým pufrem za výše uvedených podmínek centrifugace. Spojený supernatant obsahující LTA a výsledný sediment obsahující surový komplex PGN-WTA byly lyofilizovány odděleně. Obě výsledné pevné látky byly pětkrát promyty ethanolem (centrifugace: 20 min, 20 °C, 10 650×g) k odstranění SDS a lyofilizovány (výsledkem je peleta A obsahující LTA a peleta B obsahující komplex PGN-WTA). Pro izolaci LTA byla peleta A resuspendována v citrátovém pufru a extrahována stejným objemem butan-1-olu (Merck) při pokojové teplotě za intenzivního míchání. Fáze byly odděleny centrifugací při 2 100×g po dobu 15 minut při 4 °C. Vodná fáze (obsahující LTA) byla odebrána a extrakční postup byl dvakrát opakován s organickou fází a interfází. Spojené vodné fáze byly lyofilizovány a následně dialyzovány po dobu 5 dnů při 4 °C proti 50 mM pufru octanu amonného (pH 4,7; membrána s mezní hodnotou 3,5 kDa); pufr byl měněn každých 24 h. Výsledná surová LTA byla dále přečištěna hydrofobní interakční chromatografií (HIC) provedenou na koloně HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare; 16 × 100 mm, objem lože 20 ml). Surový materiál LTA byl rozpuštěn v co nejmenším množství výchozího pufru (15 % propan-1-ol (Roth) v 0,1 M octanu amonném (pH 4,7)) a centrifugován při 13 000×g po dobu 5 min při pokojové teplotě a vzniklý supernatant byl lyofilizován. Pelet obsahující LTA byl rozpuštěn ve výchozím pufru HIC v koncentraci 30 mg ml-1 a přečištěn pomocí HIC s použitím lineárního gradientu od 15 do 60 % propan-1-olu (Roth) v 0,1 M octanu amonném (pH 4,7). Frakce obsahující LTA byly identifikovány fotometrickým fosfátovým testem47. Frakce obsahující fosfáty byly spojeny, lyofilizovány a po lyofilizaci promyty vodou, aby se odstranil zbytkový pufr.

Extrakce a izolace WTA: Izolace a extrakce WTA byla provedena tak, jak je popsáno jinde11 , ale s drobnými úpravami. Pelet B (obsahující surový komplex PGN-WTA), který vznikl při izolaci LTA, byl resuspendován v koncentraci 10 mg ml-1 ve 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) obsahujícím 20 mM MgSO4. DNáza A a RNáza I byly přidány na konečné koncentrace 10 a 50 µg ml-1 . Suspenze byla míchána 2 h při 37 °C. Následně bylo přidáno 10 mM CaCl2 a trypsin (100 µg ml-1) a míchání pokračovalo přes noc při 37 °C. Byl přidán SDS o konečné koncentraci 1 % a směs byla inkubována 15 min při 80 °C, aby se enzymy inaktivovaly. Buněčná stěna byla získána centrifugací po dobu 45 min při 130 000×g při 25 °C. Vzniklá peleta byla resuspendována v 0,8 ml 8 M LiCl na 1 ml původně použitého roztoku Tris-HCl a inkubována 15 min při 37 °C. Po další centrifugaci za stejných podmínek jako výše byla peleta resuspendována v 1 ml 10 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, pH 7,0) na 1 ml původně použitého roztoku Tris-HCl a tento vzorek byl inkubován při 37 °C po dobu 15 min. Peleta byla dvakrát promyta vodou. Nakonec byla peleta resuspendována ve 2-4 ml vody a lyofilizována, čímž byl získán přečištěný komplex PGN-WTA. V závislosti na konkrétní výzkumné otázce byly následně provedeny další chemické nebo enzymatické úpravy.

Chemické a enzymatické úpravy

Úprava LTA hydrazinem: Purifikovaný LTA byl rozpuštěn v koncentraci 5 µg µl-1 v bezvodém hydrazinu (N2H4; ICN Biomedicals) před inkubací po dobu 1 h při 37 °C za stálého míchání. Reakce byla uhašena přidáním stejného objemu acetonu a vysušena pod proudem dusíku; krok sušení byl opakován dvakrát. Následně byla surová de-O-acylovaná LTA přečištěna gelovou permeační chromatografií (GPC) na Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; velikost kolony: 1,5 × 120 cm; pufr:

Enzymatické štěpení komplexu PGN-WTA: Pro odstranění všech aminokyselin z PGN byl komplex PGN-WTA rozpuštěn v 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) a ošetřen pneumokokovou amidázou LytA, jak je popsáno jinde11. Rekombinantní amidasa LytA značená His (10 µg LytA na mg) byla přidána ve třech alikvotech po 0, 24 a 48 h pro celkovou dobu inkubace 72 h při 37 °C. Následně byl enzym inaktivován varem po dobu 5 min při 100 °C. Po centrifugaci (25 000×g, 15 min, 20 °C) byl supernatant odebrán a lyofilizován. Surový komplex PGN-WTA ošetřený LytA byl dále přečištěn pomocí GPC na Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; velikost kolony: 1,5 × 120 cm; pufr: (150 mM octan amonný (pH 4,7)). Získaný vysokomolekulární materiál (~12 mg) byl dále štěpen lysozymem (200 µg; Sigma) a mutanolysinem (200 µg; Sigma) v 800 µl reakční směsi obsahující fosforečnan sodný (20 mM; pH 4,8) a azid sodný (0,02 %) při 37 °C přes noc. Enzymy byly inaktivovány zahříváním při 100 °C po dobu 5 min. Rozpustný materiál byl získán centrifugací (18 000×g, 10 min, 20 °C) a lyofilizován. Izolace pnWTA navázaného na malé fragmenty PGN byla provedena závěrečnou GPC za výše uvedených podmínek.

NMR spektroskopie

NMR spektroskopická měření byla provedena v D2O při 300 K na přístroji Bruker AvanceIII 700 MHz (vybaveném inverzní 5 mm čtyřnásobnou rezonanční kryosondou Z-grad). Deuterovaná rozpouštědla byla zakoupena od společnosti Deutero GmbH (Kastellaun, Německo). Aceton byl použit jako externí standard pro kalibraci 1H (δH 2,225) a 13C (δC 30,89) NMR spekter. 31P NMR spektra (δP 0,0) byla kalibrována pomocí 85% kyseliny fosforečné v D2O jako externího standardu. Přiřazení 1H NMR bylo potvrzeno dvourozměrnými experimenty 1H, 1H COSY a TOCSY a přiřazení 13C NMR bylo indikováno dvourozměrnou 1H, 13C HSQC na základě přiřazení 1H NMR. Interreziduální konektivita a další důkazy pro přiřazení 13C byly získány z dvourozměrných 1H, 13C HMBC a 1H, 13C HSQC-TOCSY experimentů. Konektivita fosfátových skupin byla přiřazena pomocí dvourozměrné 1H, 31P HMQC a 1H, 31P HMQC-TOCSY. Všechna data byla získána a zpracována pomocí programu Bruker TOPSIN V 3.0 nebo vyšší.

Hmotnostní spektrometrie

Pro analýzu pnWTA navázaného na malé fragmenty PGN byla provedena hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem s fourierovou transformací a iontovou cyklotronovou rezonancí (ESI-FT-ICR-MS) na přístroji APEX Qe 7 Tesla (Bruker Daltonics, Brémy, Německo) s použitím režimu negativních iontů a směsi voda/propan-2-ol/7 M triethylamin/kyselina octová (50:50:0.06:0,02 v/v/v) jako rozpouštědlo, jak bylo popsáno dříve6. MS analýza LTA ošetřeného hydrazinem byla provedena na přístroji Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Brémy, Německo) v režimu záporných iontů za použití stejného rozpouštědla. Byl použit iontový zdroj Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) s napětím spreje nastaveným na -1,1 kV. Hmotnostní stupnice byla externě kalibrována glykolipidy známé struktury a všechna spektra byla nábojově dekonvolutována. Uvedená hmotnostní čísla se vztahují k monoizotopické hmotnosti neutrálních molekul.

Elektronová mikroskopie

Polní emisní skenovací elektronová mikroskopie: Bakterie byly fixovány v růstovém médiu s 5% formaldehydem a 2,5% glutaraldehydem po dobu 1 h na ledu a promyty HEPES pufrem (HEPES 0,1 M, 0,09 M sacharóza, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Alikvotní část 50 µl fixovaného bakteriálního roztoku byla umístěna na krycí sklíčka potažená poly-l-lysinem a ponechána 10 min k ustálení. Po fixaci 2% glutaraldehydem v PBS po dobu 5 min při pokojové teplotě byla krycí sklíčka promyta TE pufrem (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) před dehydratací v odstupňované sérii acetonu (10, 30, 50, 70, 90 a 100 %) na ledu po dobu 10 min pro každý krok. Vzorky ve 100% acetonovém kroku se nechaly dosáhnout pokojové teploty před další výměnou ve 100% acetonu před sušením v kritickém bodě s kapalným CO2 (CPD 30, Balzers, Lichtenštejnsko). Vysušené vzorky byly před zkoumáním v rastrovacím elektronovém mikroskopu Zeiss Merlin (Oberkochen, Německo) s využitím detektoru HESE2 Everhart Thornley SE a detektoru SE v objektivu v poměru 25:75 při urychlovacím napětí 5 kV pokryty palladium-zlatou vrstvou pomocí naprašování (SCD 500, Bal-Tec, Lichtenštejnsko).

Transmisní elektronová mikroskopie: Bakterie byly fixovány výše uvedeným způsobem a dále fixovány tetroxidem osmia (1 % v pufru HEPES) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po promytí HEPES pufrem byly vzorky dehydratovány 10, 30 a 50 % acetonem na ledu před inkubací v 70 % acetonu s 2 % uranylacetátu přes noc při 7 °C. Vzorky byly dále dehydratovány 90 a 100 % acetonem na ledu, ponechány při pokojové teplotě a dále dehydratovány 100 % acetonem, poté byly přemístěny do 100 % ethanolu. Následně byly vzorky infiltrovány aromatickou akrylovou pryskyřicí LRWhite. Po dvoudenní polymeraci při 50 °C byly diamantovým nožem vyříznuty ultratenké řezy, odebrány na mřížky potažené butvarem o velikosti 3000 ok a kontrbarveny 4% vodným uranylacetátem po dobu 3 min. Vzorky byly zobrazeny v Zeiss TEM 910 při urychlovacím napětí 80 kV a při kalibrovaném zvětšení.

Kontrast a jas byly upraveny pomocí Adobe Photoshop CS3.

Generace protilátek

Polyklonální protilátky proti analyzovaným CBP byly vychovány u myší pomocí běžných imunizačních protokolů. Stručně řečeno, myši CD-1 byly imunizovány intraperitoneálně 20 µg rekombinantního proteinu a Freundovým nekompletním adjuvans (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) (50:50 v/v). Ve 14. a 28. dni byly myši posíleny 20 µg proteinu a Freundovým neúplným adjuvans (50:50 v/v). Myši byly vykrveny 42. den a polyklonální IgG byly přečištěny ze séra pomocí proteinu A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo). Protilátky jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2.

Průtoková cytometrie

S. pneumoniae D39 divoký typ, jeho izogenní mutant tacL a doplněný mutant byly kultivovány v médiu THY do střední log fáze, sklizeny při 3 275×g po dobu 6 minut a promyty PBS (pH 7,4). Pro kvantifikaci obsahu kapsul byla 100 µl suspenze obsahující 4 × 108 bakterií inkubována s antikapsulárním polysacharidovým antisérem (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 v PBS) po dobu 30-45 min při 37 °C a 5 % CO2 v 96jamkových destičkách (U-dno, Greiner Bio-One). Po promytí byly vzorky inkubovány se sekundární kozí protilátkou proti králičímu IgG spojenou s protilátkou značenou Alexa488 (Invitrogen) (1:500 v PBS, 30-45 min, 37 °C). Po promytí PBS byly bakterie fixovány 1% formaldehydem přes noc při 4 °C.

Počet CBP a také množství teichoových kyselin v nekapsulovaných kmenech D39 divokého typu, mutantních a komplementovaných kmenech byly měřeny průtokovou cytometrií po fixaci 1% formaldehydem po dobu 1 h při 4 °C. Dvě stě µl suspenze obsahující 8 × 108 bakterií bylo inkubováno se specifickými polyklonálními protilátkami proti různým CBP (1:500 v PBS) nebo pro kvantifikaci TA s protilátkami proti P-Cho (TEPC-15) nebo Forssmanovu antigenu (15 min při 37 °C a 5 % CO2) v 96jamkových destičkách (U-dno, Greiner Bio-One). Po promytí byly vzorky inkubovány se sekundární kozí protilátkou anti-IgG spojenou s Alexa488 (Invitrogen) (15 min při 37 °C). Fluorescence byla stanovena pomocí přístroje FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Immunoblotová analýza

S. pneumoniae D39, její izogenní mutant tacL a komplementovaný mutant byly kultivovány v médiu THY, dokud nebylo dosaženo A 600 0,35-0,45, sklizeny centrifugací při 3270×g při 4 °C po dobu 6 min a resuspendovány v 1 ml PBS pufru o pH 7,4. V případě, že bylo dosaženo A 600 0,35-0,45, byla provedena resuspenze. Celkem 2 × 108 buněk na jamku bylo naloženo a provedeno na 12% SDS-PAGE před přenosem na nitrocelulózovou membránu polosuchým blotováním. Membrány byly blokovány po dobu 2 hodin při pokojové teplotě pomocí 5% odstředěného mléka (Roth) a fyziologického roztoku pufrovaného Trisem (TBS; pH 7,4) a inkubovány přes noc při 4 °C s myšími polyklonálními protilátkami proti různým CBP (1:500 v 5% odstředěném mléce + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Jako kontrola zatížení byla použita králičí polyklonální protilátka proti enoláze (1:25 000 v 5% odstředěném mléce + T-TBS). Membrány byly promyty T-TBS, CBP byly detekovány pomocí sekundární fluorescenčně značené IRDye® 800CW. Kozí α-myší IgG a enoláza byly detekovány pomocí fluorescenčně značeného IRDye® 680RD. Kozí α-králičí IgG protilátka byla detekována inkubací s příslušnou protilátkou (1:15 000 v 5% odstředěném mléce v T-TBS) po dobu 45 min ve tmě při pokojové teplotě; membrány byly promyty T-TBS a nakonec jednou TBS. Skenování membrán bylo provedeno pomocí skeneru Odyssey® CLx (LI-COR).

Tritonem X-100 indukovaný test autolýzy

S. pneumoniae D39 divokého typu, mutantní a komplementovaný kmen byly kultivovány v médiu THY do střední log fáze, sklizeny při 3275×g po dobu 6 min a promyty PBS (pH 7,4). Suspenze o objemu 1 ml obsahující 1 × 109 bakterií byla inkubována s konečnou koncentrací 0,01 % Tritonu X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) a inkubována při 37 °C. Lýza bakterií byla sledována měřením absorbance při 600 nm v předem definovaných časových bodech.

Test adherence na epitel

Adherence pneumokoků na epitelové buňky byla analyzována s lidskými buňkami A549 (ATCC® CCl-185TM), jak je popsáno48. Stručně řečeno, konfluentní epiteliální buňky pěstované na skleněných krycích sklíčkách (Hartenstein; ve 24jamkových destičkách, ~1 × 105 buněk na jamku) byly inokulovány 5 × 106 středně exponenciálně rostlými pneumokoky a inkubovány v infekčním médiu (DMEM (HyClone™) + 1 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra (FBS)) při 37 °C a 5 % CO2. Následně byly buňky třikrát promyty fosfátovým pufrovaným roztokem obsahujícím 1 % FBS (Gibco), aby se odstranily nenavázané bakterie. Poté byly bakterie fixovány pomocí PBS obsahujícího 1% paraformaldehyd (PFA, Roth).

Imnofluorescenční mikroskopie

Fixované pneumokoky navázané na buňky A549 byly třikrát promyty PBS a blokovány po dobu 1 h při pokojové teplotě pomocí PBS + 10% FBS. Po promytí byly vzorky inkubovány 1 h při pokojové teplotě s polyklonální protilátkou (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) proti pneumokokům (vytvořenou u králíka proti tepelně inaktivovanému S. pneumoniae TIGR4 a D39). Jako sekundární protilátka byla použita fluorescenčně značená kozí protilátka proti králíkům Alexa-Fluor488 (Abcam) (1:500, 1 h, pokojová teplota). Bakteriální adherence byla sledována u nejméně 20 buněk na krycím sklíčku třídy pomocí fluorescenční mikroskopie. Každý experiment byl opakován třikrát ve dvou opakováních. Všechna data jsou uvedena jako střední hodnoty ± s.d. Statistická analýza byla provedena pomocí nepárového Studentova t-testu. Ve všech analýzách byla za statisticky významnou považována hodnota p <0,05.

Experimenty s fagocytózou

Test antibiotické ochrany: Konfluentní vrstva monocytárních buněk THP-1 (ATCC® TIB-202TM) pěstovaných na 24jamkových destičkách (3 × 105 buněk na jamku v RPMI-1640 (HyClone™) doplněném 10 % tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra (FBS, Gibco)) byla diferencována na fagocyty přidáním 200 nmol ml-1 forbol 12-myristát 13-acetátu (PMA, Sigma-Aldrich) a inkubována 48 h při 37 °C a 5 % CO2. Poté byly buňky THP-1 promyty RPMI-1640 doplněným o 10 % tepelně aktivovaných FBS a inkubovány dalších 24 h při 37 °C a 5 % CO2. Před infekcí byly pneumokoky kultivovány v THY do střední log fáze (A 600 = 0,35-0,45), odstředěny a promyty infekčním médiem (RPMI-1640 doplněným 1 % tepelně inaktivovaných FBS). Buňky THP-1 byly promyty a infikovány pneumokoky v 500 µl infekčního média. Infekce byla synchronizována centrifugací (2 min, 300×g), aby došlo k současnému kontaktu mezi bakteriemi a fagocyty. Poté byly buňky inkubovány při 37 °C a 5 % CO2 po různě dlouhou dobu. Po infekci byly buňky promyty infekčním médiem a inkubovány s penicilinem G (100 jednotek ml-1, Sigma-Aldrich) a gentamicinem (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) po dobu 1 h při 37 °C a 5 % CO2 k usmrcení extracelulárních bakterií. Poté byly fagocyty promyty a lyzovány 1% saponinem (Sigma-Aldrich), aby se uvolnily intracelulární pneumokoky. Kolonie tvořící jednotky (cfu) intracelulárních bakterií byly stanoveny nanesením bakterií v příslušných ředěních na destičky krevního agaru (Oxoid)49 . Časově závislé usmrcení intracelulárních pneumokoků bylo hodnoceno usmrcením extracelulárních pneumokoků pomocí antibiotik, jak je popsáno výše. Poté byly fagocyty dále inkubovány v infekčním médiu po různou dobu (0-3 h). Intracelulární bakteriální KTJ byly sledovány, jak je popsáno výše. Všechny experimenty byly opakovány čtyřikrát jako duplikáty. Data byla normalizována v testech ochrany proti antibiotikům na multiplicitu infekce (MOI) nebo v testech zabíjení v závislosti na čase na obnovené bakterie v časovém bodě 0 h. Všechny testy byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA s Bonferroniho korekcí.

Dvojité imunofluorescenční barvení a mikroskopie

PMA diferencované buňky THP-1 (3 × 105 buněk na jamku) byly pěstovány na sterilních skleněných krycích sklíčkách (12 mm, Hartenstein) a infikovány pneumokoky, jak je popsáno výše. Po infekci byly buňky THP-1 promyty infekčním médiem a fixovány 4% paraformaldehydem (Roth) přes noc při 4 °C. Skleněné krycí sklíčka byla promyta PBS a blokována PBS + 10% tepelně inaktivovaným FBS po dobu 1 h. Po promytí byly extracelulární bakterie barveny pomocí polyklonálního α-pneumokokového IgG (1:500) a sekundárního kozího α-králičího IgG značeného Alexa-Fluor488 (1:500, Abcam) po dobu 30 min při pokojové teplotě. Skleněné krycí sklíčka byla třikrát promyta PBS po permeabilizaci buněk THP-1 0,1% Tritonem X-100 v PBS (10 min, pokojová teplota). Po promytí byly intracelulární pneumokoky barveny pomocí polyklonálního α-pneumokokového IgG (1:500) a sekundárního kozího α-králičího IgG značeného Alexa-Fluor568 (1:500, Abcam) po dobu 30 min při pokojové teplotě. Experimenty byly opakovány třikrát jako duplikáty. Pro statistickou analýzu byl analyzován počet intracelulárních bakterií u 50 buněk na krycím sklíčku. Data byla normalizována na MOI. Všechny testy byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA s Bonferroniho korekcí. Ve všech analýzách byla hodnota p <0,05 považována za statisticky významnou.

Buněčné linie

Všechny buněčné linie použité v této studii byly zakoupeny od ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) a byly testovány jako mykoplazmaticky negativní pomocí PCR a skenovací elektronové mikroskopie.

Model akutní myší pneumonie a systémové infekce

Osm až deset týdnů staré myší samice CD-1 (outbred, Charles River, Sulzfeld, Německo) byly intranazálně infikovány bioluminiscenčními pneumokoky, jak bylo nedávno popsáno50. Stručně řečeno, pneumokoky byly kultivovány do střední exponenciální fáze (A 600 = 0,35) v médiu THY obsahujícím 10 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra. Po centrifugaci byla infekční dávka (20 µl) upravena na ~2,5 × 107 KTJ v PBS (pH 7,4). Pro nosní infekci byly myši anestetizovány intraperitoneální injekcí ketaminu/xylazinu (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Německo; Rompun, Provet AG, Lyssach, Německo) a bakterie byly podány po kapkách do nosních dírek. KTJ infekční dávky byly potvrzeny naočkováním sériových ředění inokula na destičky krevního agaru. U myší se sledovalo přežívání a v předem zvolených intervalech se zobrazovala bioluminiscence pomocí systému IVIS® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). Pro model systémové infekce byla intraperitoneálně podána infekční dávka 3 × 103 cfu v objemu 200 µl PBS (pH 7,4). Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s německými předpisy Společnosti pro vědu o laboratorních zvířatech (GV-SOLAS) a evropským zdravotním zákonem Federace asociací pro vědu o laboratorních zvířatech (FELASA). Všechny experimenty byly schváleny Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Německo, povolení č. 7221.3-1-056/16-1).

Dostupnost dat

Soubory FASTQ obsahující data genomické sekvence S. pneumoniae byly předány do Evropského nukleotidového archivu EMBL-EBI (ENA) a uloženy v archivu krátkých čtení (SRA) pod přístupovým číslem studie RJEB18558. Všechny další relevantní údaje podporující výsledky studie jsou k dispozici v tomto článku a jeho doplňkových informačních souborech nebo na vyžádání u odpovídajících autorů.

.