CASE REPORT

Een 5-jarige jongen werd in december 1994 gediagnosticeerd met acute lymfoblastische leukemie en opgenomen in het Fralle 93-protocol. Het kind bereikte een hematologische remissie 6 weken na het begin van de inductie chemotherapie. Hij werd ambulant behandeld en reageerde goed op de behandeling in de daaropvolgende jaren. Tijdens een consult in maart 1997 had de patiënt echter een koortsaanval toen hij werd doorbloed met het Port-a-cath systeem. Klinisch onderzoek toonde geen septische lokalisatie. Het aantal leukocyten bedroeg 10.860/ml, met een absoluut aantal neutrofielen van 8.850/ml. Eén set bloedkweken werd afgenomen uit de Port-a-cath, en de aërobe fleskweek leverde geel-gepigmenteerde kolonies van gram-positieve coryneform staven op. De jongen kreeg eenmaal ceftriaxon (1 g) intraveneus, gevolgd door cefadroxil 500 mg tweemaal per dag gedurende 7 dagen. Wegens aanhoudende koorts werd nog een week cefadroxil gegeven en in dezelfde periode werden de immunosuppressieve geneesmiddelen gestaakt. De anamnese van de patiënt was de volgende 2 maanden onopvallend, en er werd geen bloedkweek verricht toen hij voor zijn maandelijkse bezoeken kwam. In juni 1997 werd het kind voor consultatie aangeboden als subfebrieel en klagend over vermoeidheid. Bij lichamelijk onderzoek werden geen infectiehaarden gevonden en het aantal leukocyten was niet verhoogd. Een set bloedkweken werd afgenomen van de Port-a-cath, en de aërobe flacon toonde dezelfde gram-positieve coryneform staven, later geïdentificeerd als Microbacterium sp. Katheter-gerelateerde bacteriëmie werd gediagnosticeerd, en de centrale veneuze katheter werd verwijderd. Perioperatief werd ampicilline (100 mg/kg/dag) intraveneus toegediend, waarbij de eerste dosis 24 uur voor de operatie werd toegediend. De klinische toestand van de patiënt verbeterde daarna snel. De Port-a-cath werd gekweekt op Columbia bloed agar. Binnen 24 uur bij 37°C was een zuivere cultuur van geel-gepigmenteerde kolonies van een niet-fermentatieve, gram-positieve, enigszins verkleurde staaf gegroeid. Helaas gingen subculturen verloren en kon geen verder onderzoek worden uitgevoerd.

De stam geïsoleerd uit de bloedkweken van de patiënt, aangeduid met CF36, was een geelgepigmenteerde, beweeglijke coryneform met een oxidatief metabolisme, proteolytische activiteit, en cellulaire vetzuren van het vertakte type. Deze algemene kenmerken wijzen op het geslacht Microbacterium, dat zowel fermentatieve als oxidatieve soorten omvat, de laatste vroeger Aureobacterium genoemd (13).

De sequentie van het 16S rRNA-gen (rDNA) werd bestudeerd door voor de amplificatie één set primers te gebruiken. PCR-producten werden gezuiverd van agarosegel met een QIAquick gel-extractiekit (Qiagen, Westburg, Nederland). De sequentieanalyse werd uitgevoerd met een 3100 automatische DNA-sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.) met behulp van de ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit. Elke sequentie werd met behulp van BLAST (10) vergeleken met de sequentiegegevens die in databanken beschikbaar waren. Een fylogenetische boom werd geconstrueerd met behulp van de neighbor-joining methode (8, 11).

16S rDNA sequencing op basis van 1.490 nucleotiden van stam CF36 toonde de hoogste gelijkenis van 99,5% met de sequentie van M. luteolum DSM 20143T en 99,3% met de sequentie van M. oxydans DSM 20578T. De stam was ook nauw verwant aan de sequenties van M. saperdae (99,2%) en M. liquefaciens (99,1%) (Tabel1).1). Vier andere soortgelijke stammen werden verzameld uit verschillende monsters van andere patiënten. Deze stammen werden aangeduid met CF7 uit een bloedkweek, CF34 uit een bronchiaal aspiraat, CF130 uit een bloedkweek, en CF40 uit een onbekende menselijke bron. Eén extra stam, CF128, werd verkregen uit een plantaardig monster. De vijf stammen vertoonden 16S rDNA-sequenties die leken op die van de typestam van M. oxydans, variërend van 99,3 tot 99,4% gelijkenis, terwijl hun gelijkenis met CF36 99,9 tot 100% was. Negen andere klinische isolaten vertoonden een overeenkomst van 99,9 tot 100% met de type stam van M. oxydans.

Deze resultaten hebben ons ertoe aangezet een uitgebreide studie van de volgende zes stammen uit te voeren: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128, en CF130.

Cellulaire vetzuren, bepaald zoals eerder beschreven (14), vertoonden bij alle stammen hetzelfde profiel. De gemiddelde percentages van de voornaamste cellulaire vetzuren waren als volgt: 40,3% anteiso-C15:0 (bereik, 37,1 tot 46,0%), 27% anteiso-C17:0 (bereik, 22,9 tot 31,3%), 15,7% iso-C16:0 (bereik, 13,8 tot 19,3%), 9,3% iso-C15:0 (bereik, 4,6 tot 13,9%), en 4,2% iso-C17:0 (bereik, 3,0 tot 7,2%).

De analyse van CF36 en CF7 celwandpeptidoglycan werd uitgevoerd in de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Duitsland) door N. Weiss met een dunne-laag chromatografie methode zoals beschreven door Schleifer en Kandler (12). Het peptidoglycan was van het B2β type met d-ornithine als diaminozuur.

DNA-DNA hybridisatie werd uitgevoerd door P. Schumann op het DSMZ zoals beschreven door De Ley et al. (3) met de modificaties van Escara en Hutton (4) en Huss et al. (7). De DNA-homologie van CF36 met M. luteolum LMG 16207T was slechts 33,7%, en die met M. oxydans DSM 20578T was 46,6%, maar hoge niveaus van DNA-verwantschap van 78,1, 81,8, en 78,2% werden verkregen met de stammen CF7, CF34, en CF40, respectievelijk. Dit was consistent met hun toewijzing aan één enkele soort. Het G+C-gehalte van het DNA van stam CF36 was 69,9 mol%, zoals bepaald in het DSMZ.

De zes stammen waren grampositieve, beweeglijke, coryneforme staafjes. Ze groeiden goed op Columbia bloed agar bij 37°C, en de kleur van de kolonies was geel. De stammen waren strikt aëroob, katalase-positief en oxidase-negatief. Ze waren in staat om esculine en gelatine te hydrolyseren. Hoewel 16S rDNA-sequencing nauwe verwantschap aantoonde met M. luteolum, M. saperdae, en M. liquefaciens, waren deze soorten fenotypisch heel verschillend. Geen van hen groeide bij 37°C, M. luteolum en M. liquefaciens waren niet-motiel, en M. luteolum en M. saperdae waren niet-proteolytisch. Deze bevindingen komen overeen met gegevens uit de literatuur (2). De fenotypische eigenschappen van de stammen kwamen het meest overeen met die van M. oxydans. Glucose werd oxidatief aangezuurd op fenolrode agar met een laag peptongehalte (15). Alle stammen groeiden bij 40°C, terwijl geen van de M. oxydans-isolaten in staat was bij die temperatuur te groeien. Bovendien was salicine niet aangezuurd, in tegenstelling tot M. oxydans. De nieuwe stammen konden ook van M. oxydans worden onderscheiden met behulp van API 50CH assimilatiestrips (bioMérieux). Lactose werd wel gebruikt, en 2-ketogluconaat niet, terwijl M. oxydans de tegenovergestelde reacties vertoonde. Wanneer API ZYM strips (bioMérieux) werden gebruikt, zorgden negatieve reacties voor esterase lipase (C8), α-chymotrypsine, en β-glucosidase ervoor dat de zes stammen gescheiden werden van M. oxydans. Fenotypische kenmerken die de nieuwe stammen onderscheiden van verwante oxidatieve, beweeglijke, proteolytische Microbacterium-soorten die bij 37°C groeien, worden gerapporteerd in tabel22.

Antibiotische gevoeligheid werd getest op Mueller-Hinton agar met E-test strips (PDM, Solna, Zweden). De MIC-bereiken (microgram per milliliter) waren als volgt: penicilline, 1,5 tot 2; ampicilline, 1 tot 1,5; cefotaxime, 3 tot 6; cefalothine, 16 tot 24; ciprofloxacine, 1 tot 1,5; gentamicine, 2 tot 3; vancomycine, 3 tot 4; claritromycine, <0,016.

Fenotypische, chemotaxonomische, en genetische studies suggereren dat de zes studiestammen behoren tot het genus Microbacterium, maar een nieuwe soort vormen, waarvoor de naam Microbacterium paraoxydans wordt voorgesteld en die nauw verwant is aan M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum, en M. liquefaciens (Fig.).