Introduction

4-hydroxy-l-proline (hydroxyproline) is een niet-proteinogeen aminozuur, dat een molecuulgewicht heeft van 131,13g/mol en wordt gesynthetiseerd door post-translationele hydroxylering van proline tijdens de biosynthese van collageen (Fig. 1). Bij onderzoek naar fysiologisch en pathologisch collageenmetabolisme wordt meestal gebruik gemaakt van metingen van hydroxyproline in plasma, urine en lichaamsweefsel. De bepaling van hydroxyproline verschaft derhalve nuttige informatie voor de diagnose en prognose van ziekten die worden veroorzaakt door stoornissen van het collageenmetabolisme (1). Dergelijke aandoeningen zijn onder meer hyperthyroïdie, hyperparathyroïdie, acromegalie, de ziekte van Paget, osteomalacie, rachitis, het syndroom van Marfan, osteogenesis imperfecta, sclerodactylie, dermatomyositis en het syndroom van Cushing (2).

Fibrose die optreedt in de lever, longen, nieren, huid en andere organen kan zich ontwikkelen tot chronische hepatitis, leversclerose, leverkanker, longfibrose en glomerulonefritis (3). Daarom is het voorkomen van de ontwikkeling en het verminderen van de ernst van fibrose bij patiënten van groot belang. Hydroxyproline fungeert als een belangrijke diagnostische indicator voor de ernst van fibrose.

De meting van hydroxyproline in plasma, urine en lichaamsweefsel is mogelijk met colorimetrische methoden, high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) en flowinjectieanalyses (4-6). Deze methoden vereisen echter grote monstervolumes vanwege hun lage gevoeligheid. Bovendien vereist HPLC een lange scheidingstijd voor elk monster. De laatste jaren is vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) in opkomst als voordelig vanwege de hoge gevoeligheid en korte scheidingstijd.LC-MS is gebruikt voor het meten van lage concentraties drugs in serum en urine met verontreinigde stoffen (7-9). Het doel van deze studie was de nieuwe LC-MS methode toe te passen op de meting van hydroxyproline. Als indicator van fibrose werd hydroxyproline in de lever en longen van een rattenmodel van fibrose gemeten door LC-MS, en vergeleken met eerdere resultaten verkregen door HPLC en colorimetrische methoden.

Materialen en methoden

Ethische verklaring

Het studieprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Harbin Medical University (Harbin, China). Een standaardprocedure voor het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming was opgenomen in het protocol, en werd goedgekeurd door de ethische commissie van HarbinMedical University.

Reagents

Dimethylnitrosamine (DMN) en hydroxyproline werden verkregen van Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japan). Nembutal werd aangekocht bij Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japan) enbleomycine werd verkregen van Nihon Kayaku Inc. (Tokyo, Japan). Alle andere chemicaliën waren van reagenskwaliteit.

Preparatie van een model van pulmonale en leverfibrose bij ratten

Een model van pulmonale fibrose werd gecreëerd bij vijf weken oude Wistar ratten door injectie van bleomycine (BLM, 0,30U/100 g, i.Gezonde ratten werden geïnjecteerd met 0,9% zoutoplossing (controle).

Een model van leverfibrose werd gecreëerd bij zeven weken oude Wistar ratten door een enkele injectie van DMN (40 mg/kg, i.p.). Normale gezonde ratten waren de controles en werden geïnjecteerd met 0,9% zoutoplossing (controle). De voorbereiding van het pulmonale leverfibrose model en van het verzamelweefsel waren gebaseerd op de methodes beschreven in de vorige studies (10,11).

Meting van hydroxyproline in een ratmodel van pulmonale fibrose door een colorimetrische methode

De linkerlong werd verwijderd, gewogen (~0.3 g) en gehomogeniseerd in 5% trichloorazijnzuuroplossing (x 10 volume) met behulp van een celhomogenisator (Eilard, Berlijn, Duitsland) bij 8.000 × g (4 ° C) gedurende 2 min in een ijsbad. De cellen werden gecentrifugeerd (2.500 × g, 4 ° C) gedurende 20 min en het supernatant tweemaal gewassen met gedestilleerd water. Vervolgens werd 6 N HCl toegevoegd bij 110°C en reageerde het geheel gedurende 16 uur. Nadat de reactie was voltooid, werd tolueen (3 ml) toegevoegd en werd het mengsel gedurende 20 min. geagiteerd. Na centrifugering (3.000 × g, 20°C) gedurende 10 min werd de organische laag opgevangen en werd p-dimethylaminobenzaldehyde toegevoegd.Hydroxyproline in het monster werd gedetecteerd met een Multiplate-spectrometer (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bij 560 nm.

Meting van hydroxyproline in de lever door HPLC

De linker long werd verwijderd, gewogen (~ 0,3 g) en gehomogeniseerd in 5 ml ethanol met behulp van een celhomogenisator (Eilard) bij 8.000 xg (4 ° C) gedurende 2 min in een ijsbad. Het homogenaat werd gedurende 20 min. gecentrifugeerd (2.500 × g, 4°C) en het supernatant werd opgevangen. De vloeistof (1 ml) werd verkregen en gedurende 8 uur bij60°C verwarmd tot hij droog was. Na oplossing van het residu in 40 μl ethanol en 80 μl boraatbuffer (0,1 M, pH 8) werd 40 μl4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) als fluorescentieagent toegevoegd. De reactie werd gedurende 15 uur in het donker bij kamertemperatuur voortgezet. Vervolgens werd 840 μl zoutzuur (6 mol/l) toegevoegd om de reactie te beëindigen. Na centrifugatie (2.500 × g, 20°C) gedurende 20 min werd het supernatant verwijderd voor HPLC-analyse.

Een Hitachi L6000 HPLC-systeem (Hitachi High-Technologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) werd gebruikt.Detectie werd uitgevoerd met een Hitachi L7480 fluorescentiespectrometer (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan; excitatie bij 475 nm, emissie bij 530 nm). De kolom (HitachiHigh-Technologies Corporation) was een YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) bij kamertemperatuur. De mobiele fase was acetonitril: water (35:65-50:50 gradiënt over 15 min) en de stroomsnelheid was 1ml/min.

Meting van hydroxyproline inpulmonaire en leverorganisatie door LC-MS

De linker long werd verwijderd, gewogen (~ 0.3 g) en gehomogeniseerd in 5% trichloorazijnzuuroplossing (x 10 volume) met behulp van een celhomogenisator (Eilard) bij 8.000 × g (4 ° C) gedurende 2 min in een ijsbad. De cellen werden gecentrifugeerd (2.500 × g, 4°C) gedurende 20 min. Het supernatant werd tweemaal gewassen met gedestilleerd water. Daarna werd 6 N HCl toegevoegd bij 110°C gedurende 16 uur en werden de monsters klaargemaakt voor meting. De lever werd verwijderd, gewogen (~0,3 g) en gehomogeniseerd in 5 ml ethanol met een celhomogenisator (Eilard) bij 8.000 × g (4°C) gedurende 2 min in een ijsbad. Het homogenaat werd gecentrifugeerd (2.500 × g, 4 ° C) gedurende 20 min, het supernatant verzameld en de monsters bereid voor metingen.

De concentratie van hydroxyproline werd bepaald volgens een LC-MS-methode met behulp van een LC-MS2020 systeem (Shimadzu Corp, Kyoto, Japan). Wat LC betreft, was de mobiele fase 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. De kolom was Shin-pack VP-ODS (150×2 mm diameter). De stroomsnelheid was 0,2 ml/min. Voor MS werd atmosferische chemische ionisatie (APCI) gebruikt. Er werd ook gebruik gemaakt van positieve ionendetectie. De probe-elektronspanning bedroeg 4,5 kV en de probe-stroom 4,2 μA. DeAPCI-sondetemperatuur bedroeg 250°C en de gebogen desolvatie lijn (CDL) elektronenspanning was -30,0 V. De CDL-temperatuur was 250°C en de bloktemperatuur 20°C. De biasspanning voor Q-arrays 1, 2 en 3 was respectievelijk 5,0, 25,0 en 35,0 V. De Q-array RF elektronvoltage was 150.0 V.

Statistische analyse

De verschillen tussen de groepen werden onderzocht door een een-weg analyse van variantie. Indien een significant verschil werd vastgesteld, werd het verschil tussen de groepen onderzocht met de methode-Bonferroni. Correlaties werden onderzocht met een tweezijdige t-toets. P<0,05 werd beschouwd als een statistisch significant verschil.

Resultaten

Meting van de hydroxyprolineconcentratie door LC-MS

MS chromatogram van hydroxyproline

Het massaspectrum van hydroxyproline wordt getoond inFig. 2. MS van de hydroxyprolinestandaard (80 pg/ml) resulteerde in fragmentpieken met een moleculairemassa van 173,0 (molecuulion + azijnzuur-water) gegenereerd uitadditie aan azijnzuur-ammonium voor het verhogen van het aantal ionischemoleculen (moleculaire hoeveelheid, 131,15) en ionische sterkte.

LC-MS chromatogram vanhydroxyproline

De LC-condities waren als volgt: Mobiele fase, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolom, Shin-pack VP-ODS (150×2 mm diameter); stroomsnelheid, 0,2 ml/min enultraviolet (UV) detectie bij 230 nm. MS werd uitgevoerd met deAPCI -ionisatiemethode en de ionendetectie was positief.

Het LC-MS-selected ion monitoring (SIM)-chromatogram van hydroxyproline (m/z, 173,0) wordt gepresenteerd in Fig. 3. Zoals voor de hydroxyproline-standaard werd een piek waargenomen bij 1 ng/ml met een retentietijd van 2,213 min. Ook bij 50 ng/ml werd een scherpe piek waargenomen. Bij 1 μg/ml, 1000 × de standaardconcentratie, werd in het LC-UV-spectrum een kleine piek waargenomen (230 nm).

Gevoeligheid van LC-MS-detectie voor hydroxyproline

De LC-MS-SIM-standaardkromme van hydroxyproline (m/z, 173,0; molecuulion + azijnzuur-water) is afgebeeld in Fig. 4. Bij gebruik van de piekoppervlakmethode voor de standaardcurve vertoonde hydroxyproline een scherpe piek bij 35ng/ml (fig. 3). Bij concentraties <35 ng/ml werd echter geen correlatie tussen de piekoppervlakken waargenomen. Van 35-560 ng/ml werd een correlatie tussen de piekoppervlakken waargenomen en de standaardcurve was een rechte lijn. Bij 60 en 80 μg/ml waren de piekoppervlakken vrijwel identiek. Een correlatie tussen de piekgebieden werd niet waargenomen bij concentraties >60 μg/ml.

LC-MS-chromatogram en MS-spectrum vanhydroxyproline in een model van pulmonale en leverfibrose bij ratten

Fig. 5 toont hetLC-MS-chromatogram en het MS-spectrum met SIM-detectie vanhydroxyproline (m/z 173,0; molecuulion + azijnzuur-water) in een pulmonaal model van fibrose bij ratten. In het LC-MSchromatogram van de long, vergelijkbaar met dat van de hydroxyprolinestandaard, werd een duidelijke piek bij m/z 173,0 waargenomen bij een retentietijd van 2,213 min. Hydroxyproline werd geïdentificeerd bij m/z 131,15 in het massaspectrum.

Fig. 6 illustreert het LC-MS chromatogram en het MS spectrum met SIM detectie van hydroxyproline (m/z 173,0; molecuulion + azijnzuur-water) in het fibrotisch leverweefsel van ratten. Net als bij de hydroxyproline-standaard werd in het LC-MS-chromatogram en het MS-spectrum een piek waargenomen bij een retentietijd van 2,213 min.

Hydroxyproline-concentratie in longweefsel (colorimetrische en LC-MS-methoden)

Colorimetrische en LC-MS-methoden voor de bepaling van de hydroxyproline-concentratie in rattenlongweefsel worden vergeleken in fig. 7. Elke kolom geeft het gemiddelde ± de standaardafwijking van negen experimenten weer. Volgens de colorimetrische methode was de hydroxyprolineconcentratie in rattenlongweefsel in de BLM-geïnfundeerde groep (652,3±70,0 μg/linkerlong) significant hoger dan die in de controlegroep (547,1±52,3 μg/linkerlong; P<0,05). Volgens de LC-MS methode had de met BLM geïnfundeerde groep (610,9±50,3 μg/linkerlong) een significant hogere waarde vergeleken met de controlegroep (493,3±53,5 μg/linkerlong; P<0,05).De hydroxyprolineconcentratie in rattenlongweefsel gemeten met de LC-MS methode had echter een lagere waarde vergeleken met die gemeten met de colorimetrische methode.

De hydroxyprolineconcentraties in rattenlongweefsel gemeten met colorimetrische en LC-MS methoden worden vergeleken in Fig. 8. Er werd een correlatie vastgesteld tussen de colorimetrische en LC-MS-methoden voor de bepaling van de hydroxyprolineconcentratie in het longweefsel van de controlegroep (r=0,972). Evenzo werd een correlatie vastgesteld tussen de colorimetrische en LC-MS methoden voor de bepaling van de hydroxyproline concentratie in het longweefsel van de BLM-geïnfundeerde groep (r=0,918).

Hydroxyproline concentratie in rattenleverweefsel door fluorescentielabeling en LC-MS methoden

De bepaling van de hydroxyproline concentratie in rattenleverweefsel door fluorescentielabeling en LC-MS methoden wordt geïllustreerd in Fig. 9. Volgens de fluorescentielabelingmethode was de hydroxyprolineconcentratie in rattenleverweefsel van de DMN-geïnfundeerde groep (105,4±36,5 μg/g) significant hoger vergeleken met die in de controlegroep (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). Ook volgensLC-MS analyse, toonde de DMN-geïnfundeerde groep (190,4±70,3 μg/g) een significant hogere waarde aan in vergelijking met de controlegroep (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). De hydroxyprolineconcentratie in rattenleverweefsel gemeten met LC-MS was echter hoger in vergelijking met die gemeten met de fluorescentielabelingmethode.

De hydroxyprolineconcentratie in rattenleverweefsel beoordeeld met fluorescentielabeling en LC-MS-methoden zijn gecorreleerd in Fig. 10. De hydroxyprolineconcentratie in het leverweefsel van de controlegroep, bepaald met behulp van fluorescentielabeling, correleerde met de hydroxyprolineconcentratie verkregen met de LC-MS-methode (r=0,957). Ook de hydroxyprolineconcentratie in het leverweefsel van de DMN-geïnfundeerde groep, verkregen met de fluorescentielabelingmethode, correleerde met die verkregen met de LC-MS-methode (r=0,981).

Discussie

Hydroxyproline is een type aminozuur dat in het albumine voorkomt. Het proline-residu in het eiwit wordt gehydroxyleerd door4-monooxgenase om 4-hydroxy-2-oxoglutaalzuur te genereren, dat via 4-glutaminezuur in het menselijk lichaam wordt omgezet in alanine en glycine. In elk inwendig orgaan van het lichaam kunnen ontsteking en fibrose aanleiding geven tot de ophoping van bestanddelen van dextracellulaire matrix (ECM) (12).Onder pathologische omstandigheden kan echter ook in de lever, longen en nieren fibrose optreden (13,14).Chronische hepatitis en leversclerose worden geassocieerd met fibrose en hebben ook een nauwe correlatie met leverkanker (15).

In de longen is de ernst van de fibrose afhankelijk van het type longontsteking (16).Gewoonlijk gaat longfibrose gepaard met interstitiële pneumonie(17). Fibrose in interne organen wordt veroorzaakt door proliferatie van ECM componenten afgezet door myofibroblasten. Om de ontwikkeling van fibrose te begrijpen moet de collageenconcentratie onderzocht worden. De hydroxyprolineconcentratie wordt in verband gebracht met collageen als een indicator van de ernst van deze fibrose (18-20). Hydroxyproline is belangrijk als index van de ziekte veroorzaakt door collageenproliferatie (zoals infibrose) en metabolismestoornissen.

In de afgelopen jaren is aangetoond dat LC-MS een zeer gevoelige detectiemethode is (7,8,21).LC-MS bestaat uit een LC- en een MS-component, en de interface die hen met elkaar verbindt. Het LC-gedeelte is identiek aan conventionele HPLC. Het monster wordt geïoniseerd door het interface-gedeelte. Bij thermospray-ionisatie ontstonden onstabiele (vluchtige) producten, zodat APCI werd gebruikt (dat het materiaal ioniseert, maar niet het oplosmiddel, na verneveling met oplosmiddel onder atmosferische druk). Elektrospray-ionisatie (ESI) kan worden gebruikt voor het ioniseren van moleculen met een hoge polariteit en een hoog molecuulgewicht, wat bij uitstek geschikt is voor de interface-component.In de huidige studie was ESI echter niet geschikt voor de themameting van hydroxyproline in lichaamsspecimens, aangezien ESI bij de ionisatie niet werd begeleid door de thermospray. Het was een eenvoudiger procedure om hydroxyproline gecombineerd met Na+ te meten door extra Na+ aan het monster toe te voegen.

Het MS-spectrum van hydroxyproline vertoonde pieken van m/z 173.0 en 131.15. m/z 173.0 werd geïdentificeerd als de piek die het azijnzuurzout vertegenwoordigt, afkomstig van het azijnzuur-ammonium dat aan de mobiele fase was toegevoegd om de sterkte te verhogen. Aangezien de vergelijkende sterkte van m/z 131.15 en 173.0 in het MS-spectrum ongeveer identiek was, werd het ion van m/z 173.0 door SIM in het MS-chromatogram gekozen om de interferentiepiek van de mobiele fase te vermijden.

In het MS-chromatogram van de hydroxyprolinestandaard bij 1 ng/ml werd bij de SIM-meting een piek waargenomen met m/z 173.0. In het UV-spectrum (230 nm) van hydroxyproline bij 1 μg/ml, dat 1000 maal de standaardconcentratie was, werd een kleine piek waargenomen (de meting werd tegelijk met de LC-meting uitgevoerd).

Bij concentraties <35 ng/ml werd onder de piekgebieden geen sterke correlatie tussen de verschillende methoden waargenomen en het was niet mogelijk een standaardcurve te maken. Er werd verondersteld dat de analyt beïnvloed kan zijn door de piek van de mobiele fase, aangezien hydroxyproline een betrekkelijk laag moleculair gewicht heeft (131,15). Bovendien kan de retentietijd van de piek onstabiel zijn geworden als gevolg van de polariteit van het oplosmiddel bij lage concentraties (hydroxyprolineconcentratie <35 ng/ml).

De hypothese was dat het mogelijk zou kunnen zijn concentraties van stoffen zo laag als het pg/ml-niveau te meten. Voor de piek van hydroxyproline in het MS-chromatogram was de retentietijd kort (2,213 min). Het vermogen van hydroxyproline om op de ODS-kolom te worden vastgehouden, was zwakker dan oorspronkelijk was voorgesteld. De relatieve ionensterkte in het MS-spectrum bij m/z 131,15en 173,0 was ongeveer identiek, en dienovereenkomstig koos de interferentiepiek van de mobiele fase een ion van m/z 173,0. In het LC-MS-chromatogram van hydroxyproline in long- en leverweefsel werd een scherpe piek van m/z 173,0 waargenomen bij een retentietijd van 2,213 min, net als bij de hydroxyprolinestandaard. Met betrekking tot het MS-spectrum werd de moleculaire ionenpiek van hydroxyproline (m/z 131.15) bevestigd.

De meting van de hydroxyprolineconcentratie in long- en leverweefsel door LC-MS werd vergeleken met die verkregen door de colorimetrische methode en een fluorescentiemethode met behulp van HPLC uit een eerdere studie van onze groep. Er werd een zeer significante positieve correlatie vastgesteld. De waarde van de hydroxyprolineconcentratie in de long verkregen met de colorimetrische methode was echter hoger dan die verkregen met LC-MS. Bovendien was de hydroxyprolineconcentratie in de lever verkregen door de fluorescentiemethode met HPLC lager dan de waarde verkregen door LC-MS (die verondersteld werd een hoge absorptie te zijn van alle componenten in het monster bij een constante golflengte van 560 nm).

Concluderend werd hydroxyproline, als indicator van fibrose, gemeten met colorimetrische en HPLC-methoden in eerdere studies van onze groep. Ter vergelijking, in de huidige studie werd vastgesteld dat de LC-MS methode voordeliger was, gekenmerkt door het eenvoudige proces, de hoge gevoeligheid (pg-niveau) en de korte scheidingstijd. Verder onderzoek met grotere aantallen monsters is nodig om deze resultaten te bevestigen.

Acknowledgements

De auteurs zijn dank verschuldigd aan M. Kusunose, M. Ono en A. Hamada (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi, Japan) voor het verstrekken van verschillende reagentia gebruikt in deze studie, nuttige suggesties en technische expertise. Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid van de provincie Heilongjiang (nr. 2013365) van China.

	Kitchener RL en Grunden AM: Prolidasefunctie in het proline metabolisme en de medische en biotechnologische toepassingen ervan. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.Bekijk artikel : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H and MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collageen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesis and degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M and Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids. Rapid Communauté Massaspectrom. 20:1801-1808. 2006. Bekijk artikel : Google Scholar
	Jemal M and Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Artikel bekijken : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G and Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al:LC-MS-based metabolomics in the clinical laboratory. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rats. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Artikel bekijken : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Artikel bekijken : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(In Japans).
	Muiznieks LD and Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM and Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR and Poterucha JJ:Natural history of hepatitis B virus infection: an update forclinicians. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM and Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Artikel bekijken: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ and Brown KK: Acute interstitiële pneumonie en acute exacerbaties van idiopathische pulmonale fibrose. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in relation to the changes in hydroxyproline and retinoid levels of the liver inrats. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. Bekijk artikel : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rats after partial hepatectomy. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. Artikel bekijken : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Bekijk Artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R and Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.