Celculturen en RNAi

De Drosophila melanogaster S2 cellijn (uit de collectie van IMG RAS) en Kc167 cellijn (uit het Drosophila Genomics Resource Center) werden gekweekt bij 25 °C in Schneider’s Drosophila Medium (Gibco), aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal bovirus.geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS, Gibco), 50 eenheden/ml penicilline, en 50 µg/ml streptomycine. OSC’s47 vriendelijk ter beschikking gesteld door M. Siomi werden gekweekt in Shields en Sang M3 insect medium (Sigma-Aldrich) aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd FBS (Gibco), 10% vliegenextract (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml insuline (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml glutathion (Sigma-Aldrich), 50 eenheden/ml penicilline, en 50 µg/ml streptomycine. dsRNAs tegen lacZ of lamin Dm0 voor RNAi behandeling van S2 cellen werden bereid zoals eerder beschreven 11. dsRNAs tegen LBR werden bereid op dezelfde wijze met behulp van de Drosophila genoom DNA als een sjabloon voor PCR amplificatie en primers die in de aanvullende tabel 1. Behandeling van cellen met dsRNA werd uitgevoerd gedurende vier dagen met behulp van een eerder beschreven protocol48.

Western-blot analyse

Eiwitten werden geëxtraheerd met 8 M ureum, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 1% SDS, gefractioneerd door SDS-PAGE (12% acrylamide gel) en overgebracht naar een PVDF-membraan (Immobilon-P, Millipore). Blots werden ontwikkeld met alkalische fosfatase-geconjugeerde secundaire antilichamen (Sigma) en het Immun-Star AP-detectiesysteem (Bio-Rad). De volgende antilichamen werden gebruikt voor de detectie: murine monoklonale anti-lamin Dm0 (1:2000; ADL6749), konijn polyklonale anti-lamin C25 (1:10000), murine monoklonale anti-beta Actin (1:3000; ab8224, Abcam).

Chromatine visualisatie door histon H4 of DAPI kleuring

Lam-KD, LBR-KD of controle S2 cellen werden uitgezaaid op dekglaasjes gedurende 30 minuten. Na spoelen met PBS, werden cellen gefixeerd in 100% methanol gedurende 5 min bij kamertemperatuur (voor verder onderzoek van de chromatine distributie op basis van de immunokleuring van histon H4) of in 4% formaldehyde in PBS gedurende 25 min bij kamertemperatuur (voor verdere schatting van chromatine volume op basis van DAPI kleuring), gespoeld met PBS drie keer, geblokkeerd met PBTX (PBS met 0,1% Tween-20 en 0,3% Triton X-100) met 3% normaal geitenserum (Invitrogen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De resterende immunokleuring procedure werd uitgevoerd zoals eerder beschreven50. Als primaire antilichamen gebruikten we murine monoklonale anti-histon H4 (1:200; ab31830, Abcam), cavia polyklonale anti-LBR26 (1:1000), konijn polyklonale anti-lamin Dm051 (1:500). Als secundaire antilichamen gebruikten we Alexa Fluor 546-geconjugeerd geit anti-rabbit IgG (Invitrogen) of Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-muis IgG (Invitrogen), of Alexa Fluor 633-geconjugeerd geit anti-guinea pig IgG (Invitrogen).

ImageJ kwantificering van chromatine distributie

Uiting ImageJ, hebben we gemeten histon H4, LBR en lamin Dm0 profielen over de kern diameter van de equatoriale brandpuntsvlak van kernen van Lam-KD, LBR-KD of controle S2 cellen. Fluorescentie intensiteiten werden geëxtraheerd, werden individuele profielen eerst genormaliseerd op de gemiddelde intensiteit, dan op de diameter van de kern (begrensd door pieken van LBR fluorescentie voor Lam-KD, of door pieken van lamin Dm0 fluorescentie voor LBR-KD) en verder uitgelijnd om het gemiddelde profiel te bepalen. Nuclei van 2-3 onafhankelijke experimenten (60 kernen per experiment) werden geanalyseerd.

Raming van het volume van DAPI-gekleurde chromatine

Confocale beelden met 20-30 DAPI-gekleurde formaldehyde-vaste Lam-KD of controle S2 cellen werden verwerkt en geanalyseerd met dezelfde parameters met behulp van IMARIS 7.4.2 software (Bitplane AG). Alleen kernen met de laagste resterende lamin Dm0 kleuring werden gebruikt voor analyse in Lam-KD cellen, terwijl in controle cellen, omgekeerd, de kernen met een slechte lamin Dm0 kleuring werden niet genomen voor analyse. Voor achtergrondaftrekking, werden beelden gedrempeld tot ~ 15% van de maximale intensiteit van het kanaal, zodat de gegenereerde nucleaire oppervlakken niet zou uitbreiden buiten de piek van LBR fluorescentie-intensiteit. Met deze parameters, de oppervlakken van kernen, geschikt voor analyse, werden automatisch gereconstrueerd. Ten slotte werden de volumes van ~ 100 gereconstrueerd kernen opgehaald uit de Statistieken tab voor de analyse.

Twee-kleuren FISH

~ 20-kb FISH probes werden gegenereerd met behulp van een lange-afstand PCR-kit (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) door PCR-amplificatie van 4 tegels genoomfragmenten die ofwel de regio 2 L:16964000-16982000 of 2 L:17310000-17328000, met het gebruik van primerparen die in de aanvullende tabel 1. 1 µg template DNA voor hybridisatie werd gelabeld door random primed synthese met de DIG DNA labeling kit (Roche) of door ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Probes werden verder gecombineerd en gehybridiseerd met S2 cellen zoals eerder beschreven23. Voor NL of FISH probe detectie, als de primaire antilichamen gebruikten we cavia polyklonale anti-LBR26 (1:1000), of konijn polyklonale anti-lamin Dm051 (1:500) en schaap polyklonale anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Als secundaire antilichamen gebruikten we Alexa Fluor 633-geconjugeerd geit anti-guinea pig IgG (Invitrogen), of Alexa Fluor 546-geconjugeerd geit anti-rabbit IgG (Invitrogen) en Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-FITC IgG (Invitrogen).

Meting van de afstanden tussen FISH probes en de NE

Driedimensionale beeldstapels werden opgenomen met een confocale LSM 510 Meta laser scanning microscoop (Zeiss). Optische doorsneden met 0,4μm intervallen langs de Z-as werden vastgelegd. Beelden werden verwerkt en geanalyseerd met behulp van IMARIS 7.4.2 software (Bitplane AG) met de blinde experimentele opstelling. Afstanden tussen beide sondes of tussen de sondes en de NE werden geteld zoals eerder beschreven23. Kort gezegd, waren we niet in staat om volledig automatisch reconstrueren van de oppervlakken van kernen op basis van hun LBR of lamin Dm0 immunokleuring. Daarom werd de nucleaire rand van een bepaalde kern handmatig omlijnd in alle optische delen van de stapel door het midden van de LBR of lamin Dm0 kleuring om verder te reconstrueren het oppervlak van deze kern automatisch. Om de afstand tussen de FISH-signalen en de NE te bepalen, werd het instrument “meetpunt” geplaatst op de helderste voxel van de FISH-sonde en een ander “meetpunt” werd geplaatst op het gereconstrueerde kernoppervlak op het punt van de vroegste kruising met een progressief groeiende bol van het eerste “meetpunt”. De afstand tussen twee “meetpunten” (d.w.z. de kortste afstand tussen het middelpunt van de FISH-sonde en het midden van de NE) werd voor elke kern gemeten. De afstanden tussen twee FISH-probes werden op overeenkomstige wijze gemeten. De gegevens werden verkregen in twee onafhankelijke experimenten voor 75-100 kernen per experiment. Parallel daaraan werden volumes van kernen bepaald, en werden de stralen van kernen berekend, waarbij kernen als bolvormig werden beschouwd. Ten slotte werden afstanden genormaliseerd naar de nucleaire radii.

Analyse van genexpressie

Totaal RNA werd geïsoleerd uit Lam-KD of controle S2 cellen met Trizol reagens (Invitrogen), en verontreinigende DNA werd verwijderd door DNase I behandeling. RNA kwaliteit werd beoordeeld met behulp van capillaire elektroforese met een Bioanalyzer 2100 (Agilent). Poly (A) + RNA werd geëxtraheerd uit totaal RNA met oligo (dT) magnetische kralen (Thermo Fisher Scientific). NEBNext Ultra II RNA bibliotheek voorbereiding kit (New England Biolabs) werd gebruikt voor de bereiding van bibliotheken volgens de instructies van de fabrikant. Bibliotheken van twee biologische replicaten van Lam-KD of controle S2 cellen werden gekwantificeerd met behulp van een Qubit fluorometer en kwantitatieve PCR, en gesequeneerd op de Illumina NextSeq resulterend in 8,4-9,4 × 106 80-nt single-end leest. Leest werden in kaart gebracht om de D. melanogaster referentie-genoom (versie dm3) met behulp van HISAT52 v2.1.0 met optie -max-intronlen 50.000. Lezingen met een lage mapping kwaliteit werden verwijderd met behulp van SAMtools53 met optie -q 30. We berekenden log2 transcriptieniveaus in 20-kb genomische bins met BEDtools54 v2.16.2 met optie -split, en pasten vervolgens de hclust functie in R toe om de replicaten te clusteren met behulp van 1-Spearman’s correlatiecoëfficiënt als afstandsmetriek. De genexpressie werd gekwantificeerd met StringTie52 voor de referentie-annotatie versie r5.12. We hebben genen met nul expressie in meer dan twee replicaten uitgefilterd. Van de resterende 10.076 genen werden de differentieel tot expressie komende genen gedefinieerd met behulp van het edgeR55 pakket met getrimd gemiddelde van M waarden (TMM) normalisatie bij FDR = 0,05 cutoff. Genen werden toegewezen aan de LAD’s als hun TSS’s zich binnen de LAD’s bevonden, terwijl genen werden toegewezen aan de inter-LAD’s als hun TSS’s ten minste 1-kb van de LAD’s verwijderd waren. Een pseudocount werd toegevoegd aan alle expressie waarden om zich te ontdoen van nullen. De pseudocount werd berekend als de minimale waarde in de genexpressietabel na normalisatie. Vervolgens hebben we het gemiddelde genomen van de replicaten en log2(FC) waarden berekend tussen Lam-KD en controle monsters.

Real-time RT-qPCR assay voor de willekeurig geselecteerde genen van verschillende LADs werd uitgevoerd op cDNAs gesynthetiseerd met oligo(dT) primers op het poly(A)+ RNA geïsoleerd uit 3 biologische replicaten van Lam-KD of controle S2 cellen, met behulp van EvaGreen chemie (Jena Bioscience) en de CFX96 hardware (BioRad). De expressieniveaus van de genen werden genormaliseerd op de act5C-genexpressie. Voor semi-kwantitatieve RT-PCR, toegepast voor de analyse van genen van de 60D LAD, werd de reverse transcriptie van RNA uitgevoerd met SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen) in aanwezigheid van hexamer random primers. PCR amplificatie van cDNA’s werd uitgevoerd met toevoeging van 33P-dATP. Probes na PCR werden gescheiden in 5% PAAG, dat vervolgens werd gefixeerd, gedroogd en blootgesteld aan het opslagfosforscherm (Amersham Biosciences). De signalen werden gescand met een Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Voor elk primerpaar werd het aantal PCR-cycli geoptimaliseerd voor de exponentiële fase van de amplificatie, die werd gecontroleerd door een tweevoudige cDNA-verdunning. De expressieniveaus van de genen werden genormaliseerd naar de alomtegenwoordige expressie van het CG4589-gen. Sequenties van gen-specifieke primers worden gepresenteerd in de Supplementary Table 1.

ChIP-seq procedure en data-analyse

ChIP-seq van twee biologische replicaten van controle en Lam-KD S2-cellen met anti-H3-pan geacetyleerde antilichamen (Active Motif, #39139) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven56, met enkele wijzigingen. Na het spoelen met PBS, ~ 2 × 107 cellen werden gefixeerd met 1,8% formaldehyde in PBS met 0,5 mM DTT gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Verknoping werd gestopt door toevoeging van glycine tot 225 mM gedurende 5 min en wassen in PBS met 0,5 mM DTT driemaal gedurende 5 min. De cellen werden eenmaal gewassen in de A2-buffer (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,5 mM DTT, complete EDTA-vrije protease inhibitor cocktail (Roche)). De cellen werden gedurende 10 min bij kamertemperatuur in de A2-buffer met 1% SDS gelyseerd, waarna het lysaat 20-voudig met de A2-buffer werd verdund en gedurende 2 min bij 4 °C werd geïncubeerd. Na sonicatie met VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulsen van 10 sec met 10-seconden intervallen bij 15% maximaal vermogen) en 10-min high-speed centrifugatie, werd de gefragmenteerde chromatine (met de gemiddelde DNA-fragmentgrootte ~ 0,5 kb) teruggevonden in het supernatant. Voor elke immunoprecipitatie, ~ 10 ug van chromatine (~ 700 µl) werd pre-geïncubeerd in aanwezigheid van 100 ul van Protein A-Sepharose (PAS, 50% w / v, GE Healthcare) gedurende 1 uur bij 4 ° C. PAS werd verwijderd door centrifugatie, 5% van chromatine werd geïsoleerd als een “Input” materiaal, waarna 2 µl anti-H3-pan geacetyleerde antilichamen (Active Motif, #39139) werden toegevoegd aan de rest chromatine en monsters werden geïncubeerd overnacht bij 4 ° C in een roterende wiel. Vervolgens werd 100 μl PAS toegevoegd en de incubatie werd gedurende 4 uur bij 4 °C voortgezet. De monsters werden gecentrifugeerd bij maximale snelheid gedurende 1 min en het supernatant werd weggegooid. De monsters werden viermaal gewassen in de A2-buffer met 0,05% SDS en tweemaal in 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT-buffer (elke wasbeurt gedurende 5 min. bij 4 °C). Chromatine werd geëlueerd uit PAS in 100 pi 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8) bij 65 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door centrifugatie en recuperatie van het supernatant. PAS materiaal werd opnieuw geëxtraheerd in 150 ul van TE, 0,67% SDS. Om cross-links om te keren, werd het gecombineerde eluaat (250 pi) geïncubeerd 6 uur bij 65 ° C en behandeld met Proteinase K gedurende 3 uur bij 50 ° C. De monsters werden met fenol-chloroform geëxtraheerd en met isopropanol geprecipiteerd in aanwezigheid van 20 μg glycogeen. DNA werd opgelost in 100 pi water. ChIP monsters met ~ 25 ng neergeslagen DNA, evenals “Input” monsters werden bereid voor next-generation sequencing met behulp van een NEBNext Ultra II DNA-bibliotheek prep kit voor Illumina (New England Biolabs). De bibliotheken werden gesequeneerd op de Illumina HiSeq 2000, wat resulteerde in 3,1-3,4 × 106 75-bp single-end reads. Leest werden in kaart gebracht om de D. melanogaster referentie-genoom (versie dm3) met behulp van Bowtie 2 v2.2.1 (met de -zeer-gevoelige optie)57. Lezingen met een lage mapping kwaliteit werden verwijderd met behulp van SAMtools53 met optie -q 30. Duplicate reads werden verwijderd met SAMtools rmdup. We berekenden log2 ChIP en input signalen in 1-kb genomische bins met BEDtools54 v2.16.2, en pasten vervolgens de hclust functie in R toe om de replicaten te clusteren met behulp van 1-Spearman’s correlatie coëfficiënt als een afstand metriek. Lezingen werden toegewezen aan LADs als ze LADs overlapten, terwijl lezingen werden toegewezen aan inter-LADs als ze ten minste 1-kb verwijderd waren van LADs. We berekenden leesaantallen binnen elke LAD en inter-LAD, normaliseerden de waarden voor de som van leesdekking per replicaat, sloten zero-bedekte LAD’s en inter-LAD’s uit van verdere analyse, berekenden het gemiddelde van de replicaten, en berekenden log2(FC) waarden tussen Lam-KD en controle ChIP monsters.

Hi-C procedure en data-analyse

Hi-C bibliotheken van twee onafhankelijke biologische replicaten van controle en Lam-KD S2-cellen werden in wezen bereid zoals eerder beschreven36 met behulp van de HindIII-HF restrictie-enzym (NEB). Bibliotheken werden gesequenced op de Illumina HiSeq 2000 platform wat resulteert in 3-4 × 107 gepaarde-end leest. Leest werden in kaart gebracht om de D. melanogaster referentie-genoom (versie dm3) met behulp van Bowtie 2 v2.2.1 (met de -zeer-gevoelige optie)57. De Hi-C gegevens werden verwerkt met behulp van de ICE pijplijn v0.9 (20 iteraties van iteratieve correctie) zoals beschreven58. Hi-C interactiekaarten met 20-kb resolutie werden verkregen. TADs werden voorspeld met behulp van de Armatus software59 v1.0, waarin de gemiddelde grootte en het aantal TADs wordt bepaald door de schalingsparameter γ. TAD annotatie werd uitgevoerd in twee stappen zoals beschreven36. Eerst hebben we handmatig parameter γ geselecteerd om een goede verdeling van TADs te bereiken (γ = 1,20 voor Lam-KD cellen en γ = 1,12 voor controle cellen). Vervolgens werden TADs groter dan 600 kb opgesplitst in kleinere TADs met de schaalparameter γ vermenigvuldigd met 2. Daarna werden de kleinste TADs (gelijk aan of kleiner dan 60 kb) geannoteerd als inter-TADs omwille van hun slecht opgeloste interne structuur. Het resultaat was dat 576 (in controle) en 588 (in Lam-KD) TADs werden onthuld. Om na te gaan of de TAD-posities bij Lam-KD veranderd zijn, analyseerden we de mate van overlap van elke TAD in de samengevoegde replicaten van controle- en Lam-KD-cellen met die in de controle-replicaten of in de Lam-KD-replicaten en vonden geen statistisch significant verschil (P > 0,05 in een tweezijdige Wilcoxon-test). ACF binnen elke TAD werd berekend als een gemiddelde waarde van iteratief gecorrigeerde leesaantallen tussen alle genomische bins die tot de TAD behoren, met uitsluiting van grensbins aan beide zijden van de TAD. ACF binnen elke inter-TAD werd berekend als een gemiddelde waarde van iteratief gecorrigeerde leesgetallen tussen alle genomische bins die tot de inter-TAD behoren en de grens bins van aangrenzende TADs. Voor elk TAD werd de verhouding berekend tussen de ACF-waarde in elk Lam-KD-replicaat en de ACF-waarde in elk controlereplicaat (vier verhoudingen in totaal). TAD’s met ten minste drie ratio’s van hetzelfde teken werden gebruikt voor de downstream analyse. We merken op dat wanneer we TADs geselecteerd volgens een strenger criterium (dat wil zeggen alle vier ratio’s werden veranderd in dezelfde richting), had dit geen invloed op de resultaten van de analyse (Supplementary Fig. 6). Chromatine compartimenten werden geannoteerd met behulp van de principale component analyse zoals beschreven17. Zadel plots werden gegenereerd zoals beschreven58. Kort gezegd, gebruikten we de waargenomen / verwachte Hi-C kaarten, die we berekend uit 20-kb iteratief gecorrigeerd interactie kaarten van cis-interacties door het delen van elke diagonaal van een matrix door zijn chromosoom-brede gemiddelde waarde. In elke waargenomen / verwachte kaart, herschikten we de rijen en de kolommen in de volgorde van toenemende PC1 waarden (die we berekend voor de controle matrices). Ten slotte hebben we geaggregeerd de rijen en de kolommen van de resulterende matrix in 20 even grote geaggregeerde bins, waardoor een zadel plot van compartimentalisatie.

Analyse van gepubliceerde gegevens

We gebruikt chromatine type annotatie voor S2 cellen40. Verhoudingen van chromatine soorten in 20-kb bins werden berekend. Annotatie van LADs werd verkregen uit ref. 28. We berekenden het aandeel van de LAD lengte in elke 20-kb TAD bin.

Polymer modellering

We gebruikten Dissipative Particle Dynamics (DPD) om computersimulaties uit te voeren, zoals eerder beschreven36 met enkele wijzigingen. Kort gezegd, macromoleculen worden vertegenwoordigd in termen van de kraal-en-veer-model, met de deeltjes op elkaar inwerken door een conservatieve kracht (afstoting), een dissipatieve kracht (wrijving), en een willekeurige kracht (warmte generator). Een gedetailleerde beschrijving van de toepassing van deze techniek is eerder gegeven60. Het gesimuleerde celvolume was 50 × 50 × 50 DPD-eenheden, de dichtheid is gelijk aan 3, zodat het totale aantal deeltjes in het systeem 375.000 bedraagt. We nemen aan dat een deeltje overeenkomt met een nucleosoom. Bovendien introduceren we speciale randvoorwaarden, die periodiek zijn voor het oplosmiddel en ondoorlatend voor andere deeltjes. Het oppervlak bestaat uit onbeweeglijke, zeshoekig gepositioneerde deeltjes. In onze simulaties bootsen de deeltjes ofwel “actieve” of “inactieve” nucleosoomtypes na, terwijl het oppervlak het NL nabootst. “Inactieve” deeltjes kunnen omkeerbare “verzadigende” bindingen creëren61,62 zowel met elkaar als met de deeltjes van een oppervlak. Elk “inactief” deeltje kan slechts één extra binding per moment hebben, wat een interactie simuleert van een positief geladen histonstaart van niet-geacetyleerd nucleosoom met de “zure patch” van een ander nucleosoom42,43,63. Onze copolymeerketen wordt voorgesteld door 64 blokken die elk bestaan uit 500 “inactieve” en 50 “actieve” deeltjes. De kans op het ontstaan van een associatie tussen twee “inactieve” deeltjes werd op 0.001 gesteld, tussen het “inactieve” deeltje en het oppervlak – 0.007, terwijl de kans op het verbreken van een dergelijke associatie op 0.01 werd gesteld. Tijdens de simulaties werden alle deeltjes elke 200 DPD stappen gecontroleerd, wanneer de lokale evenwichten waren verkregen. We hebben 10 onafhankelijke runs uitgevoerd op de MSU supercomputer “Lomonosov-2”, gebruikmakend van onze eigen implementatie van de domeindecompositie-geparallelliseerde DPD-code, die beschikbaar is op GitHub.

Statistische analyse

We pasten de Wilcoxon-test toe om na te gaan of de verdeling van log2(FC)-waarden symmetrisch was rond nul, evenals om te testen of twee verdelingen van log2(FC)-waarden verschilden door een locatieverschuiving van nul.

Reporting Summary

Meer informatie over de experimentele opzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.