Animals

Všechny myši byly v době testování 3-11měsíční samci C57BL/6. Myši byly zakoupeny v laboratořích Jackson, byly umístěny v zařízení s kontrolovanou teplotou (22 °C) a světlem a měly volný přístup k potravě a vodě. Myši byly utraceny předávkováním isofluranem. Všechny postupy na zvířatech a jejich použití byly schváleny Institutional Review Committee na East Carolina University. Péče o zvířata byla v souladu s Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

Pitva FDB

Kriticky důležitá pro každý postup využívající FDB je pečlivá disekce, která zabrání poškození svalu (sval je obklopen oblastí husté pojivové tkáně) (viz obr. 1). Pro usnadnění disekce byly prsty připevněny ke korkové desce, čímž bylo chodidlo zajištěno na místě s chodidlem směřujícím vzhůru. Poté byla kůže na proximálním konci chodidla (nad patní kostí) přitisknuta, aby bylo možné mikronůžkami provést řezy podél bočních okrajů chodidla až k prstům. Stále se štípala kůže nad patní kostí a mikronůžkami se oddělila kůže od spodního svalstva. Zbývající kožní lalok byl odloupnut a odstraněn, aby se odkryla FDB a šlachy prstů. Poté byla proximální šlacha přestřižena a při přidržování šlachy kleštěmi byla FDB odříznuta od pod ní ležící fascie. Šlachy prstů byly poté přeříznuty, aby se FDB uvolnila od chodidla.

Izolace svalových vláken

Po disekci FDB byly svaly umístěny do čerstvých kultivačních médií (DMEM s glutaminem, 2 % sterilně filtrované FBS, 0.1 % gentamycin) doplněných 4 mg/ml kolagenázy A (Roche – 11088793001) po dobu 90-120 min při 37 °C v 5 % CO2, jak bylo popsáno dříve . Sval FDB byl umístěn do 2 ml kultivačního média bez kolagenázy a jemně triturován proti stěně misky, aby se uvolnila vlákna ze svazku pomocí odříznutého konce špičky pipety P1000. Izolovaná myofibra byla nalepena na misky se skleněným dnem, které byly potaženy entaktin-kolagen-lamininem (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Vlákna byla vrácena na několik hodin do teploty 37 °C v 5% CO2 a následně zobrazena, jak je popsáno níže.

Délka svalových vláken FDB

Svaly FDB samců a samic myší C57BL/6 byly svázány na proximální šlaše a třech mediálních šlachách prstů hedvábným stehem a připevněny ke kovové sponě pro udržení klidového napětí. Myofibry byly izolovány, jak je popsáno výše, ale nebyly přilepeny na desky se skleněným dnem. Myofibry byly zobrazeny pomocí objektivu ×4 a jádrového mikroskopu EVOS XL a doprovodného softwaru (Life Technologies, Bothell, WA). V programu ImageJ (verze 1.6.0, NIH, Bethesda, MD) byla změřena délka přibližně 1000 myofibril. Při izolaci již nebyla myofibra v napětí, a proto nepředstavovala optimální délku. Pro zohlednění této změny délky myofibry byl použit přepočítávací faktor pomocí délky sarkomer, jak již dříve popsal Dr. Richard Lieber . Při optimální délce je předpokládaná optimální délka sarkomery myšího svalového vlákna 2,5 μm v průměru . Pro normalizaci délky myofibry na délku sarkomery jsme změřili délku sarkomery u podskupiny 30 myofiber. Byla změřena vzdálenost mezi 10 sarkomérami každého myofibru a vypočtena průměrná délka sarkomér ve všech 30 myofibrech. Vydělením optimální délky sarkomery (2,5 μm) průměrnou naměřenou délkou sarkomery vznikl přepočítací koeficient 1,14, který byl použit k normalizaci všech naměřených délek myofibrií na optimální délku sarkomery.

Individuální typ vlákna a velikost vlákna

Analýza typu svalových vláken FDB byla provedena na vzorcích od myší C57BL/6, jak bylo popsáno dříve . Řezy byly vyšetřeny primárními protilátkami proti těžkému myozinovému řetězci typu I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa) a proti dystrofinu (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), poté byly zobrazeny pomocí automatického mikroskopu EVOS FL a doprovodného softwaru (Life Technologies, Bothell, WA). Typ vláken a plocha průřezu vláken (CSA) byly hodnoceny pomocí programu ImageJ, jak bylo popsáno dříve .

Izometrická produkce síly

Izometrická produkce síly a únava byla hodnocena u svalů EDL (n = 5), soleus (n = 4) a FDB (n = 6) myší C57BL/6, jak bylo popsáno dříve s mírnými úpravami. FDB byl obnažen a proximální šlacha byla zajištěna hedvábným stehem. Pod tři mediální šlachy prstů na nohou byly umístěny kleště s jemným hrotem, které byly jemně staženy směrem dolů k prstům a poté byly všechny tři šlachy (obr. 1) zajištěny hedvábným stehem. Podvázali jsme tři mediální šlachy, protože kvůli anatomickému umístění není možné podvázat jednu z prstů a podvázání čtvrté šlachy podle našich zkušeností nevede k rozdílné absolutní síle (údaje nejsou uvedeny). Každá šlacha byla poté přeříznuta těsně nad uzlem a FDB byla opatrně zvednuta od chodidla. Mikronůžkami byla odstraněna zbývající pojivová tkáň a uvolněna z chodidla. Sval byl poté přivázán ke snímači síly a zavěšen v okysličeném Krebs Ringerově pufru (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) při pokojové teplotě. Délka svalu byla poté upravována tak dlouho, dokud FDB nevytvořila maximální sílu záškubu, v tomto okamžiku bylo nastaveno optimální klidové napětí (Lo) a sval byl ponechán 10 min v rovnováze. Svaly podkolenní byly připraveny uvázáním dvojitého čtvercového uzlu na distální šlaše podkolenního svalu. Šlacha byla nad uzlem přeříznuta a zadní svaly byly jemně odtaženy od nohy, čímž byla odhalena proximální šlacha soleu, která byla svázána dvojitým čtvercovým uzlem. EDL byla rozříznuta a svázána podle předchozího popisu. Svaly EDL a soleus byly vyrovnány v okysličeném KRB pokojové teploty v klidovém napětí po dobu 10 min. Po ekvilibraci bylo svalové napětí optimalizováno provedením maximální stimulace záškubů a úpravou délky svalu, dokud nebylo dosaženo maximální síly. Stimulace záškubů byly prováděny s odstupem 30 s, aby se zabránilo únavě svalu. Svaly byly poté stimulovány s odstupem 60 s při frekvencích 10, 20, 40, 60, 80, 100 a 120 Hz, aby se vytvořila křivka frekvence síly. Svaly odpočívaly další 1 min před dokončením 10minutového stimulačního protokolu pro stanovení únavové odolnosti. Při únavovém protokolu byly svaly stimulovány při frekvenci 30 Hz každé 2 s po dobu 600 s, celkem 300 kontrakcí. Byla zaznamenána optimální délka svalu a svaly byly před vážením potřeny, aby se odstranil přebytečný KRB. Před zahájením experimentů bylo stanoveno optimální napětí 20 V, aby byla zajištěna maximální stimulace FDB, EDL a soleu (údaje nejsou uvedeny). Údaje o absolutní svalové síle byly převedeny na specifickou sílu (N/cm2) pomocí dříve popsaných rovnic pro matematický odhad CSA a fyziologického průřezu svalu (PCSA) . Hlavním rozdílem mezi CSA a PCSA je zahrnutí poměru délky svalových vláken k délce svalu do rovnice PCSA. Použili jsme obě korigované metody, abychom zajistili širší kompatibilitu s literaturou.

Pasivní kontraktilní vlastnosti

Pasivní kontraktilní vlastnosti byly hodnoceny u EDL a FDB svalů myších samců C57BL/6 (n = 4), jak bylo popsáno dříve , s drobnými úpravami. Svaly EDL a FDB byly vypreparovány a přivázány ke snímači síly, jak je popsáno výše. Svaly byly vyrovnány po dobu 10 min v okysličeném KRB při pokojové teplotě. Po ekvilibraci bylo svalové napětí optimalizováno provedením maximální stimulace záškubů a úpravou délky svalu, dokud nebylo dosaženo maximální síly. Stimulace záškubů byly prováděny s odstupem 30 s, aby se zabránilo únavě svalu. Referenční délka svalu byla měřena jako Lo před provedením pasivního protažení 105, 110, 115, 120, 125 a 130 % Lo. Svaly byly vymazány, aby se odstranil přebytečný KRB, a poté zváženy. Data byla korigována na CSA a PCSA.

Poškození kardiotoxinem (CTX)

U myší C57BL/6 bylo provedeno srovnání FDB ošetřené CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) a kontralaterální FDB ošetřené PBS 4 dny (n = 4) a 10 dní po ošetření (n = 2). Sterilní 8 mm dlouhé stříkačky 31G byly připraveny s 10 μl 10 μM CTX nebo 10 μl sterilního 1× PBS, jak bylo popsáno dříve . Po anestezii vyvolané isofluranem byla základna nohou čtyř myší očištěna alkoholovými ubrousky. CTX byl injikován do proximální části chodidla s jehlou umístěnou pod kůží směrem k prstům. Do kontralaterálního chodidla byl vstříknut PBS. Myši byly ve vhodnou dobu usmrceny a FDB byly vypreparovány pro měření produkce síly, jak je popsáno výše. Data byla korigována na PCSA.

Barvení hematoxylinem a eosinem

FDB svaly podrobené 10denní léčbě CTX byly bleskově zmrazeny v roztoku pro optimální řeznou teplotu (OCT) pro řezání a barvení H&E, jak bylo popsáno dříve .

Mitochondriální respirometrie kosterního svalu s vysokým rozlišením

Příprava permeabilizovaných svazků svalových vláken gastrocnemius a FDB

Respirometrie byla provedena na izolovaných permeabilizovaných svazcích svalů gastrocnemius a FDB vyříznutých ze stejné končetiny myší C57BL/6 (n = 4). Část červeného gastrocnemia byla vypreparována a použita pro přípravu permeabilizovaných svazků vláken, jak bylo popsáno dříve . Červený sval gastrocnemius byl použit jako srovnávací tkáň, protože se běžně používá k hodnocení mitochondriální respirace myšího kosterního svalu . Protokol pro přípravu permeabilizovaných svazků svalových vláken FDB byl upraven z dříve popsaných metod permeabilizace svazků červeného svalu žaludku a je popsán níže. FDB byly vypreparovány a okamžitě přidány do ledově studeného pufru X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurin, 5,7 ATP, 14,3 fosfokreatin, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). Pomocí pitevního mikroskopu byla opatrně odstraněna pojivová tkáň, tuk a cévy, aby nedošlo ke ztrátě svaloviny. FDB byly rozřezány na svazky a rozděleny do skupin po třech až čtyřech svazcích o hmotnosti 1,5-2,0 mg mokré váhy. Skupiny svazků byly poté permeabilizovány v pufru X obsahujícím 22,5 μg/ml saponinu za nepřetržité rotace při 4 °C po dobu 5 minut. Svalové svazky byly ihned přeneseny do ledově chladného pufru Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) a promyty za nepřetržité rotace při 4 °C po dobu 15 min.

Mitochondriální respirace

Měření spotřeby O2 s vysokým rozlišením bylo provedeno pomocí přístroje OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Rakousko) při 37 °C s počáteční koncentrací kyslíku ~ 300-350 μM, jak bylo popsáno dříve . Experimenty byly prováděny v pufru Z obsahujícím 20 mM kreatin monohydrát a 25 μM blebbistatinu. Mitochondriální respirace byla hodnocena postupným přidáváním substrátů o konečné koncentraci pyruvát 4 mM, malát 0,5 mM, glutamát 5 mM, ADP 2.5 mM, sukcinátu 5 mM, cytochromu c 5 μM, rotenonu 10 μM, antimycinu A 5 μM, kyseliny askorbové 2 mM a TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenylendiamin dihydrochlorid). Integrita mitochondriální membrány byla potvrzena vyloučením svalových svazků gastrocnemius a svalových svazků FDB, které po přidání exogenního cytochromu c vykazovaly > 10, respektive > 20% zvýšení respirace. Pro svalové svazky gastrocnemius a FDB byla použita odlišná vylučovací kritéria, protože předběžné testování ukázalo, že po přidání cytochromu c je u svazků vláken FDB běžné větší procentuální zvýšení respirace než u svazků vláken gastrocnemius. Po dokončení protokolu byly svalové svazky opláchnuty v destilované H2O, vysušeny mrazem (Labconco, Kansas City, MO) a zváženy (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Respirační rychlost pro intaktní svalové svazky gastrocnemius se běžně koriguje na hmotnost sušiny; vzhledem k rozdílům v obsahu pojivové tkáně obou svalových skupin však byly hodnoty JO2 korigovány také na celkový protein a aktivitu citrát syntázy (CS). Aktivita CS byla měřena pomocí soupravy CS0720. Chemikálie a činidla byly zakoupeny od společnosti Sigma Aldrich.

Mikroskopie

In vitro

Svalová vláknaFDB byla izolována z myší C57BL/6 a připevněna na 35mm misky se skleněným dnem potažené ECL, jak bylo uvedeno dříve. Izolovaná myofibra byla barvena mitotrackerem deep red (M2246, Thermo Fisher) a NucBlue (R37605, Thermo Fisher) v DMEM po dobu 30 min. Vlákna byla třikrát promyta 2 ml KRB. Vlákna byla zobrazena pomocí jednofotonového konfokálního laserového skenovacího mikroskopu s objektivem ×60 s olejovou imerzí (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) a excitace bylo dosaženo pomocí 405 a 488 nm linií víceřádkového argonového laseru.

In vivo

Druhá harmonická generace popisuje optický efekt vznikající při průchodu laserových pulzů vysoce polarizovanými, necentricky symetrickými materiály, jako je myosin. Pokud jsou tyto materiály polarizovány na vhodnou vlnovou délku, vyzařují světlo o poloviční vlnové délce, než na kterou vstupují, a vytvářejí tak obrazy s vysokým rozlišením bez nutnosti použití fluorescenčních sond, které podléhají fotobleachingu a fototoxicitě. Použité vlnové délky blízké infračervenému záření navíc umožňují hluboký průnik do tkáně bez nutnosti invazivních postupů . Myši C57BL/6 byly před odstraněním kůže pokrývající FDB anestetizovány, čímž se odhalil sval FDB. Po odhalení byla FDB hydratována sterilním KRB a myš byla položena na podložní sklíčko (č. 1.5, Leica), jak bylo popsáno dříve (obr. 1C). Molekuly obsahující myosin a nikotinamid byly excitovány při 900 a 720 nm pomocí pulzního laseru s uzamčeným módem Ti:Sapphire (Mai Tai Deep See HP series, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA) a emise byla zaznamenána pomocí nedescenované detekce s filtrem FV10 MRV/G nastaveným na 450 a 420 nm. Všechny snímky byly pořízeny pomocí objektivu s olejovou imerzí ×60 (Plan Apochromat, NA 1,35) a přístroje Olympus FV1000 LSM s akvizičním softwarem FV10-ASW 4.2.

Elektroporace cDNA a respirometrie s vysokým rozlišením kosterního svalu s nadměrnou expresí Pgc1α

Elektroporace cDNA do FDB byla provedena podle předchozího popisu . Stručně řečeno, nohy sedmi anestetizovaných myších samců a samic C57BL/6 byly očištěny alkoholovou utěrkou a do polštářků nohou bylo pomocí 8 mm dlouhé sterilní jehly o průměru 31 vstříknuto 10 μl 2 mg/ml hyaluronidázy suspendované ve sterilně filtrovaném KRB. Přibližně o 1 h později podstoupily myši druhou anestezii. Nohy byly opět očištěny alkoholovou utěrkou a na jednu nohu bylo aplikováno 30 μg plazmidu PGC1α značeného zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) a na kontralaterální nohu byla aplikována cDNA YFP. Po úplném zotavení z anestezie byly myši potřetí anestezovány o ~ 10 min později. Platinové elektrody byly zavedeny pod kůži a umístěny kolmo k FDB a paralelně k sobě na patě a na chodidle pod prsty. FDB byla stimulována 20 pulzy o délce 20 ms při frekvenci 1 Hz a napětí 100 V . Myši byly po 14 dnech usmrceny a FDB byly vypreparovány a zobrazeny pod fluorescenčním mikroskopem, aby se potvrdila exprese plazmidu. Poté byly připraveny vzorky intaktních svalů FDB a měřena mitochondriální respirace, jak je nastíněno výše.

Statistika

Bylo vyhodnoceno rozdělení dat a data, která neodpovídala normálnímu rozdělení, byla transformována na logaritmickou základnu 10. V případě, že se jednalo o normální rozdělení, byla data transformována na normální rozdělení. Údaje o frekvenci síly kontrakce byly analyzovány pomocí dvoucestné ANOVA s Tukeyho vícenásobným porovnáním. Údaje o svalové hmotnosti, typu vláken, době do maxima a poloviční relaxace a únavě byly analyzovány pomocí jednosměrné ANOVA s Tukeyho vícenásobným porovnáním. V případech, kdy nebylo možné data transformovat na normální rozdělení, byl proveden Kruskalův-Wallisův test s Dunnovým mnohonásobným porovnáváním. ANOVA byly provedeny pomocí programu GraphPad Prism 7.03. Údaje o dýchání a aktivitě CS byly analyzovány pomocí párových dvoustranných t-testů s hladinou alfa 0,05 pomocí programu Microsoft Excel. Všechny údaje jsou prezentovány jako průměr ± SEM.