Buněčné kultury a RNAi

Buněčná linie Drosophila melanogaster S2 (ze sbírky IMG RAS) a buněčná linie Kc167 (z Drosophila Genomics Resource Center) byly kultivovány při teplotě 25 °C v médiu Schneider’s Drosophila Medium (Gibco) doplněném 10 % tepelně-inaktivovaným fetálním hovězím sérem (FBS, Gibco), 50 jednotek/ml penicilinu a 50 µg/ml streptomycinu. OSC47 , které laskavě poskytl M. Siomi, byly kultivovány v médiu pro hmyz Shields a Sang M3 (Sigma-Aldrich) doplněném 10 % tepelně inaktivovaného FBS (Gibco), 10 % mušího extraktu (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml inzulínu (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutathionu (Sigma-Aldrich), 50 jednotek/ml penicilinu a 50 µg/ml streptomycinu. dsRNA proti lacZ nebo lamin Dm0 pro RNAi ošetření buněk S2 byly připraveny podle předchozího popisu11. dsRNA proti LBR byly připraveny stejným způsobem s použitím DNA genomu drozofily jako templátu pro PCR amplifikaci a primerů uvedených v doplňkové tabulce 1. Ošetření buněk dsRNA bylo prováděno po dobu čtyř dnů podle dříve popsaného protokolu48.

Western-blot analýza

Proteiny byly extrahovány 8 M močovinou, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1 % SDS, frakcionovány pomocí SDS-PAGE (12% akrylamidový gel) a přeneseny na PVDF membránu (Immobilon-P, Millipore). Bloty byly vyvolány pomocí sekundárních protilátek konjugovaných s alkalickou fosfatázou (Sigma) a detekčního systému Immun-Star AP (Bio-Rad). K detekci byly použity následující protilátky: myší monoklonální antilamin Dm0 (1:2000; ADL6749), králičí polyklonální antilamin C25 (1:10000), myší monoklonální anti-beta aktin (1:3000; ab8224, Abcam).

Vizualizace chromatinu pomocí barvení histonu H4 nebo DAPI

Lam-KD, LBR-KD nebo kontrolní buňky S2 byly nasazeny na krycí sklíčka na 30 min. Po opláchnutí PBS byly buňky fixovány ve 100% metanolu po dobu 5 min při pokojové teplotě (pro další zkoumání rozložení chromatinu na základě imunobarvení histonu H4) nebo ve 4% formaldehydu v PBS po dobu 25 min při pokojové teplotě (pro další odhad objemu chromatinu na základě barvení DAPI), třikrát opláchnuty PBS, blokovány PBTX (PBS s 0,1% Tween-20 a 0,3% Triton X-100) obsahujícím 3% normální kozí sérum (Invitrogen) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Zbývající postup imunobarvení byl proveden podle předchozího popisu50. Jako primární protilátky byly použity myší monoklonální anti-histon H4 (1:200; ab31830, Abcam), morčecí polyklonální anti-LBR26 (1:1000), králičí polyklonální anti-lamin Dm051 (1:500). Jako sekundární protilátky jsme použili Alexa Fluor 546-konjugovaný kozí anti-králík IgG (Invitrogen) nebo Alexa Fluor 488-konjugovaný kozí anti-myší IgG (Invitrogen) nebo Alexa Fluor 633-konjugovaný kozí anti-morčecí IgG (Invitrogen).

Kvantifikace distribuce chromatinu pomocí ImageJ

Pomocí ImageJ jsme měřili profily histonu H4, LBR a lamin Dm0 v celém průměru jádra v ekvatoriální ohniskové rovině jader buněk Lam-KD, LBR-KD nebo kontrolních buněk S2. Byly extrahovány intenzity fluorescence, jednotlivé profily byly nejprve normalizovány na průměrnou intenzitu, poté na průměr jádra (ohraničený vrcholy fluorescence LBR pro Lam-KD nebo vrcholy fluorescence lamin Dm0 pro LBR-KD) a dále zarovnány pro stanovení průměrného profilu. Byla analyzována jádra ze 2-3 nezávislých experimentů (60 jader na experiment).

Odhad objemu chromatinu barveného DAPI

Konfokální snímky obsahující 20-30 formaldehydem fixovaných buněk Lam-KD nebo kontrolních buněk S2 barvených DAPI byly zpracovány a analyzovány se stejnými parametry pomocí softwaru IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). U buněk Lam-KD byla k analýze použita pouze jádra s nejnižším zbytkovým barvením lamin Dm0, zatímco u kontrolních buněk naopak jádra se slabým barvením lamin Dm0 nebyla k analýze brána. Pro odečítání pozadí byly snímky prahovány na ~15 % maximální intenzity kanálu, aby se vytvořené jaderné plochy nerozšířily za vrchol intenzity fluorescence LBR. S těmito parametry byly automaticky rekonstruovány povrchy jader vhodné pro analýzu. Nakonec byly z karty Statistics (Statistiky) načteny objemy ~100 rekonstruovaných jader pro analýzu.

Dvoubarevná FISH

~20-kb sondy FISH byly vytvořeny pomocí soupravy PCR dlouhého dosahu (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) PCR-amplifikací 4 dlaždicových fragmentů genomu pokrývajících buď oblast 2 L:16964000-16982000, nebo 2 L:17310000-17328000, s použitím párů primerů uvedených v doplňkové tabulce 1. 1 µg templátové DNA pro hybridizaci byl označen náhodnou syntézou primerů pomocí soupravy pro značení DNA DIG (Roche) nebo pomocí ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Sondy byly dále kombinovány a hybridizovány s buňkami S2, jak bylo popsáno dříve23. Pro detekci NL nebo FISH sond jsme jako primární protilátky použili morčecí polyklonální anti-LBR26 (1:1000) nebo králičí polyklonální anti-lamin Dm051 (1:500) a ovčí polyklonální anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Jako sekundární protilátky jsme použili Alexa Fluor 633-konjugovaný kozí anti- morčecí IgG (Invitrogen) nebo Alexa Fluor 546-konjugovaný kozí anti- králičí IgG (Invitrogen) a Alexa Fluor 488-konjugovaný kozí anti-FITC IgG (Invitrogen).

Měření vzdáleností mezi sondami FISH a NE

Třírozměrné obrazové stacky byly zaznamenány pomocí konfokálního laserového skenovacího mikroskopu LSM 510 Meta (Zeiss). Byly zachyceny optické řezy s intervaly 0,4 μm podél osy Z. Snímky byly zpracovány a analyzovány pomocí softwaru IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) se slepým experimentálním uspořádáním. Vzdálenosti mezi oběma sondami nebo mezi sondami a NE byly počítány podle předchozího popisu23. Stručně řečeno, nebyli jsme schopni plně automaticky rekonstruovat povrchy jader na základě jejich imunobarvení LBR nebo lamin Dm0. Proto byl jaderný okraj určitého jádra ve všech optických řezech zásobníku ručně obkreslen středem jeho barvení LBR nebo lamin Dm0, aby bylo možné dále automaticky rekonstruovat povrch tohoto jádra. Pro určení vzdálenosti mezi signály FISH a NE byl „měřicí bod“ přístroje umístěn na nejjasnější voxel sondy FISH a další „měřicí bod“ byl umístěn na rekonstruovaný jaderný povrch v místě jeho nejčasnějšího průsečíku s postupně rostoucí koulí od prvního „měřicího bodu“. Pro každé jádro byla změřena vzdálenost mezi dvěma „měřicími body“ (tj. nejkratší vzdálenost mezi středem sondy FISH a středem NE). Odpovídajícím způsobem byly změřeny vzdálenosti mezi dvěma sondami FISH. Údaje byly získány ve dvou nezávislých experimentech pro 75-100 jader na experiment. Souběžně byly získány objemy jader a vypočteny poloměry jader, přičemž jádra byla považována za sférická. Nakonec byly vzdálenosti normalizovány na poloměry jader.

Analýza genové exprese

Celková RNA byla izolována z buněk Lam-KD nebo kontrolních buněk S2 pomocí činidla Trizol (Invitrogen) a kontaminující DNA byla odstraněna ošetřením DNázou I. Kvalita RNA byla hodnocena pomocí kapilární elektroforézy na přístroji Bioanalyzer 2100 (Agilent). Poly(A)+ RNA byla extrahována z celkové RNA pomocí magnetických kuliček oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). Pro přípravu knihoven byla použita sada NEBNext Ultra II RNA library preparation kit (New England Biolabs) podle pokynů výrobce. Knihovny ze dvou biologických replikátů buněk Lam-KD nebo kontrolních buněk S2 byly kvantifikovány pomocí fluorometru Qubit a kvantitativní PCR a sekvenovány na přístroji Illumina NextSeq, což vedlo k získání 8,4-9,4 × 106 80-nt jednostranných čtení. Čtení byla mapována na referenční genom D. melanogaster (verze dm3) pomocí HISAT52 v2.1.0 s volbou -max-intronlen 50 000. Čtení s nízkou kvalitou mapování byla odstraněna pomocí SAMtools53 s volbou -q 30. Pomocí nástroje BEDtools54 v2.16.2 s volbou -split jsme vypočítali log2 transkripčních úrovní ve 20-kb genomických binech a poté jsme použili funkci hclust v R ke shlukování replikátů pomocí 1-Spearmanova korelačního koeficientu jako metriky vzdálenosti. Genová exprese byla kvantifikována pomocí StringTie52 pro referenční anotaci verze r5.12. Odfiltrovali jsme geny s nulovou expresí ve více než dvou replikátech. Ze zbývajících 10 076 genů byly diferenciálně exprimované geny definovány pomocí balíčku edgeR55 s normalizací trimmed mean of M values (TMM) při hraniční hodnotě FDR = 0,05. Geny byly přiřazeny k LAD, pokud se jejich TSS nacházely uvnitř LAD, zatímco geny byly přiřazeny k inter-LAD, pokud byly jejich TSS vzdáleny od LAD alespoň 1 kb. Ke všem hodnotám exprese byl přidán pseudočet, aby se odstranily nuly. Pseudočet byl vypočten jako minimální hodnota v tabulce exprese genů po normalizaci. Poté jsme zprůměrovali replikáty a vypočítali hodnoty log2(FC) mezi vzorky Lam-KD a kontrolními vzorky.

Test RT-qPCR v reálném čase pro náhodně vybrané geny z různých LAD byl proveden na cDNA syntetizovaných pomocí oligo(dT) primerů na poly(A)+ RNA izolované ze 3 biologických replikátů buněk Lam-KD nebo kontrolních buněk S2 pomocí chemie EvaGreen (Jena Bioscience) a hardwaru CFX96 (BioRad). Hladiny exprese genů byly normalizovány na expresi genu act5C. Pro semikvantitativní RT-PCR, použitou pro analýzu genů z 60D LAD, byla provedena reverzní transkripce RNA pomocí reverzní transkriptázy SuperScript II (Invitrogen) v přítomnosti hexamerových náhodných primerů. PCR amplifikace cDNA byla provedena s přídavkem 33P-dATP. Sondy po PCR byly separovány v 5% PAAG, který byl poté fixován, vysušen a vystaven skladovacímu fosforovému sítku (Amersham Biosciences). Signály byly snímány pomocí přístroje Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Pro každý pár primerů byl počet cyklů PCR optimalizován tak, aby odpovídal exponenciální fázi amplifikace, která byla kontrolována dvojnásobným ředěním cDNA. Úrovně exprese genů byly normalizovány na expresi všudypřítomného genu CG4589. Sekvence primerů specifických pro jednotlivé geny jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.

Postup a analýza dat ChIP-seq

ChIP-seq ze dvou biologických replikátů kontrolních buněk a buněk Lam-KD S2 s acetylovanými protilátkami anti-H3-pan (Active Motif, #39139) byl proveden podle předchozího popisu56 s některými modifikacemi. Po opláchnutí PBS bylo ~2 × 107 buněk fixováno 1,8% formaldehydem v PBS obsahujícím 0,5 mM DTT po dobu 20 min při pokojové teplotě. Zesíťování bylo zastaveno přidáním 225 mM glycinu po dobu 5 min a promytím v PBS obsahujícím 0,5 mM DTT třikrát po dobu 5 min. Buňky byly jednou promyty v pufru A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoxycholát sodný, 0,5 mM DTT, kompletní koktejl inhibitorů proteáz bez EDTA (Roche)). Buňky byly lyzovány v pufru A2 obsahujícím 1 % SDS po dobu 10 min při pokojové teplotě, poté byl lyzát 20krát zředěn pufrem A2 a inkubován po dobu 2 min při 4 °C. Po sonikaci pomocí VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulzů po 10 s s 10sekundovými intervaly při 15% maximálním výkonu) a 10minutové vysokorychlostní centrifugaci byl v supernatantu získán fragmentovaný chromatin (s průměrnou velikostí fragmentu DNA ~0,5 kb). Pro každou imunoprecipitaci bylo ~10 μg chromatinu (~700 μl) předinkubováno v přítomnosti 100 μl proteinu A-Sepharose (PAS, 50 % w/v, GE Healthcare) po dobu 1 h při 4 °C. PAS byl odstraněn centrifugací, 5 % chromatinu bylo izolováno jako „vstupní“ materiál, poté byly ke zbytku chromatinu přidány 2 µl anti-H3-pan acetylovaných protilátek (Active Motif, #39139) a vzorky byly inkubovány přes noc při 4 °C v rotujícím kolečku. Poté bylo přidáno 100 μl PAS a inkubace pokračovala 4 h při 4 °C. Vzorky byly centrifugovány při maximální rychlosti po dobu 1 min a supernatant byl zlikvidován. Vzorky byly čtyřikrát promyty v pufru A2 obsahujícím 0,05 % SDS a dvakrát v pufru 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT (každé promývání po dobu 5 min při 4 °C). Chromatin byl z PAS eluován ve 100 μl 10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM Tris (pH 8) při 65 °C po dobu 10 min, následovala centrifugace a regenerace supernatantu. Materiál PAS byl znovu extrahován ve 150 μl TE, 0,67 % SDS. Pro reverzi příčných vazeb byl kombinovaný eluát (250 μl) inkubován 6 h při 65 °C a ošetřen Proteinázou K po dobu 3 h při 50 °C. Vzorky byly extrahovány fenol-chloroformem a vysráženy isopropanolem za přítomnosti 20 μg glykogenu. DNA byla rozpuštěna ve 100 μl vody. Vzorky ChIP obsahující ~25 ng vysrážené DNA a také „vstupní“ vzorky byly připraveny pro sekvenování nové generace pomocí soupravy NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina (New England Biolabs). Knihovny byly sekvenovány na přístroji Illumina HiSeq 2000, což vedlo k získání 3,1-3,4 × 106 75-bp jednostranných čtení. Čtení byla mapována na referenční genom D. melanogaster (verze dm3) pomocí Bowtie 2 v2.2.1 (s volbou -very-sensitive)57 . Čtení s nízkou kvalitou mapování byla odstraněna pomocí nástroje SAMtools53 s volbou -q 30. Duplicitní čtení byla odstraněna pomocí SAMtools rmdup. Pomocí nástroje BEDtools54 v2.16.2 jsme vypočítali log2 ChIP a vstupní signály v 1-kb genomických binech a poté jsme použili funkci hclust v R ke shlukování replikátů pomocí 1-Spearmanova korelačního koeficientu jako metriky vzdálenosti. Čtení byla přiřazena k LAD, pokud se překrývala s LAD, zatímco čtení byla přiřazena k inter-LAD, pokud byla od LAD vzdálena alespoň 1 kb. Vypočítali jsme počty čtení v rámci každého LAD a inter-LAD, normalizovali hodnoty pro součet pokrytí čtení na replikaci, vyloučili z další analýzy LAD a inter-LAD s nulovým pokrytím, zprůměrovali replikace a vypočítali hodnoty log2(FC) mezi vzorky Lam-KD a kontrolními vzorky ChIP.

Postup Hi-C a analýza dat

Knihovny Hi-C ze dvou nezávislých biologických replikátů kontrolních buněk a buněk Lam-KD S2 byly připraveny v podstatě podle předchozího popisu36 s použitím restrikčního enzymu HindIII-HF (NEB). Knihovny byly sekvenovány na platformě Illumina HiSeq 2000, což vedlo k získání 3-4 × 107 párových čtení. Čtení byla mapována na referenční genom D. melanogaster (verze dm3) pomocí Bowtie 2 v2.2.1 (s volbou -very-sensitive)57 . Data Hi-C byla zpracována pomocí pipeline ICE v0.9 (20 iterací iterační korekce), jak je popsáno58. Byly získány mapy interakcí Hi-C s rozlišením 20 kb. TAD byly předpovězeny pomocí softwaru Armatus59 v1.0, ve kterém je průměrná velikost a počet TAD určen parametrem škálování γ. Anotace TAD byla provedena ve dvou krocích, jak je popsáno36. Nejprve jsme ručně zvolili parametr γ, abychom dosáhli dobrého rozdělení TADs (γ = 1,20 pro buňky Lam-KD a γ = 1,12 pro kontrolní buňky). Poté byly TAD větší než 600 kb rozděleny na menší TAD s parametrem škálování γ vynásobeným 2. Poté byly nejmenší TAD (rovné nebo menší než 60 kb) anotovány jako inter-TAD kvůli jejich špatně rozlišené vnitřní struktuře. Výsledkem bylo 576 (u kontroly) a 588 (u Lam-KD) TAD. Abychom zjistili, zda se pozice TAD při Lam-KD mění, analyzovali jsme míru překrytí jednotlivých TAD ve sloučených replikátech kontrolních a Lam-KD buněk s mírou překrytí v kontrolních replikátech nebo v replikátech Lam-KD a nezjistili jsme statisticky významný rozdíl (P > 0,05 v oboustranném Wilcoxonově testu). ACF v rámci každé TAD byla vypočtena jako průměrná hodnota iteračně opravených počtů čtení mezi všemi genomovými biny patřícími do TAD, s vyloučením hraničních binů z obou stran TAD. ACF v rámci každého inter-TAD byla vypočtena jako průměrná hodnota iterativně korigovaných počtů čtení mezi všemi genomovými biny patřícími do inter-TAD a hraničními biny sousedních TAD. Pro každou TAD jsme vypočítali poměr mezi hodnotou ACF v každé replice Lam-KD a hodnotou ACF v každé kontrolní replice (celkem čtyři poměry). Pro následnou analýzu byly použity TAD s alespoň třemi poměry stejného znaménka. Poznamenáváme, že když jsme vybírali TAD podle přísnějšího kritéria (tj. všechny čtyři poměry se měnily stejným směrem), nemělo to na výsledky analýzy vliv (doplňkový obr. 6). Chromatinové kompartmenty byly anotovány pomocí analýzy hlavních komponent, jak je popsáno17. Sedlové grafy byly vytvořeny podle popisu58. Stručně řečeno, použili jsme pozorované/očekávané Hi-C mapy, které jsme vypočítali z 20-kb iterativně opravených interakčních map cis-interakcí vydělením každé diagonály matice její průměrnou hodnotou pro celý chromozom. V každé pozorované/očekávané mapě jsme přeskupili řádky a sloupce v pořadí podle rostoucích hodnot PC1 (které jsme vypočítali pro kontrolní matice). Nakonec jsme řádky a sloupce výsledné matice agregovali do 20 stejně velkých agregovaných binů, čímž jsme získali sedlový graf kompartmentalizace.

Analýza publikovaných dat

Použili jsme anotaci typu chromatinu pro buňky S240. Byly vypočteny podíly typů chromatinu ve 20kb koších. Anotace LAD byla získána z cit.28. Vypočítali jsme podíl délky LAD v každém 20-kb binu TAD.

Modelování polymerů

Při počítačových simulacích jsme použili metodu DPD (Dissipative Particle Dynamics), jak již bylo popsáno36 s některými úpravami. Stručně řečeno, makromolekuly jsou reprezentovány v termínech modelu kuličky a pružiny, přičemž částice interagují konzervativní silou (odpuzování), disipativní silou (tření) a náhodnou silou (generátor tepla). Podrobný popis implementace této techniky byl uveden dříve60. Simulovaný objem buňky byl 50 × 50 × 50 jednotek DPD, hustota se rovná 3, takže celkový počet částic v systému je 375 000. Předpokládáme, že částice odpovídá nukleozomu. Kromě toho zavádíme speciální okrajové podmínky, které jsou periodické pro rozpouštědlo a nepropustné pro ostatní částice. Povrch se skládá z nepohyblivých, šestihranně umístěných částic. V našich simulacích částice napodobují buď „aktivní“, nebo „neaktivní“ typy nukleosomů, zatímco povrch napodobuje NL. „Neaktivní“ částice mohou vytvářet reverzibilní „sytící se“ vazby61,62 mezi sebou navzájem i s částicemi povrchu. Každá „neaktivní“ částice může mít pouze jednu přídavnou vazbu za okamžik, což simuluje interakci kladně nabitého histonového ocasu neacetylovaného nukleosomu s „kyselou skvrnou“ jiného nukleosomu42,43,63 . Náš kopolymerní řetězec je reprezentován 64 bloky, z nichž každý se skládá z 500 „neaktivních“ a 50 „aktivních“ částic. Pravděpodobnost vytvoření asociace mezi dvěma „neaktivními“ částicemi byla stanovena na 0,001, mezi „neaktivní“ částicí a povrchem na 0,007, zatímco pravděpodobnost přerušení takové asociace byla stanovena na 0,01. Během simulací byly všechny částice kontrolovány každých 200 kroků DPD, kdy bylo dosaženo lokální rovnováhy. Provedli jsme 10 nezávislých běhů na superpočítači MSU „Lomonosov-2“ s použitím vlastní implementace pro paralelizovaný kód DPD s rozkladem domény, který je k dispozici na GitHubu .

Statistická analýza

Použili jsme Wilcoxonův test, abychom ověřili, zda je rozdělení hodnot log2(FC) symetrické kolem nuly, a také abychom otestovali, zda se dvě rozdělení hodnot log2(FC) liší polohovým posunem o nulu.

Souhrn zpráv

Další informace o experimentálním designu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, na kterou je odkazováno v tomto článku.