Abstrakt
Buněčný metabolismus závisí na vhodné koncentraci intracelulárního anorganického fosfátu (Pi). Zdá se, že geny reagující na hladovění po Pi jsou zapojeny do mnoha metabolických drah, což naznačuje komplexní systém regulace Pi v mikroorganismech a rostlinách. Pro vstřebávání a udržování přiměřené hladiny fosfátu, který se uvolňuje z fosfátových esterů a anhydridů, je nutná skupina enzymů. Fosfatázový systém je zvláště vhodný pro studium regulačních mechanismů, protože fosfatázová aktivita se snadno měří specifickými metodami a snadno se zjišťuje rozdíl mezi potlačenou a potlačenou hladinou fosfatázové aktivity. Tento článek analyzuje proteinový fosfatázový systém indukovaný během fosfátového hladovění u různých organismů.
1. Úvod
Regulace buněčných procesů, jako je buněčná diferenciace, proliferace, buněčná smrt, mobilita, metabolismus, přežívání a organizace cytoskeletu, v reakci na některé podněty je zásadní pro všechny aspekty buněčného života . Fosforylace proteinů je jedním z nejběžnějších mechanismů používaných k regulaci těchto procesů. Procesy, které jsou reverzibilně řízeny fosforylací proteinů, vyžadují jak proteinkinázu, tak proteofosfatázu .
Tradičně byly proteinkinázy studovány intenzivněji než proteinové fosfatázy kvůli dřívějšímu názoru, že proteinkinázy propůjčují fosforylaci proteinů jemnou regulaci, zatímco proteinové fosfatázy působí pouze na odstraňování fosfátových skupin. Teprve v posledním desetiletí se zjistilo, že proteinové fosfatázy jsou rovněž regulovány různými mechanismy a mají pro buněčnou fyziologii nemenší význam než proteinové kinázy . Proteinové fosfatázy jsou schopny hydrolyzovat fosfomonoesterové metabolity a uvolňovat z těchto substrátů anorganický fosfát (Pi) .
Fosfor ve formě anorganického fosfátu (Pi) je jedním z nejdůležitějších makroživin pro všechny organismy . Využívá se nejen při biosyntéze buněčných složek, jako je ATP, nukleové kyseliny, fosfolipidy a bílkoviny, ale účastní se také mnoha metabolických drah, včetně přenosu energie, aktivace bílkovin a metabolických procesů uhlíku a aminokyselin . Velké množství fosfátů je nutné pro přežití buňky. U rostlin je Pi nezbytný pro růst a vývoj . V houbách dráha přenosu signálu Pi reguluje expresi mnoha genů reagujících na fosfáty, které se podílejí na vychytávání a příjmu Pi z extracelulárních zdrojů . U trypanosomatidních parazitů ovlivňuje Pi jejich schopnost správného růstu a kolonizace v bezobratlých hostitelích .
Shrnem lze říci, že proteinové fosfatázy a kinázy jsou nezbytné pro homeostázu Pi během získávání, ukládání, uvolňování a metabolické integrace Pi . Cílem tohoto článku je shrnout regulaci fosfatáz anorganickým fosfátem s důrazem na úlohu těchto enzymů v buněčné biologii.
2. Zpětnovazební řízení fosfatáz anorganickým fosfátem: PHO dráha
Saccharomyces cerevisiae má několik fosfatáz s různou specifitou, buněčným umístěním a permeázami používanými při příjmu Pi. Soubor genů odpovědných za tyto činnosti je koordinovaně potlačován koncentrací Pi v růstovém médiu . Získávání, skladování, uvolňování a metabolická integrace Pi v buňce vyžaduje účast mnoha základních enzymů, jako jsou extracelulární kyselé fosfatázy (APasy), fosfodiesterasy, transportéry Pi, polyfosfátkinasy, alkalické fosfatázy (ALPasy) a endopolyfosfatázy . Aktivity těchto enzymů jsou neodmyslitelně spjaty s homeostázou Pi a podléhají regulaci prostřednictvím dráhy přenosu signálu Pi (PHO) v reakci na měnící se hladinu Pi .
V jednom ze současných modelů regulace PHO je pozitivní regulátor (nebo pozitivní faktor) Pho4p, kódovaný genem PH04, svou aktivitou a umístěním nezbytný pro transkripční aktivaci genů PHO. V prostředí s vysokým obsahem pí inhibuje komplex cyklin-dependentní kinázy (CDK) sestávající z Pho80p a Pho85p funkci Pho4p hyperfosforylací. Hyperfosforylovaný Pho4p zůstává v cytoplazmě a není schopen aktivovat transkripci genů PHO . Pokud je koncentrace Pi v médiu dostatečně nízká, Pho81p inhibuje funkci komplexu Pho80p-Pho85p , což umožňuje Pho4p přemístit se do jádra a aktivovat transkripci genů PHO . Tyto geny kódují vysokoafinitní transportéry Pho84p a Pho89p; vylučované kyselé fosfatázy Pho5p, Pho11p a Pho12p; další příbuzné proteiny, které zvyšují výtěžnost Pi z extracelulárních zdrojů .
Tato dráha PHO byla popsána u různých organismů, jako jsou rostliny , bakterie a houby .
3 . Fosfatázový systém u kvasinek
Původně bylo zjištěno, že několik fosfatázových genů je modulováno koncentrací Pi v kultivačním médiu; PHO dráha tak byla původně charakterizována diferenciálně exprimovanými fosfatázami .
U S. cerevisiae je transkripce genů kódujících kyselé a alkalické fosfatázy a transportér Pi koordinovaně potlačována a derepresována v závislosti na koncentraci Pi v kultivačním médiu . Většina fosfatáz syntetizovaných v podmínkách limitace Pi je umístěna extracelulárně nebo je spojena s plazmatickou membránou či buněčnou stěnou .
K genům pro fosfatázy regulované P patří PHO5 , který kóduje hlavní část represivních kyselých fosfatáz (rAPase; optimum pH 3-4; EC 3.1.3.2), a jeho izozymy PHO10 a PHO11 . Tyto tři rAPázy jsou glykoproteiny, které se nacházejí v buněčné stěně nebo v periplazmatickém prostoru. Jsou zodpovědné za vychytávání fosfátů a pracují ve spojení s vysokoafinitními transportéry, aby získávaly fosfáty, když je koncentrace Pi v prostředí nízká . RAPáza kódovaná genem PHO5 je během sekrece přes membránu glykosylována a je lokalizována v periplazmatickém prostoru . Pho5p je zodpovědný za >90 % aktivity APázy .
Protože produkt genu PHO5 tvoří většinu kyselých fosfatáz, je regulace PHO5 klíčová pro homeostázu fosfátů v buňce. K vytvoření aktivní chromatinové struktury v promotoru PHO5 a stimulaci transkripce jsou zapotřebí transkripční aktivátory Pho4p a Pho2p. Pho80p-Pho85p je cyklin/cyklin-dependentní kinázový komplex, který fosforyluje Pho4p na mnoha místech a negativně reguluje funkci Pho4p . Huang a O’Shea provedli vysoce výkonný, kvantitativní, enzymatický screening sbírky delecí kvasinek a hledali nové mutanty defektní v expresi PHO5. Mezi konstitutivními mutanty vykazovaly kmeny pho80 a pho85 nejvíce zvýšené hladiny fosfatázové aktivity Pho5 a mRNA PHO5 za podmínek vysokého obsahu fosfátů, což odpovídá jejich ústřední roli v dráze PHO. Úplná ztráta vysoké kinázové aktivity (Pho80p-Pho85) vede k plné aktivaci transkripčního faktoru Pho4, což vede k plné expresi PHO5.
Další důležitou třídou fosfatáz u S. cerevisiae jsou alkalické fosfatázy (ALPáza; optimum pH 8; EC 3.1.3.1). PHO8 kóduje nespecifickou represibilní alkalickou fosfatázu (rALPase). Je to glykoprotein lokalizovaný ve vakuole, který štěpí různé substráty, aby získal fosfát z intracelulárních produktů . Pho8p je dimerický protein závislý na Mg2+/Zn2+ , podobný ALPáze v Escherichia coli a v savčích buňkách . Enzymový produkt PHO13 je monomerní protein a je specifický pro p-nitrofenylfosfát (pNPP) a histidinylfosfát. Tento enzym byl silně aktivován ionty Mg2+ s optimem pH 8,2 a vysokou specifickou aktivitou pro pNPP se střední hodnotou 3,6 × 10-5 M .
4. Phosphorus Stress Modulates Acid Phosphatases in Plants
Kyselé fosfatázy (APázy) mohou být aktivní proti široké škále organických fosfátů přítomných v půdě. Tyto enzymy jsou nespecifické orthofosforečné monoesterfosfohydrolázy (EC 3.1.3.2), které odštěpují Pi z míst esterových vazeb. Vylučované rostlinné fosfatázy udržují 50% aktivitu v širokém rozmezí pH (4,0-7,6), udržují 80% aktivitu v širokém rozmezí teplot (22-48 °C) a jsou stabilní při teplotách až 60 °C, což z nich činí ideální kandidáty na aktivní půdní enzymy .
APázy jsou v Arabidopsis hojně zastoupeny a jsou reprezentovány nejméně čtyřmi rodinami genů. Nedávný průzkum anotovaného genomu Arabidopsis identifikoval sekvence pro 1 Hisovu APasu, 4 fosfatidové APasy, 10 APas vegetativních zásobních proteinů a 29 purpurových APas .
V posledních letech je značný zájem o purpurové APasy (PAP). Srovnávací analýza struktury PAPs z vyšších rostlin a savců umožnila identifikovat konzervované sekvenční a strukturní motivy u tohoto typu enzymu z mnoha eukaryotických druhů .
Biochemicky fungují rostlinné PAP jako homodimerní proteiny s molekulovou hmotností ~55 kDa na monomer, zatímco savčí PAP jsou obvykle monomerní proteiny s molekulovou hmotností ~35 kDa . Mnohé PAP jsou glykoproteiny, které jsou zaměřeny na sekreční dráhu . U jednoho PAP ze Spirodela oligorrhiza bylo zjištěno, že je v buňce ukotven glykosylfosfatidylinositol . Strukturně mají rostlinné PAP dvě domény. NH2-doména nemá katalytickou funkci. COOH-doména má kovové centrum a je katalytickou doménou enzymu. Další PAP z Lupinus albus může na svém karboxylovém konci obsahovat třetí doménu, jejíž struktura se podobá struktuře sterolových desaturáz . Není známo, jak běžné jsou poslední dvě formy posttranslační modifikace u PAP jiných druhů. PAP jsou metaloenzymy, které mají ve svém aktivním místě dvoujaderný komplex kovových iontů. Jejich charakteristická růžová až fialová barva je způsobena přechodem náboje tyrosinovým zbytkem koordinujícím železitý ion . Tento enzym může hydrolyzovat estery a anhydridy kyseliny fosforečné .
PAP byly izolovány z Phaseolus vulgaris (fazol obecný) , Glycine max (sója) , Lupinus albus (lupina bílá) , Lycopersicon esculentum (rajče) , Triticum aestivum (pšenice) , Hordeum vulgare (ječmen) , Zea maize (kukuřice) a Oryza sativa (rýže) .
Odpověď rostlin na hladovění po Pi lze rozdělit do dvou kategorií: specifická odpověď a obecná odpověď. Specifické reakce podporují účinnou mobilizaci a získávání Pi z růstového média a intracelulárních zásob. Obecné reakce umožňují dlouhodobé přežití koordinací buněčného metabolismu s dostupností živin a růstovým potenciálem . Realizace těchto strategií vyžaduje změny v expresních profilech stovek genů, jak ukázaly analýzy transkriptomu Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .
Během hladovění po Pi rostliny zvyšují expresi fosfatáz jako obecnou odpověď . Produkce fosfatáz je spojena s nedostatkem Pi a byla navržena pozitivní korelace mezi produkcí kyselých fosfatáz a výživou Pi . Například rostliny, jako je lupina, které jsou efektivnější v získávání Pi z půdy, produkují výrazně více fosfatázy ve srovnání s obilovinami .
Wu et al. analyzovali regulaci proteinových fosfatáz u Arabidopsis a zjistili, že tři geny pro PAP jsou indukovány hladověním po Pi. Gen At1g25230 byl navíc indukován více než dvojnásobně, což ukazuje, že tento gen reaguje na hladovění po Pi.
V genomu rýže bylo identifikováno celkem 26 domnělých genů PAP a hladovění po Pi indukovalo expresi 10 genů PAP rýže, což naznačuje, že hrají důležitou roli při aklimatizaci rýže na podmínky s nízkým obsahem Pi .
V Lycopersicon esculentum (rajče) je LePS2 indukován hladověním po Pi . Je třeba poznamenat, že fosfatázy LePS2 představují první cytoplazmatické fosfatázy, které jsou součástí reakce na hladovění po Pi . Suspenze buněk rajčete v médiu s hladem po Pi vedla k přibližně čtyřnásobnému zvýšení aktivity specifické pro PAP, ale u buněk udržovaných v médiu s vysokým obsahem Pi zůstala aktivita specifická pro PAP nízká a konstantní. Zvýšení aktivity PAP u buněk rostoucích v médiu s nedostatkem Pi ukazuje, že PAP by mohl hrát roli při zvyšování dostupnosti a využití Pi a může být klíčový pro mobilizaci intracelulárního Pi tím, že detekuje nedostatek Pi v rajčeti .
5. Ektofosfatázy jako senzory Pi
Plasmatická membrána buněk může obsahovat enzymy, jejichž aktivní místa směřují spíše do vnějšího prostředí než do cytoplazmy. Aktivitu těchto enzymů, označovaných jako ektoenzymy, lze měřit pomocí intaktních buněk . Ektofosfatázy a ektokinázy byly zjištěny u několika mikroorganismů, včetně prvoků , bakterií a hub .
Mnoho studií prokázalo úlohu ektofosfatáz při získávání Pi pro využití v růstu různých typů buněk . U buněk hub (Fonsecae pedrosoi) vyčerpání Pi z kultivačního média zřejmě vyvolává expresi různých aktivit ektofosfatáz . Bylo prokázáno, že kultivace těchto hub v nepřítomnosti exogenního Pi vede ke vzniku houbových buněk exprimujících 130krát vyšší ektofosfatázovou aktivitu než houby kultivované v přítomnosti Pi . Buňky trypanosomatid mají ektofosfatázy, které poskytují Pi hydrolyzací fosfomonoesterových metabolitů . Například u T. rangeli vyvolává nízká koncentrace Pi v růstovém médiu expresi odlišné aktivity ektofosfatázy , což naznačuje, že tento enzym vede k hydrolyzaci fosforylovaných sloučenin přítomných v extracelulárním médiu. Tato hydrolýza by mohla přispívat k získávání Pi během vývoje epimastigotů T. rangeli .
V podmínkách limitace Pi exprimují fluorescenční bakterie Pseudomona soubor genů pro hladovění po fosfátech . Například u kmene P. putida KT2442 je indukováno nejméně 56 proteinů hladovění po Pi a u kmene P. fluorescens DF57 byla zaznamenána indukce několika genů hladovění po fosfátu .
U mnoha eukaryot je za hydrolýzu fosfátu z extracelulárních nukleotidů přímo zodpovědná rodina proteinů nukleotid pyrofosfatáza/fosfodiesteráza (E-NPP). NPP1 až -3 se nacházejí téměř ve všech typech lidských tkání a tyto enzymy obsahují alkalickou doménu ektonukleotid pyrofosfatázy/fosfodiesterázy typu 1. V S. cerevisiae jsou NPP1 a NPP2 regulovány prostřednictvím transkripce regulované Pi .
6. Závěrečné poznámky
Pi je sloučenina, která je limitující pro růst různých organismů, když je její dostupnost v mnoha ekosystémech nízká . Indukce fosfatázové aktivity v reakci na hladovění po Pi je běžným jevem u organismů, které získávají Pi z prostředí. Tyto enzymy jsou schopny hydrolyzovat fosforylované substráty a dodávat tak zdroj Pi při nedostatku živin. U Saccharomyces cerevisiae spouští signál hladovění po Pi zvýšenou produkci nejméně čtyř typů fosfatáz: (1) kyselé fosfatázy Pho5, Pho11 a Pho12, které jsou lokalizovány v periplazmatickém prostoru; (2) alkalická fosfatáza Pho8, která je lokalizována ve vakuole; (3) glycerolová fosfatáza Hor2; (4) předpokládaná polyfosfatáza Phm5, která je lokalizována ve vakuole. Všechny tyto enzymy mohou přispívat ke zvýšené hladině volného Pi . Těmto enzymům však lze přisoudit i jiné funkce.
Del Pozo a spol. purifikovali kyselou fosfatázu AtACP5, která je indukována hladověním po Pi u Arabidopsis thaliana. Tento enzym vykazuje dvě aktivity, hydrolýzu fosforylovaných substrátů a tvorbu peroxidu. Fosfatázová aktivita pravděpodobně odráží roli v mobilizaci Pi; peroxidační aktivita naznačuje, že AtACP5 by také mohla hrát roli v metabolismu reaktivních forem kyslíku .
Souhrnně lze říci, že fosfatázy indukované hladověním po Pi hrají roli v adaptaci organismu na stres, i když lze nalézt i jiné role.
Poděkování
Autoři děkují za finanční podporu poskytnutou Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Na této práci se stejnou měrou podíleli C. F. Dick a A. L. A. Dos-Santos.