Februari 15, 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Eenvoudige stappen voor succesvolle bioluminescentie bij dieren

Luciferine is het basissubstraat van bioluminescentie-analyses. Gebaseerd op een eenvoudige reactie waarbij ATP de luciferase katalyse van firefly (kever) luciferine aanwakkert om licht te produceren, heeft bioluminescentie brede toepassingen. Het gebruik ervan als biomassa-indicator maakt de detectie mogelijk van micro-organismen in consumptiegoederen, oppervlakken van fabrieken, en is zelfs gebruikt om te bepalen of er leven bestaat op de maan en Mars.

Bioluminescentie wordt gebruikt in in vitro en in vivo monitoring van biologische processen, waaronder genexpressie en eiwit-eiwit interacties. Luciferine wordt bijvoorbeeld gebruikt in reporter-gen assays om genregulatie en -functie te bestuderen, waarbij expressie van de luciferine-gemerkte reporter een marker is om succesvolle opname van het gen van belang in recombinant-DNA-technieken aan te geven. Als een detectie reagens, is de luciferine-luciferase reactie gebruikt in pyrosequencing te bereiken snelle detectie van basen in high-throughput DNA sequencing systemen van vandaag.

Meer recent, is bioluminescentie beeldvorming naar voren gekomen als een krachtige techniek voor de directe studie van verschillende celpopulaties in levende kleine dieren zoals muizen. Bij deze techniek worden cellen (b.v. kankercellen, stamcellen, T-cellen) ontworpen om luciferase tot expressie te brengen en op te lichten. Niet-invasieve visualisatie in levende dieren met behulp van een gevoelige charge-couple device camera maakt het dus mogelijk voor real-time observatie van ziekteprogressie en -regressie op verschillende tijdstippen in de loop van de therapeutische behandeling. Gebruikt om de moleculaire basis van pathologieën zoals neurodegeneratieve stoornissen, cardiovasculaire stoornissen, zwaarlijvigheid, en kanker te begrijpen, is deze techniek van immense waarde voor klinische, diagnostische, en geneesmiddelenontwikkeling.

Wetenschappers bij Regis Technologies hebben veel voorkomende zwakheden in luciferase-tests geïdentificeerd. Problemen doen zich vaak voor voordat de assay begint. Firefly luciferine is een gevoelige molecule, en zelfs goed geplande experimenten kunnen foutieve resultaten geven als de luciferine verkeerd wordt behandeld en beschadigd voor gebruik. In dit artikel beschrijven we het optimale zout, de zuiverheid, de behandeling en de opslag van luciferine om succesvolle en consistente resultaten te garanderen bij dierlijke beeldvorming en andere assays.

Aankoopoverwegingen

Onderzoekers vragen zich vaak af welke vorm van luciferine ze moeten gebruiken. De kalium- en natriumzouten van luciferine worden gewoonlijk door elkaar gebruikt. De oplosbaarheid van de molecule is echter een belangrijke factor om in overweging te nemen voor sommige assays. Het natriumzout is beter oplosbaar in water (>100 mg/mL) dan het kaliumzout (55 mg/mL). De vrije zure vorm, hoewel nog steeds beschikbaar, wordt niet vaak gebruikt als gevolg van de moeilijkheid van dissolution.

Omdat een paar onzuiverheden kunnen experimenten beïnvloeden op verschillende manieren, kan de initiële zuiverheid van het reagens een belangrijke overweging.

L-luciferine, een enantiomeer van D-luciferine (figuur 1), is een bekende onzuiverheid in synthetische luciferine. Hoewel aangetoond dat de functie in luciferase reacties, een aanzienlijke verschuiving in de piek lichtemissie is waarschijnlijk optreden, afhankelijk van de gegevens-verzameling parameters gebruikt. L-luciferine wordt gemakkelijk gedetecteerd en gekwantificeerd met chirale HPLC en moet op het analysecertificaat van de fabrikant worden vermeld. De meeste luciferine moet bevatten minder dan 0,5% L-luciferine, hoewel hogere grenzen kan waarschijnlijk worden getolereerd zolang de L-luciferine niveaus constant blijven gedurende het experiment.

Dehydroluciferine (figuur 1) is een onzuiverheid die fungeert als een remmer van luciferase, het onderdrukken van de flits hoogte en de totale integratie. Een monster gedoteerd met 1% dehydroluciferine toont minder dan de helft van de flash hoogte en minder dan 25% van de totale integratie gedurende 15 minuten. Dehydroluciferin kan vormen tijdens de synthese of opslag van luciferin. Het selecteren van een fabrikant die lage dehydroluciferin niveaus levert zal helpen om betrouwbare en herhaalbare results.

Veel gemeenschappelijke sporen onzuiverheden uit de synthese van luciferine kan remmen andere enzymen in complexe systemen en kan leiden tot experimentele variabiliteit als gevolg van batch-to-batch of fabrikant-tot-fabrikant differences.

Figure 1. Structuurvergelijking van D-luciferine en onzuiverheden

Opslag

Fluciferine is gevoelig voor licht, zuurstof en vocht en moet worden beschermd. Licht en zuurstof kunnen de oxidatie van luciferine tot dehydroluciferine katalyseren. In een amberkleurige fles onder stikstof bij kamertemperatuur zal luciferine na een maand beginnen te ontbinden tot dehydroluciferine (figuur 2), maar het is in een ongeopende fles ten minste twee jaar stabiel in een diepvriezer. Opgelost in water met voldoende zuurstof, zal luciferine omzetten in dehydroluciferine in slechts een paar dagen.

Luciferine moet worden gekocht en opgeslagen in de kleinst mogelijke hoeveelheid om afbraak te voorkomen tot dehydroluciferine van meerdere vries-dooi-open cycli. Bij aankoop in bulk, het verdelen van de luciferine reagens in single-use amber flesjes zal helpen zorgen voor stabiliteit. Langdurige opslag als een bevroren oplossing wordt niet aanbevolen voor gevoelige toepassingen, zoals studies op hele dieren. Om de afbraak in bevroren oplossingen te vertragen, moet de oplossing vóór het invriezen met stikstof of argon worden gespoeld.

Figuur 2. Afbraak van luciferine tot dehydroluciferine versus tijd bij 25ºC en -20ºC

Hantering

Bij opening moet de fles met luciferine volledig op kamertemperatuur kunnen komen en vervolgens met stikstof of argon worden gespoeld voordat deze opnieuw wordt gesloten. Als de luciferine oplossingen binnen een paar uur worden gebruikt, zijn weinig voorzorgsmaatregelen nodig. Oplossingen die langer dan een dag worden gebruikt, moeten met stikstof of argon worden gespoeld. Oplossingen die langer dan enkele dagen worden gebruikt, mogen niet worden gebruikt omdat dan dehydroluciferine wordt gevormd.

Scott B. Mohler ([email protected]) is productmanager bij Regis Technologies. Website: www.registech.com.