Menselijke deelnemers

Experimenten in Spanje werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het University Hospital La Fe Valencia en hielden zich aan de grondbeginselen van de Verklaring van Helsinki en verdere herzieningen. Experimenten in Berlijn werden goedgekeurd door de ethische commissie van Charité-Universitätsmedizin, Berlijn (EA4/012/05). Twee cohorten werden bestudeerd: één bestond uit 65 gezonde volwassen vrijwilligers en één uit 16 patiënten met Ushersyndroom (type II) met verschillende truncatiemutaties in USH2A. Gegevens van drie patiënten werden weggelaten uit de huidige studie, omdat twee patiënten een eerdere diagnose van diabetes hadden en een patiënt met carpaal tunnel syndroom, wat psychofysische drempels zou kunnen beïnvloeden. Deelnemers aan de studie werden getest met een batterij bestaande uit negen psychofysische tests die op de huid werden aangebracht. Alle deelnemers kregen schriftelijke en mondelinge informatie voordat ze deelnamen aan het onderzoek, en gaven schriftelijk toestemming. Geen van de deelnemers aan het onderzoek was <20 jaar oud. De volgende informatie over de deelnemers werd gedocumenteerd: leeftijd, geslacht, handigheid, gehoorapparaten (gehoorapparaten, cochleaire implantaten), ernst van de symptomen van doofheid en blindheid, en comorbiditeiten.

Menselijke kwantitatieve sensorische testen

Psychofysische testen werden uitgevoerd volgens het gestandaardiseerde testprotocol van de kwantitatieve sensorische testen van het Duitse Onderzoeksnetwerk voor Neuropathische Pijn44. Vibrotactiele perceptuele drempels bij verschillende frequenties werden bepaald met behulp van een tweekeuzetest1,2. Het toestel bestond uit een lineaire piëzo-actuator (Physik Instrumente, catalogusnr. P-602.1 L), waarvan de verplaatsingen worden gestuurd en gecontroleerd door een versterker/regelaar (Physik Instrumente, catalogusnr. E-665). De signalen werden verwerkt door het data-acquisitiesysteem PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). De trillingsstimulus was 1,8 s lang en de stijg- en daaltijd bij begin en offset waren respectievelijk 500 en 600 ms, onafhankelijk van de testfrequentie of amplitude. De duur van de stimulus tussen de aan- en uitfase was 700 ms. Een set van de trillingen stimuli werd gebruikt die logaritmisch geschaald tussen 18 nm en 45 urn. Voor de 10-Hz en 125-Hz trillingstests, werd de beginamplitude ingesteld op 7,18 urn en 2,84 urn, respectievelijk. Wij hebben de beweging van de probe onder de gebruikte testomstandigheden niet rechtstreeks gemeten. Deze piëzo actuator toont een hoge getrouwheid, maar amplitude demping zou theoretisch kunnen optreden bij grotere amplitude verplaatsingen in de buurt van de maximale amplitude van de actuator (35 µm). Alle deelnemers vertoonden echter psychofysische drempels ver beneden 35 µm voor alle geteste frequenties (Fig. 1c). Merk op dat exact dezelfde apparatuur werd gebruikt voor metingen bij gezonde controles en deelnemers met Ushersyndroom. Mechanische trillingsstimuli werden toegediend aan de huid tussen het nagelbed en het eerste gewricht van de pink. De probe was gemaakt van glas en had een 5 mm diameter, plat, cirkelvormig contactoppervlak met een messing contragewicht om ervoor te zorgen dat bij elke deelnemer dezelfde mate van houdkracht werd uitgeoefend. De pink van de dominante hand werd getest bij twee frequenties (10 Hz en 125 Hz; duur 1,8-s). Deelnemers gaven de detectie van een trillende stimulus tijdens een van de twee tijdsvensters aan door op een knop te drukken. Het protocol bestond uit een up-down ontwerp dat de amplitude van de stimulus verhoogde of verlaagde (tussen 18 nm en 45 µm), afhankelijk van het succespercentage tijdens de taak. Acht up-down amplitude omkeringen (een totaal van ~40-80 individuele trials per sessie) rond de perceptuele drempel werden uitgevoerd om een gemiddelde perceptuele drempel voor elke patiënt te creëren. De amplitude van de trillingsstimuli aangedreven door het piëzo apparaat werd gekalibreerd door het meten van de verplaatsingsamplitude van de probe onder een microscoop naar stapvormige spanningsstappen.

Een tactiele scherpte test werd ook gebruikt om de grenzen van de ruimtelijke resolutie van de vingertop (mediane innervatie) te testen, met behulp van een twee-interval, geforceerde keuze, tactiele grating oriëntatie test met een tactiele scherpte kubus, die bestond uit zes zijden met roosters van verschillende breedtes (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 en 6,0 mm)1,2,3. De deelnemers werden geblinddoekt en de kubus werd in verticale of horizontale richting tegen hun vingertop geplaatst. Er werd gebruik gemaakt van een “two-down and one-up” procedure met 10-15 grating size omkeerpunten. Drempels (71% correcte respons) werden berekend als mediaan van de laatste 10 van 15 draaipunten2. Mechanische detectiedrempels werden bepaald met behulp van een gestandaardiseerde set van 23 vFh filamenten (Optihair3-Set) met krachten tussen 0,25 en 265 mN. VFhs werden in oplopende volgorde aangebracht op het dorsale aspect van de hand (radiale innervatie) gedurende 1 s tot de deelnemer een tactiele sensatie waarnam. De volgorde werd dan omgekeerd tot het punt waarop de deelnemer geen tactiele sensatie meer waarnam. De gemiddelde kracht van vijf omkeringen werd als drempelwaarde genomen. Mechanische pijndrempels werden getest met een set van zeven gewogen pinprik stimulators (MRC Systems) met tips van 0,25 mm en krachten tussen 8 en 512 mN. Er werd een eenvoudige trapmethode (one-up and one-down regel) uitgevoerd waarbij patiënten werd gevraagd of de stimulus werd waargenomen als een scherpte die het gevoel van prikpijn veroorzaakte. Stimuli werden aangebracht op het dorsale aspect van de hand na vFh detectie taken. De drempelwaarde werd berekend aan de hand van het gemiddelde van vijf omkeringen. Thermische warm en koel perceptie drempels, en warme en koude pijn drempels, werden getest met behulp van een TSA II Thermosensorische analyzer (MEDOC). De thermode had een oppervlakte van 9 cm2, cut-off temperaturen tussen 0 en 50 °C, en een temperatuurveranderingssnelheid van 1 °C s-1. De thermode werd geplaatst op het volar aspect van het middenvoorarmgebied (mediale antebrachiale innervatie). Drie opeenvolgende proeven werden uitgevoerd voor elke thermische test in de volgende volgorde: koude detectie, warme detectie, en koude pijn en warmte pijn drempels. Deelnemers aan het onderzoek werd gevraagd aan te geven op welk moment zij afkoeling, opwarming, koude- en warmtepijn begonnen te ervaren. Drempels waren de gemiddelde temperatuur van de drie trials in elke test.

Muizen

Alle experimenten werden goedgekeurd door het Berlijnse Animal Ethics Committee (Landesamt für Gesundheit und Soziales) en uitgevoerd in overeenstemming met de Europese dierenwelzijnswetgeving. Mannelijke en vrouwelijke Ush2a-/- muizen en wild-type nestgenoten (Ush2a + / +) van de CBA / CaJ achtergrond tussen de 10 en 30 weken oud werden gebruikt 11. Alle anatomische en elektrofysiologische experimenten werden uitgevoerd op ongeveer gelijke aantallen vrouwelijke of mannelijke muizen. Voor de trildetectietaak werden alleen vrouwelijke muizen gebruikt. Alle muizen werden gehouden op een 12 uur licht:12 uur donker cyclus.

Muis weefsel anatomie en immunohistochemie

Voor de huid immunohistochemie, werden muizen geëuthanaseerd door CO2 inhalatie gedurende 2-4 min, gevolgd door cervicale dislocatie, en poot huidweefsel werd ontleed en de hypodermis, ligamenten en aanhangend spierweefsel verwijderd. Huidmonsters werden uitgerekt met insectenspelden en gefixeerd gedurende 45 min in 4% paraformaldehyde (PFA). Voor gelatine vibratome secties, weefselmonsters werden geplaatst in inbedvormen (Polysciences, T-8), gevuld met warme gelatine (20%, opgelost in 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)), en post-gefixeerd in 4% PFA overnacht bij 4 ° C vóór 120-µm secties werden gesneden met behulp van een vibratome (Leica, VT100S). Voor whole-mount kleuring, werden huidmonsters gestrekt gedurende 2 uur in PFA, vervolgens gefixeerd bij 4 ° C gedurende 24 uur in 20% dimethylsulfoxide en 80% methanol. Na het uitsnijden of post-fixeren werden de weefselmonsters driemaal gewassen in PBS (0,1 M) en gedurende 72 uur bij 4 °C geïncubeerd in een blokkeeroplossing en primaire antilichamen. De monsters werden vervolgens driemaal gewassen in PBS vóór 24 uur incubatie (4 °C) met secundaire antilichamen die waren verdund in de blokkeeroplossing. Weefsel werd vervolgens opnieuw driemaal gewassen en verwerkt voor weefselklaring met 2,2′-thiodiethanol (TDE, Sigma-Aldrich). Secties werden om de 2 uur in toenemende concentraties TDE geplaatst, van 10% tot 25%, 50% en 97%, waarin de monsters werden bewaard en gemonteerd op objectglaasjes en dekglaasjes.

Polyclonale antilichamen gericht tegen Ush2A werden gegenereerd bij het konijn door Eurogentec. Er werden vier antilichamen gemaakt die zich binden aan verschillende bindende epitopen op de N- en C-termini van Ush2A (N-terminus: antilichaam 1, CSPLYNDKPFRSGDNV en antilichaam 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminus: antilichaam 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR en antilichaam 2, CIRERPPLVPLQKRMT), en werden gezuiverd van antisera vóór gebruik. Alle vier antilichamen werden samen gebruikt (1:200) voor kleuringprotocollen in opeenvolgende kleuring met kip anti-NF200 (Millipore, 1:1.000), konijn anti-S100 (Dako, 1:1.000) of cavia anti-CK20 (Origene Tech, 1:200). De gebruikte secundaire antilichamen waren anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-kip Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), anti-muis Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-rabbit Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) en anti-guinea-pig Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Getegelde z-stack beelden werden verkregen met een confocale microscoop (Carl-Zeiss, catalogusnr. LSM700) met Zen2009 software. NF200 + en S100 + zenuwvezel-innerend Meissner’s corpuscles en haarzakjes werden gevisualiseerd en geteld met behulp van Fiji / ImageJ. Voor elektronenmicroscopie beelden van de nervus is, dieren werden doorbloed en de nervus ischiadicus werd ontleed en gefixeerd in 4% PFA en 2,5% glutaaraldehyde, en gecontrasteerd met osmiumtetroxide vóór inbedding in Technovit 7100 hars (Heraeus Kulzer). Er werden ultradunne coupes gemaakt bij een vergroting van 5600×. Gemyeliniseerde zenuwvezels en ongemyeliniseerde vezels werden geteld en gemeten met behulp van Fiji / ImageJ software.

Reproduceerbaarheid

Alle immunohistochemische experimenten en beelden vastgelegd werden herhaald in meerdere cohorten muizen op verschillende dagen, en er werden geen beelden genomen van enkele individuen die niet konden worden gereproduceerd. Elektronenmicroscopie beelden werden genomen van verschillende nestgenoten in een enkele experimentele run.

Muis huid-nerve voorbereiding en sensorische afferente opnames

Cutane sensorische vezel opnames werden uitgevoerd met behulp van de ex vivo huid-nerve voorbereiding. Muizen werden geëuthanaseerd door CO2-inhalatie gedurende 2-4 min, gevolgd door cervicale dislocatie. Drie verschillende preparaten werden uitgevoerd in afzonderlijke experimenten met verschillende poot regio’s: de nervus saphenus innervatie van de harige achterpoot huid 21, de nervus tibialis innervatie van de glabrous achterpoot huid, en de mediale en ulnaire zenuwen innervatie van de voorpoot glabrous huid 20. Bij alle preparaten werd de behaarde huid van de ledemaat geschoren en werden de huid en de zenuw ontleed en overgebracht naar de opnameruimte, waar spier-, bot- en peesweefsel van de huid werden verwijderd om de opnamekwaliteit te verbeteren. De opnameruimte werd doorbloed met een 32 °C synthetische interstitiële vloeistof: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM natriumgluconaat, 5,5 mM glucose, 7,5 mM sucrose en 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur (Hepes), pH 7,4. De huid werd vastgepind en uitgerekt, zodat de buitenkant van de huid kon worden gestimuleerd met stimulatorsondes. De perifere zenuw werd doorgevoerd naar een aangrenzende kamer in minerale olie, waar fijne filamenten werden losgeweekt van de zenuw en geplaatst op een zilverdraad opname-elektrode.

De ontvankelijke velden van individuele mechanoreceptoren werden geïdentificeerd door mechanisch aftasten van het oppervlak van de huid met een stompe glazen staaf of een stompe tang. Analoge uitgang van een Neurolog versterker werd gefilterd en gedigitaliseerd met behulp van de Powerlab 4/30 systeem en Labchart 7.1 software (ADinstruments). Spike-histogram uitbreiding voor Labchart 7.1 werd gebruikt om spikes van individuele eenheden sorteren. Elektrische stimuli (1 Hz, vierkante pulsen van 50-500 ms) werden toegediend aan receptieve velden van afzonderlijke eenheden om de geleidingssnelheid te meten en classificatie als C-vezels (snelheid <1,2 m s-1), Aδ-vezels (1,2-10 m s-1) of Aβ-vezels (>10 m s-1) mogelijk te maken. Mechanische stimulatie van de receptieve velden van neuronen werden uitgevoerd met behulp van een piëzo actuator (Physik Instrumente, catalogusnr. P-841.60) en een double-ended Nanomotor (Kleindiek Nanotechnik, catalogusnr. MM-NM3108) aangesloten op een krachtmeetinstrument (Kleindiek Nanotechnik, catalogusnr. PL-FMS-LS). Gekalibreerde krachtmetingen werden gelijktijdig verworven met behulp van het Powerlab systeem en Labchart software tijdens het experiment (Extended Data Fig. 10).

Aangezien verschillende vezeltypen verschillende stimulus-tuning eigenschappen hebben, werden verschillende mechanische stimuli protocollen gebruikt op basis van het type eenheid. Laagdrempelige Aβ-vezels (RAM’s en SAM’s) en Aδ-vezel D-haren werden gestimuleerd met de piëzo actuator met drie trillingen stimuli (5 Hz, 25 Hz en 50 Hz, vervormingen geïntroduceerd door de in-series krachtsensor uitgesloten met behulp van frequenties >50 Hz) met toenemende amplitude meer dan zes stappen (piek-tot-piek amplitudes van ~ 6-65 mN; 20 cycli per stap), en een dynamische stimulussequentie met vier ramp-and-hold golfvormen met variërende sondeafbuigingssnelheden (3 s duur; 0.075, 0,15, 0,45 en 1,5 mm s-1; gemiddelde amplitude 100 mN). Aβ-vezels SAMs en RAMs werden ingedeeld door de aan-of afwezigheid van vuren tijdens de statische fase van een ramp-and-hold stimulus, respectievelijk, zoals eerder beschreven20,21. Eenheden werden bovendien gestimuleerd met een reeks van vijf statische mechanische stimuli met ramp-and-hold golfvormen van toenemende amplitude (3 s duur; variërend van ~ 10 mN tot 260 mN). Lage drempel SAMs, hoge drempel Aδ-vezels en C-vezels werden ook gestimuleerd met behulp van de nanomotor met vijf ramp-and-hold stimuli met toenemende amplitudes20.

Single-unit opnamen van Pacinian afferents

Om de mechanosensitiviteit van Pacinian corpuscles gelegen rond de fibula te beoordelen, werden de huid en alle spieren verwijderd uit het onderbeen en de nervus interossea werd ontleed vrij van de membrana interossea. Vervolgens werden de fibula en tibia, die bij muizen zijn vergroeid langs hun distale helft, verwijderd uit het dier, samen met de nervus interossea, en werden overgebracht naar een aangepaste orgaanbad kamer waar ze werden gemonteerd met behulp van een aangepaste mini-vice. De gehele dissectie procedure werd uitgevoerd in ijskoude dissectie buffer die 108 mM N-methyl-d-glucamine, 20 mM Hepes, 3,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumgluconaat, 5,5 mM glucose, 18,5 mM sucrose en 0,5 mM CaCl2 (aangepast aan pH 7,4 met NaOH) bevatte. Na een herstelperiode van 10 min werd het preparaat doorbloed met zuurstofrijke opnamebuffer (35 °C), die bestond uit 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,5 mM CaCl2 (aangepast tot pH 7,4 met NaOH).7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumgluconaat, 5,5 mM glucose, 7,5 mM sucrose en 1,5 mM CaCl2 (aangepast tot pH 7,4 met NaOH), en het proximale uiteinde van de zenuw interosseous werd overgebracht naar een met olie gevulde opnameruimte door het door een klein gaatje (~ 1 mm diameter) dat het orgaan bad kamer met de aangrenzende opnameruimte verbond. Na verwijdering van de perineurium, werden enkele filamenten ontleed vrij en aan de opname-elektrode voor actiepotentiaal opname. Opnamen werden gemaakt met de Neurolog systeem (Digitimer Ltd, catalogus nrs. NL100AK en NL104A) en een PowerLab 4SP gecontroleerd door LabChart 7.1 (AD Instruments). Om de mechanische activeringsdrempel en de frequentie afstemming van Pacinian afferenten te bepalen, werd een reeks van sinusvormige mechanische stimuli (duur 1 s; lineair toenemende amplitude damp/dt = 30 µm s-1; maximale amplitude 30 µm) met toenemende frequenties (40-480 Hz) toegepast op het distale uiteinde van de fibula met een metalen staaf (tip diameter 1 mm) die was bevestigd aan een piëzo actuator (Physik Instrumente GmbH, catalogusnr. P-840.2).

Muis vibratie-perceptie leertaak

Vooreerst, voor de implantatie van de hoofdsteun, werden muizen verdoofd met isofluraan (1,5-2% in O2) en subcutaan geïnjecteerd met metamizol (200 mg per kg lichaamsgewicht). Een lichte metalen steun werd geïmplanteerd op de schedel met lijm (UHU dent) en tandheelkundig cement (Paladur). De temperatuur van de muizen werd gecontroleerd met een rectale sonde en op 37 °C gehouden met behulp van een verwarmingskussen. De muizen werden vervolgens in hun thuiskooi geplaatst met metamizol (200 mg ml-1) in het drinkwater. Geïmplanteerde muizen werden 3-5 d na de operatie gewend aan hoofdsteunen. Muizen werden geleidelijk in de gedragsopstelling gewend aan fixatie van het hoofd. Vervolgens, 1 d na het begin van de waterbeperking, ondergingen de muizen twee koppelsessies op opeenvolgende dagen.

Tijdens koppelsessies (30 tot 45 minuten duur), werden waterbeloningen gegeven uit een watertuit in combinatie met de presentatie van de vibratiestimulus (3 s duur, 5 Hz, 60 mN) op de glabberhuid van de voorpoot om een associatie op te bouwen tussen stimulus en beloning. De vibratiestimulus werd aan de poot gegeven via een op maat gemaakte, 2 mm2 gedempte glazen staaf bevestigd aan een piëzo actuator (PICMA van Physik Instrumente, catalogusnr. PL127.11). Een spanning-kracht relatie werd gekalibreerd door gebruik te maken van een krachtmeetsysteem (Dual-Mode Lever Arm systeem 300-C, Aurora Scientific) om de toegepaste sinusoïdale kracht profiel toegepast door de piëzo apparaat na elk experiment te meten. De gebruikte buigpiëzo-actuator kan wat harmonische ruis hebben toegevoegd in vergelijking met andere gestapelde piëzosystemen. Echter, kalibratie van de piëzo in elk experiment ervoor gezorgd dat de aanzienlijke tekortkomingen in tactiele perceptie van Ush2a-deficiënte muizen was het onwaarschijnlijk dat een technische artefact.

Na het koppelen, begon de dagelijkse training sessies waarbij muizen een kleine water beloning (4-7 pi) uit de tuit ontvangen wanneer ze correct likte tijdens een window of opportunity aan het begin van de stimulus (3,5 s). Catch trials, waar geen stimulus werd gepresenteerd en likken werden geteld als vals alarm, werden afgewisseld als 50% van het totaal aantal proeven. Trials werden niet getriggerd door een externe gebeurtenis of stimulus zoals eerder beschreven10 en werden geleverd met willekeurige tijdsintervallen tussen 3 en 30 s. Als muizen likten tijdens een 2-s venster voor de stimulus onset, werd een 3- tot 30-s vertraging opgelegd om stimulus-water beloning associatie te bevorderen. Een trainingssessie bestond uit ongeveer 60 trials (30× stimulus + 30× vangst). Hits en vals alarm percentages werden vergeleken om de prestaties tijdens de trainingssessies te beoordelen. Om te testen of de muizen likten als reactie op de vibratiestimulus van de voorpoot, werd aan het eind van de training een sessie ingelast waarbij de stimulator 3-5 mm onder de poot werd geschoven, zodat geen huidcontact werd gemaakt. In de daaropvolgende experimentele dagen nadat de muizen de taak met succes hadden geleerd, werden trillingsstimuli gegeven met verschillende amplitudes en frequenties. Voor 5-Hz vibratie werden krachten van 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN en 6 mN gebruikt om de voorpoot te stimuleren, met twee verschillende amplitudes afgewisseld met vangstproeven gedurende elke dag. Zo werden 48-mN en 24-mN stimuli en vangstproeven afgewisseld tijdens één sessie, die bestond uit ongeveer 100 proeven (33× 48-mN stimulus + 33× 24-mN stimulus + 34× vangst). De 6-mN stimuli werden getest gedurende twee sessies. Voor 25-Hz en 125-Hz trillingen, 60-mN en 12-mN krachten van dezelfde frequentie werden afgewisseld met vangst trials op dezelfde manier over twee testsessies.

Muis gepaarde-pulse inhibitie gedragstest

De schrikreactie van muizen werd beoordeeld met behulp van de Startle Response systeem (SR-LAB, San Diego Instruments). Muizen werden gewenning aan het apparaat voor 30 min elke dag gedurende 3 d voor de test. In het kort werden de schrikreacties van muizen gemeten over een totaal van 48 puls-alleen trials45 (40 ms duur, 129 dB) en prepulse + puls trials (20 ms prepulse van 69, 73 of 81 dB). Prepulse trials waren 200 ms voor pulse trials. Het percentage gepaarde-puls inhibitie (% PPI) voor elke pulsintensiteit werd berekend als %PPI = 100 × ((puls alleen) – (puls + puls))/puls alleen.

Muis vFh en penseel gedragstests

Muizen werden elke dag gedurende 30 min gewent aan de testomgeving gedurende 3 d voor de test. Op experimentele dagen werden de muizen in individuele plexiglas hokjes geplaatst op een verhoogd gaasplatform. Voor de borsteltest werd de linker achterpoot van hiel tot teen geaaid met een verfborstel met een kop van 2 mm, 10× met willekeurige tussenpozen. Het percentage terugtrekkingen werd berekend. Op de daaropvolgende testdagen werden de mechanische nocifensieve terugtrekdrempels gemeten met behulp van vFhs. Kort gezegd werden de plantaire oppervlakken van de linker achterpoot gestimuleerd met vFh filamenten en de reflexdrempel werd bepaald met behulp van de up-down methode46. Afhankelijk van de reactie van het dier werden vFhs met een hogere of lagere kracht op de achterpoot toegepast om een reeks van zes tot negen positieve of negatieve reflexintrekkingen tot stand te brengen. Dit patroon van responsen werd vervolgens omgezet, zodat de gegevens worden uitgedrukt als de log van het gemiddelde van de 50% reflex terugtrekking drempel46.

Gegevensanalyse van de menselijke psychofysica gegevens

De gegevens werden getest op normaliteit, en verschillen in psychofysische prestaties voor elke test tussen controle deelnemers en patiënten met Ushersyndroom werden vergeleken met behulp van ongepaarde Student’s t-tests of Mann-Whitney U-tests. De z-transformaties werden gebruikt om individuele dataprofielen te vergelijken met het gemiddelde en de s.d. van de gezonde controle. De z-score werd berekend met Excel-spreadsheets op basis van de formule z = (patiëntenscore – groepsgemiddelde per s.d. van het groepsgemiddelde). De z-waarden >0 wijzen op functieverbetering, wat betekent dat de deelnemer gevoeliger is voor de geteste stimuli in vergelijking met gezonde controles. Individuele z-scores die buiten het 95%-betrouwbaarheidsinterval (d.w.z. z-score <1.96 of >1.96 s.d.) van de gezonde-controledataset liggen, kunnen worden geïdentificeerd. Prestaties in elke test werd getest in paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Mann-Whitney U-toets en we beschouwden P < 0,01 als statistisch significant.

Data-analyse van de muis trillingsgedrag

Klikken werden geregistreerd met een sensor op de punt van het water beloning tuit. In stimulus trials, werd een hit geteld wanneer er een lik binnen de window of opportunity (3,5 s) na de start van de stimulus. Gedragsgegevens werden verzameld met behulp van aangepaste routines in Lab View op een 1-kHz sampling rate, en aangepaste Python scripts werden gebruikt voor analyse. Tijdens vangstproeven vond vals alarm plaats wanneer er gelikt werd tijdens een even lang window of opportunity. Om te beoordelen of muizen met succes de detectietaak leerden, werden hit rates vergeleken met vals alarm rates binnen dezelfde trainingssessie, met behulp van two-way repeated-measures analysis of variance (ANOVA) met Bonferroni’s post-hoc testing.

Om de prestaties in de detectietaken te kwantificeren, gebruikten we d’ (gevoeligheidsindex) in plaats van het percentage correcte trials om rekening te houden met bias in de likcriteria47. Om d’ te berekenen, werd de volgende formule gebruikt: d’ = z(h) – z(fa), waarbij z(h) en z(fa) de normale inverse zijn van de cumulatieve verdelingsfunctie van respectievelijk het hit- en het vals-alarmpercentage. Om oneindige d’-waarden te vermijden, werden de percentages, wanneer alle trials werden gerapporteerd (rate = 1) of geen enkele (rate = 0), vervangen door (1½N) of (½ N), respectievelijk, waarbij N het aantal trials is waarin de stimulus werd gepresenteerd48. De z-scores voor hit- en vals alarmpercentages werden berekend met OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) met de functie NORMINV. We hebben statistische tests uitgevoerd op gegevens alleen waar ten minste een van de genotypes toont d ‘ > 1,0, wat aangeeft dat deze muizen de stimulus gemeld. Gedragsgegevens werden verzameld met behulp van aangepaste routines in Lab View op een 1-kHz sampling rate, en aangepaste Python scripts werden gebruikt voor analyse. De aangepaste codes en scripts zijn beschikbaar op aanvraag; meer informatie is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary geassocieerd met dit manuscript.

Likgedrag werd berekend en uitgezet als likwaarschijnlijkheid, eerste likfrequentie (Hz) of gemiddelde eerste liklatentie (s). Deze maten werden als volgt berekend: likkans is de kans dat een muis tenminste eenmaal likt tijdens de gelegenheid in een stimulus of vangproef (proeven met tenminste 1 lik/totaal aantal proeven). In de PSTHs van eerste likken tonen we de verdeling van de latenties van eerste likken in stimulus of vangst trials. Om deze gegevens te normaliseren over muizen, hebben we het aantal eerste likken gedeeld door het totaal aantal trials. Door de eerste lik waarde te delen door de bin breedte, berekenden we de waarde in hertz (likken per s). De gemiddelde eerste lik latentie (s) werd berekend door de latenties van de eerste lik in elke hit trial op te tellen en te delen door het totaal aantal trials.

Data-analyse van huid-nerve preparaten

Cutane voorpoot en achterpoot eenheden werden gecategoriseerd op basis van hun geleidingssnelheid en reacties op mechanische stimuli. Mechanische drempels van eenheden werden berekend als de temperatuur of mechanische amplitude die nodig is om de eerste actiepotentiaal uit te lokken. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism 6.0 en Python. Statistische tests omvatten twee-wegs repeated-measures ANOVAs met Bonferroni’s post-hoc test, Student’s t-tests, Mann-Whitney U-tests en Wilcoxon’s matched-pair tests. Kolmogorov-Smirnov tests werden gebruikt om de normaliteit van de gegevens te beoordelen. Asterisken in de figuren wijzen op statistische significantie: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Gegevensanalyse van elektronenmicroscopie van de nervus ischiadicus van de muis

Voor de analyse van elektronenmicrofoto’s van de nervus ischiadicus van de muis werden de aantallen gemyeliniseerde en ongemyeliniseerde vezels geteld in 12 secties per zenuw. De totale aantallen vezels per zenuw werden vervolgens geëxtrapoleerd uit de dwarsdoorsnede van elke zenuw.

Rapportage samenvatting

Meer informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.