Morpholino oligos zijn geavanceerde hulpmiddelen voor het blokkeren van plaatsen op RNA om cellulaire processen te hinderen. Een Morpholino oligo bindt specifiek aan zijn geselecteerde doelplaats om de toegang van celcomponenten tot die doelplaats te blokkeren. Deze eigenschap kan worden benut om translatie te blokkeren, splicing te blokkeren, miRNA’s of hun doelen te blokkeren, en ribozymactiviteit te blokkeren.
Translatieblokkering: Door het sterisch blokkeren van het translatie-initiatiecomplex kunnen Morpholinos de expressie van veel doelsequenties volledig genoeg uitschakelen dat, na wachten tot het bestaande eiwit is afgebroken, de doeleiwitband van Western blots verdwijnt. In tegenstelling tot vele antisense types (b.v. siRNA, fosforothioaten), veroorzaken Morpholinos over het algemeen geen afbraak van hun RNA-doelen; in plaats daarvan blokkeren zij de biologische activiteit van het doel-RNA totdat dat RNA op natuurlijke wijze is afgebroken, waardoor het Morpholino vrijkomt. Dit betekent dat RT-PCR niet geschikt is voor de bepaling van de blokkering van de translatie door Morpholinos.
Splice Blocking: Door het blokkeren van plaatsen die betrokken zijn bij splicing pre-mRNA, kan Morpholinos worden gebruikt om te wijzigen en te controleren normale splicing gebeurtenissen. Deze activiteit kan gemakkelijk worden getest met RT-PCR, waarbij een succesvolle splice-modificatie zichtbaar wordt als veranderingen in de RT-PCR-productband op een elektroforetische gel. De band kan verschuiven naar een nieuwe massa of, als splice-modificatie nonsens-gemedieerd verval van het transcript teweegbrengt, zal de wild-gesplitste band aan intensiteit verliezen of verdwijnen.
Zoals alle gen knockdown-reagentia, moeten Morpholinos actief worden afgeleverd in de meeste cellen. Morpholinos kan worden geleverd in gekweekte cellen door een verscheidenheid van methoden, met inbegrip van schraap-loading van adherente cellen, elektroporatie, en zelfs micro-injectie. Echter, onze Endo-Porter levering reagens geeft over het algemeen een uitstekende levering in gekweekte cellen in termen van de hoeveelheid Morpholino geleverd per cel, gelijkmatige verdeling over een populatie van cellen, reproduceerbaarheid van levering en niet-toxiciteit voor de meeste celtypes bij de aanbevolen concentratie. Voor dierproeven gaan onze Vivo-Morpholino’s met hun aangehechte afleveringsgedeelte cellen binnen vanuit het bloed na i.v. toediening of komen cellen binnen in weefsels rondom lokale injecties; zij zijn ook de meest geschikte antisense oligo’s voor gebruik in celculturen of explantaten, aangezien zij geen extra agent nodig hebben voor cytosolische aflevering.
Een morfolino-oligo verschilt radicaal van natuurlijke nucleïnezuren, waarbij methyleentemorfolineringen de ribose- of deoxyribose-suikermotieven vervangen en niet-ionische fosforodiamidaatbindingen de anionische fosfaten van DNA en RNA vervangen. Elke morfolinering plaatst een van de standaard DNA-basen (A,C,G,T) op een geschikte plaats voor koppeling, zodat een 25-base Morfolino-oligo zich sterk en specifiek bindt aan zijn complementaire 25-base doelplaats in een RNA-streng via Watson-Crick-paring. Omdat de ongeladen ruggengraat van de Morpholino oligo niet wordt herkend door enzymen, is het volledig stabiel voor nucleasen.
We moedigen u aan om een nauwkeuriger en krachtiger instrument in te zetten voor uw experimentele uitdagingen. Bel onze Ph.D.-niveau klantenondersteuning groep bij Gene Tools om te beginnen met Morpholinos in uw studies. Telefoon: (541) 929-7840 ext. 1.
- Beoordeling van levering
- Oplosbaarheid en Morfolino’s
Zoals bij alle gen knockdown-agentia is effectieve levering van morfolino’s van cruciaal belang. Terwijl de bevestiging van de levering is niet cruciaal voor experimenten met embryonale micro-injectie, bevestiging van de levering is belangrijk voor experimenten met gekweekte cellen. Onze Endo-Porter levering reagens geeft over het algemeen eenvoudige, betrouwbare levering voor de meeste celtypes. U kunt beoordelen of je krijgt goede levering in het cytosol van uw cellen met behulp van een fluorescent-gemerkte Morpholino. Wij raden u aan onze goedkope fluoresceïne-getagd Standard Control oligo voor dit doel.
Bij gebruik van een fluorescerende Morpholino om de levering te bevestigen, beginnen met een concentratie van 10 microMolar Morpholino oligo in het kweekmedium. Dit is een hoog genoeg concentratie dat na 16 uur de fluorescent-gemerkte Morpholino moet zichtbaar zijn in het cytosol door fluorescentie microscopie. Een omgekeerde fluorescentiemicroscoop is de beste keuze voor het observeren van cellen in kweekplaten. Observeer levende (niet gefixeerde) cellen. Gebruik een droge objectieflens met de hoogst mogelijke numerieke apertuur om zoveel mogelijk licht van de cellen te verzamelen. Een geslaagde toediening blijkt uit een diffuse fluorescentie in het hele cytosol. Punctate fluorescentie geeft meestal aan dat de oligo is gevangen in endosomen, dus negeer punctate vlekken en kijk voor de diffuse fluorescentie.
Voor de werkelijke experimenten het leveren van uw aangepaste-sequentie Morfolino met Endo-Porter moet u over het algemeen een concentratie van slechts 1 tot 5 microMolar voor effectieve sterische blokkeren van de meeste mRNAs.
Hoewel Morfolino-oligo’s veel beter oplosbaar zijn dan andere niet-ionische structuurtypes (zoals PNA’s), hebben sommige Morfolino’s met een hoog G-gehalte (>30%) toch een beperkte oplosbaarheid. Ook, gehechtheid van onze rode-emitting lissamine fluor vermindert soms oligo oplosbaarheid. De oplosbaarheid varieert met de sequentie van de oligo en is moeilijk te voorspellen. De onderstaande aanbevelingen kunnen helpen om oligo activiteit te handhaven als uw sequentie heeft een slechte oplosbaarheid.
Voor de lange termijn opslag uw Morpholino voorraad oplossingen zijn het best opgeslagen vriesdrogen, De volgende beste keuze is opslag in oplossing bij kamertemperatuur. Het maken van Morpholino voorraad oplossingen op of onder 1 milliMolar helpt om oplosbaarheid problemen te voorkomen. Vries-dooi cycli of langdurige opslag bij 4C kan neerslag of container vereniging van Morpholinos en afname van de oplossing activiteit veroorzaken; wij raden kamertemperatuur opslag in goed afgesloten containers en, om verdamping te voorkomen in het geval van een defecte flacon afdichting, is het verstandig om voorraden op te slaan in een vochtige omgeving, zoals een humidor (bijvoorbeeld een stolp met een open beker met water). Zorg ervoor dat het oligo niet uitdroogt, want het kan moeilijk of onmogelijk zijn om een uitgedroogd oligo weer op te lossen (hoewel gevriesdroogde oligo’s vrij gemakkelijk oplossen). De flacon in een donkere doos of in folie gewikkeld bewaren is een goede praktijk, omdat oligo’s met fluorlabels in het licht kunnen fotobleken.
Samenvoeging in oplossing kan leiden tot een afname van de biologische activiteit na verloop van tijd en dit kan zich voordoen in oplossingen die bij kamertemperatuur worden bewaard. Dit kan in sommige gevallen worden teruggedraaid door 5 min. bij 65C te verwarmen of in de meeste gevallen door autoclaveren (gebruik de vloeistofcyclus). De oligo’s zijn zeer hittestabiel en verdragen verscheidene autoclaveerbeurten zonder degradatie. Vaak zal autoclaveren een voorraad doen herleven die enige activiteit heeft verloren door aggregatie van oligo.
DNA, RNA, en de meeste gen knockdown reagentia worden meestal opgeslagen in een ijsbad tijdens experimenten om degradatie te minimaliseren door nucleasen. Omdat Morpholinos zijn volledig bestand tegen enzymatische degradatie en waterige oplossingen zijn chemisch stabiel voor onbepaalde tijd (jaren) bij kamertemperatuur, raden wij u aan tijdens uw experimenten uw voorraad oplossingen van Morpholinos houden bij kamertemperatuur. Het koelen van uw voorraad oplossingen in een ijsbad gewoon het risico dat de Morpholino neerslag uit.
Deze voorzorgsmaatregelen zijn meer dan nodig voor de meeste sequenties, maar hun routinematig gebruik helpt om onaangename verrassingen te voorkomen in het geval u tegenkomt een sequentie met een lage oplosbaarheid.