Synoniemen

Niet-veresterde vetzuren (NEFA), vrije vetzuren, onverzadigde vetzuren

Fysiologie

Niet-veresterde (“vrije” of onverzadigde) vetzuren (NEFA’s) zijn het hoofdbestanddeel van triglyceriden (de vetreserves in het lichaam), die bestaan uit drie vetzuren gekoppeld aan een glycerolruggengraat. Bij gezonde dieren (wanneer zij eten of zich niet in een energietekort bevinden) zijn de NEFA’s voornamelijk afkomstig van de afbraak van triglyceriden die via chylomicronen in de voeding zijn opgenomen (lipoproteïnelipase maakt de NEFA’s vrij uit chylomicronresten). Onder nuchtere omstandigheden of in een toestand van negatieve energiebalans is hydrolyse van de vetreserves in het lichaam echter de belangrijkste bron van NEFA.

Hydrolyse van opgeslagen triglyceriden (vet) in vetweefsel door hormoongevoelige lipase maakt NEFA’s en glycerol vrij. Hormoongevoelig lipase (dat zich in het cytosol van adipocyten bevindt) wordt gestimuleerd door verschillende hormonen, waaronder glucagon (dat vrijkomt uit α-cellen in pancreaseilandjes als reactie op lage glucose) en corticosteroïden. Eenmaal vrijgemaakt uit vet of chylomironen, kunnen NEFA’s worden gebruikt als energiebron door vele weefsels, waaronder skeletspieren en hepatocyten. In hepatocyten verschilt hun lot, afhankelijk van de energiebehoefte, de hormoonbalans en de beschikbaarheid van substraten, d.w.z. zij kunnen worden gebruikt voor energieproductie (via de cyclus van Kreb), opnieuw worden verpakt in triglyceriden en geëxporteerd als lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL) of binnen de lever worden opgeslagen als triglyceriden (die bij overmaat hepatische lipidose kunnen veroorzaken) of worden omgezet in ketonen.

Methodologie

De primaire methode voor het meten van de concentratie van NEFA’s in serum is een colorimetrische enzymatische methode, de methode die aan de Cornell University wordt gebruikt.

Reactietype

Blanked end-point reaction. Blanking vermindert het effect van hemolyse op NEFA-concentraties.

Procedure gebruikt aan de Cornell University

In de eerste stap van deze drietrapreactie katalyseert acyl-CoA synthetase (ACS) de acylering van NEFA’s tot (co-enzym A) CoA, wat resulteert in de vorming van acyl-CoA. Waterstofperoxide wordt vervolgens gegenereerd uit de oxidatie van acyl-CoA door de katalytische werking van acyl-CoA oxidase (ACOD). Tenslotte zorgt waterstofperoxide in aanwezigheid van peroxidase (POD) voor de oxidatieve condensatie van 4-aminoantipyrine met 3-methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-aniline (MEHA), waarbij een blauwpaars eindproduct wordt gevormd met een absorptiemaximum bij 550 nm. De NEFA-concentratie is recht evenredig met de gemeten optische dichtheid van het kleurstofproduct.

Reacties worden hieronder weergegeven:

NEFA+ ATP + CoA acyl-CoA synthesase > Acyl-CoA + AMP + pyrofosfaat

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidase > 2,3-trans-Enoyl-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrine + MEHA-peroxidase >blauwpaars complex+ 3H2O

Meeteenheden

De concentratie van NEFA’s wordt gemeten in mEq/L (conventionele eenheden) of mmol/L (SI-eenheden). De eenheid wordt omgerekend aan de hand van de volgende formule:

mEq/L x 1= mmol/L

Bemonsteringsoverwegingen

Soort monster

Serum of EDTA plasma. Serum/plasma moet zo spoedig mogelijk na de afname van de cellen worden gescheiden en het serum/plasma moet in een apart buisje worden gedaan. Ook worden corvac-buisjes (serum-separator) niet aanbevolen, omdat de waarden in deze buisjes iets (maar aanzienlijk) hoger zijn dan in niet-anticoagulante (red top) buisjes.

Anticoagulant

EDTA. Waarden zijn minder stabiel in heparine, dat ook hogere uitgangsconcentraties oplevert dan EDTA of serum en NEFA-waarden stijgen met opslag (Stokol en Nydam 2005).

Stabiliteit

Stabiel in runderserum of EDTA-plasma bij 4°C gedurende 72 uur. Stabiel ingevroren in runderserum gedurende 1 maand (-70°C). Waarden stijgen binnen 24-48 uur na opslag bij 24°C in serum of EDTA-plasma. NEFA-concentraties stijgen snel in heparine na opslag. (Stokol en Nydam 2005).

Aanbevelingen voor monsterafname bij overgangskoeien

• Anticoagulans: Rode top (serum) of paarse top (EDTA). Vermijd heparine (groene top) en corvac (serum separator) buisjes.
• Hantering: Z.s.m. scheiden van de cellen, koel bewaren om valse veranderingen in de resultaten te minimaliseren (NEFA’s zijn bijzonder instabiel), z.s.m. naar het laboratorium zenden.
• Tijdstip van afname: Koeien bemonsteren wanneer zij in de voederboxen komen (zie hieronder).
  • Prepartum-NEA’s: Verzamel monsters van koeien 2-14 dagen voor het afkalven.
  • Postpartum NEFAs: Verzamel monsters van koeien die 3-14 dagen in melk zijn. De meting van zowel postpartum-Nefta’s als BHB wordt uitgevoerd in een overgangsenergieprofiel voor de beoordeling van de energiestatus bij lacterende koeien in het laboratorium voor klinische pathologie van de Cornell University.
• Aantal koeien: Per beslag moeten minimaal 12 dieren worden bemonsterd voor tests op beslagniveau (testbeschrijving in het gedeelte testinterpretatie hieronder). Dit kan een mengsel zijn van vaarzen en >2 pariteitskoeien.
• Gepoolde monsters: Het samenvoegen van individuele monsters van koeien om de energiestatus van een kudde te beoordelen, wordt NIET aanbevolen. Studies aan de Cornell University hebben aangetoond dat resultaten van gepoolde monsters minder gevoelig zijn dan individuele koe-tests (minimaal 12 dieren per kudde) bij gebruik van prepartum of postpartum NEFA voor de detectie van een overmatige negatieve energiebalans bij melkkoeien in de overgang.

Interferenties

• Lipemie, icterus: Onbekend effect (zeldzaam bij runderen).
• Hemolyse: Afhankelijk van de door het laboratorium gebruikte methode, zal hemolyse de NEFA-waarden verlagen of verhogen. Bij de blanco methode die aan de Cornell University wordt gebruikt, zal ernstige hemolyse (hemolytische index > 800 eenheden) de NEFA-concentratie in runderbloed licht doen dalen. Lipemische en icterische interfererende stoffen hebben geen substantiële invloed op de NEFA-concentratie met de methoden die worden gebruikt door de Cornell University.
• Excitement/exercitie/stress: Deze omstandigheden, die het vrijkomen van catecholamine of ACTH induceren, verhogen de NEFA-concentraties door stimulering van lipolyse via hormoongevoelige lipase. Deze omstandigheden moeten tot een minimum worden beperkt bij het verzamelen van bloedmonsters voor NEFA-meting.
• Timing van monsterafname: De NEFA-waarden zullen waarschijnlijk hoger zijn bij koeien die binnenkomen voor dagelijkse voedering (waarschijnlijk in een zekere mate van negatieve energiebalans) dan bij koeien die net gevoerd zijn (de lipolyse zal bij deze laatste koeien geremd zijn). Verzameling vlak voor het voederen wordt aanbevolen.

Testinterpretatie

NNEFA-tests worden meestal gedaan bij melkvee om te bepalen of de kudde in een buitensporige negatieve energiebalans verkeert. De test wordt meer gebruikt op kuddeniveau dan op individueel dierniveau en de resultaten worden geïnterpreteerd aan de hand van een afkapconcentratie of het percentage dieren met waarden boven de afkapgrens versus waarden boven de bovenste referentielimiet. Het NEFA kan bij elke andere diersoort worden gemeten als een marker van een buitensporige negatieve energiebalans. Dit wordt het vaakst gedaan bij kameelachtigen (die onder deze omstandigheden leverlipidose ontwikkelen), andere herkauwers (bv. geiten, schapen) om te bepalen of zij risico lopen op ketose, en paarden (bij het metabool syndroom van paarden). Merk op dat concentraties onder de referentielimiet niet klinisch relevant zijn.

Verhoogde concentraties

• Fysiologisch: Oefening induceert het vrijkomen van catecholamines en ACTH, dat de hydrolytische activiteit van hormoongevoelige lipase stimuleert om de vetmobilisatie te bevorderen om aan de overtollige energiebehoefte te voldoen. Dit proces verhoogt de concentratie van NEFA’s in het bloed.
• Rasverschillen: Verschillende studies hebben aangetoond dat NEFA’s lager zijn bij Jersey-koeien post-partum versus Holstein-koeien, vandaar dat richtlijnen ontwikkeld voor Holstein-koeien (zie hieronder) mogelijk niet van toepassing zijn op Jerseys (Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012).
• Negatieve energiebalans bij melkkoeien: Melkkoeien in de periparturiënte (overgangs)periode verkeren altijd in een toestand van negatieve energiebalans als gevolg van de hoge energiebehoefte van de zich ontwikkelende foetus en de melkproductie (vooral met de nadruk op selectie op hoge melkproducenten). Deze toestand van negatieve energiebalans kan echter buitensporig zijn en de getroffen koeien lopen in de vroege postpartumperiode het risico op gastro-intestinale (verschoven lebmaag), metabole (klinische ketose) en infectieuze (bv. metritis) ziekten. Daarom controleren melkveeartsen hun veestapel vaak op een te hoge negatieve energiebalans door NEFA-tests uit te voeren, hetzij alleen bij pre- of postpartumkoeien, hetzij als onderdeel van een metabool profiel bij postpartumkoeien. De resultaten van deze tests kunnen worden geïnterpreteerd op het niveau van de individuele koe (d.w.z. een NEFA-waarde boven een bepaalde drempelwaarde wijst op een overmatige negatieve energiebalans) of op het niveau van de kudde (d.w.z. een deel van de geteste koeien heeft een NEFA-waarde boven een bepaalde drempelwaarde). Vaststelling van een overmatige negatieve energiebalans bij individuele koeien (en belangrijker nog) in de kudde duidt op de noodzaak van veranderingen in de voeding (bv. vergroting van de bunkervoedingsruimte, verhoging van de energiedichtheid van het rantsoen) en het management van de overgangskoe om de energiebehoefte en de stress bij de overgangskoe te verminderen. De volgende interpretatierichtlijnen zijn gebaseerd op studies aan de Cornell University en gelden voor monsters van met TMR gevoede Holsteinkoeien die een risico vormen, tussen 2-14 dagen voor het werpen (prepartum NEFAs) of 3-14 dagen na het werpen (postpartum NEFAs). Wij raden aan ten minste 12 “risicokoeien” te bemonsteren bij de evaluatie van totaal gemengd rantsoen (TMR)-gevoede beslagen op subklinische ketose (Ospina et al 2013).
  • Testen op koe-niveau
    • Prepartum NEFAs: Er is een verhoogde incidentie van postkalvende ziekten (verplaatste lebmaag, metritis/vastgehouden placenta en klinische ketose), verminderde melkgift en verminderde reproductieve prestaties in de eerste 30 dagen in melk bij Holstein melkkoeien (gevoed met TMR) met NEFA-waarden > 0,30 mEq/L wanneer getest 2-14 dagen voor het afkalven.
    • Postpartum NEFA’s: Er is een verhoogde incidentie van postkalvende ziekten (verschoven lebmaag, metritis/vastgehouden placenta en klinische ketose), verminderde melkgift en verminderde reproductieve prestaties in de eerste 30 dagen in melk bij Holstein melkkoeien (gevoed met TMR) met NEFA-waarden > 0,60-0,70 mEq/L wanneer getest 3-14 dagen na afkalven. In de Cornell-studies waren de NEFA’s na het afkalven zelfs een betere voorspeller dan de β-hydroxybutyraatconcentraties na het afkalven of de NEFA’s vóór het afkalven.
  • Testen op kuddeniveau
    • Prepartum NEFA’s: Op kuddeniveau is er een significant verhoogd risico op stofwisselings- en infectieziekten na het kalven, een verminderde melkproductie of verminderde reproductieve prestaties indien >15% van de geteste koeien vóór het kalven een NEFA-waarde > 0,30 mEq/L heeft. Merk op dat, zoals hierboven aangegeven, het samenvoegen van monsters van individuele koeien niet wordt aanbevolen voor tests op kuddeniveau.
    • Postpartum NEFA’s: Op het niveau van het beslag is er een significant verhoogd risico op stofwisselings- en infectieziekten na het kalven, een verminderde melkproductie of verminderde reproductieve prestaties als >15-20% van de geteste koeien na het kalven NEFA-waarden > 0,70 mEq/L hebben. Merk op dat, zoals hierboven aangegeven, het samenvoegen van monsters van individuele koeien niet wordt aanbevolen voor tests op kuddeniveau.
• Leverlipidose bij melkvee: In één studie had een NEFA:cholesterol-verhouding >0,2 (SI-eenheden) een odds ratio van 9,9 voor een dier met leverlipidose (gedefinieerd als >10% lipidegehalte in de lever), waarbij deze cut-off gevoeliger was (63% met 85% specificiteit) dan BHB, NEFA alleen of AST-activiteit (>120 U/L) voor de diagnose van leverlipidose (op basis van oppervlakte onder de receiver operating characteristic curve of AUC). Bij de dieren in deze studie werden echter bloedmetingen verricht op verschillende tijdstippen na de lactatie (Mostafavi et al 2013).
• Negatieve energiebalans bij kleine dieren: Dit komt vooral voor bij diabetes mellitus. In een toestand van insulinetekort of insulineresistentie gaat de remming van hormoongevoelig lipase verloren. Een onevenwichtige regulering van de hormoongevoelige lipase-activiteit verhoogt de vetmobilisatie van vetweefsel naar leverweefsel, waardoor de concentratie van NEFA’s stijgt.
• Negatieve energiebalans bij kameelachtigen: Zieke, gestreste kameelachtigen, vooral drachtige wijfjes, lopen het risico leverlipidose te ontwikkelen. Meting van het NEFA kan worden gedaan om te bepalen of zij in een negatieve energiebalans verkeren. Kameelachtigen met een NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist et al 2001) lopen een verhoogd risico op lipidose. Anorexische kamelen hebben vaak een NEFA dat verhoogd is, maar lager dan deze waarde, en zij ontwikkelen mogelijk geen lipidose.