We gebruikten glucose, glucose en glutamine voedingsbronnen om de koolstofstroom in K562 cellen en veranderingen in reactie op BaP behandeling te ontcijferen. Over het algemeen observeren we de grootste hoeveelheid label incorporatie in ribose moieties en lactaat (zie en Additional file 1: Figuur S1 voor details over label distributies). Zoals geïllustreerd in Fig. 1, kan labelintegratie in de Krebs-cyclus vanuit glucose naar verwachting twee duidelijk verschillende etiketteringspatronen van Krebs-cyclusmetabolieten opleveren, afhankelijk van of het C2-fragment binnenkomt via pyruvaatcarboxylase (PC) of pyruvaatdehydrogenase (PDH). Het uit glucose gevormde pyruvaat zal glutamaat opleveren via PDH, maar glutamaat via PC-activiteit. Aangezien PC-activiteit oxaloacetaat uit pyruvaat produceert, verwacht men malaat uit PC, terwijl het PDH-product malaat of malaat zal zijn.

NMR-spectra geven aan dat grote hoeveelheden aspartaat en malaat van PC afkomstig zijn

Zoals blijkt uit Fig. 2, worden significante verschillen waargenomen tussen cellen die glucose verwerken gedurende 3 vs. 24 uur voor de resonanties van malaat en aspartaat. Deze verschillen manifesteren zich voornamelijk in een verandering van NMR-koppelingsconstanten. De grootte van deze koppelingsconstanten hangt af van de aard van het aangrenzende koolstofatoom: een carbonzuurgroep levert een veel grotere koppelingsconstante op dan een CH2-groep. De koppelingsconstante voor het 13C1 13C2-gedeelte in aspartaat of malaat bedraagt ongeveer 50-60 Hz, terwijl de koppelingsconstante voor een 13C2 13C3-gedeelte ongeveer 35-40 Hz bedraagt.

Voor een 24-uurs labeling toont fig. 2 schijnbare koppelingsconstanten van 53 Hz voor C2 van malaat en aspartaat. Deze grote schijnbare koppelingsconstante toont aan dat de koppeling van C2 met de aangrenzende C1-carboxylzuurgroep overheerst. Dit 13C1 13C2-koppelpatroon (en ook 13C3 13C4, zie Additional file 1) is het gevolg van de PDH-activiteit en mogelijk ook van metabolieten die bij een langere etiketteringsperiode meerdere malen door de Krebs-cyclus gaan.

Voor de korte etiketteringsperiode van 3 uur worden voor C2 kleinere schijnbare koppelconstanten van 47 en 41 Hz waargenomen (fig. 2 en Additional file 1: figuur S1), wat aangeeft dat de koppeling met het aangrenzende methyleen C3 domineert. De aanwezigheid van het 13C2 13C3 gedeelte bij kortere etiketteringstijdstippen toont aan dat het product afkomstig van de PC-activiteit bij kortere etiketteringstijdstippen domineert.

Opgemerkt moet worden dat de waargenomen signaalsplitsingen niet de exacte scalaire koppelingsconstanten in een mengsel van geëtiketteerde verbindingen vertegenwoordigen. Niettemin geeft de waargenomen verandering een duidelijke aanwijzing voor grotere hoeveelheden van het PC-product bij kortere labelingstijden in zowel malaat als aspartaat.

Verder bewijs voor PC-activiteit in subspectra van uracil

In de novo pyrimidine-synthese wordt uracil gevormd uit aspartaat via carbamoyl-aspartaat, orotaat en dihydroorotaat. Daarom moeten etiketteringspatronen in aspartaat worden weerspiegeld in pyrimidine ringsignalen. Extra bestand 2: Figuur S2 toont verwachte label incorporaties voor uracil. Wanneer de uracil-base in UDP wordt gesynthetiseerd uit aspartaat, is de bestemming van de 13C’s als volgt: C1, C2 en C3 van aspartaat worden respectievelijk C10, C11 en C12 van UDP, terwijl C4 verloren gaat (zie Additional file 2). In HSQC spectra kunnen alleen C11 en C12 direct worden waargenomen, aangezien C10 geen aangehecht proton heeft.

Voor glucose-gelabelde monsters zal het PC-afgeleide aspartaat C2C3-gelabeld zijn. Dit wordt in UDP omgezet in een gelabeld C11C12-fragment. Van PDH afgeleid aspartaat kan echter worden gelabeld op C1C2 of C3C4. Dit vertaalt zich in respectievelijk C10C11 of een geïsoleerde C12 in uracil. Daarom zijn spectra van C12 indicatief voor relatieve hoeveelheden PC versus PDH activiteit; PC geeft een doublet voor C12, terwijl PDH een singlet geeft bij C12.

Alle spectra vertoonden zowel de singlet als doublet signalen bij C12 (Fig. 3). De intensiteit van het doublet ten opzichte van het singlet veranderde echter tussen de gegevens van 3 en 24 uur met een factor drie, wat opnieuw wijst op een verschuiving van PC naar PDH-gemedieerde labeling met de tijd. Het beeld dat uit verschillende metabolieten naar voren komt, is dat er parallelle activiteit van zowel PC als PDH is, maar dat het PC-product voornamelijk wordt gekanaliseerd naar producten die direct gekoppeld zijn aan oxaloacetaat, wat de hoge waargenomen hoeveelheid PC-product in deze metabolieten oplevert bij een kortdurende blootstelling. Alleen bij langere etiketteringsperioden wordt het PDH-product waargenomen in de linkertak van de Krebs-cyclus.

BaP-geïnduceerd malonaat is afkomstig van downstream PC activiteit in K562 cellen

Wij hebben aangetoond dat malonaat kan worden gevormd uit oxaloacetaat door chemische conversie onder invloed van waterstofperoxide en hebben in onze vorige studie gesuggereerd dat malonaataccumulatie in reactie op BaP-behandeling werd aangedreven door behandeling-geïnduceerde verhoging van ROS die op oxaloacetaat inwerkt. Monsters werden gespiked met malonaat om onze toewijzing van de malonaat methyleen 1H/13C resonanties in HSQC spectra te bevestigen (zie Additional files 3 en 4). Vervolgens, in deze studie, heeft onze tracer-gebaseerde aanpak ons in staat gesteld om de oorsprong van het waargenomen malonaat te overwegen.

Zoals getoond in Fig. 4a, zou ROS-afgeleid malonaat afkomstig van oxaloacetaat dat direct was gevormd uit pyruvaat door PC activiteit met glucose als voedingsbron naar verwachting worden gelabeld in posities C1 en C2. In de alternatieve situatie dat de PDH-activiteit pyruvaat omzet in acetyl-coA bij binnenkomst in de Krebs-cyclus, zou de door ROS gemedieerde omzetting van het resulterende oxaloacetaat in malonaat naar verwachting twee producten opleveren met een label in de C1-positie of in de C1- en C2-positie in een 1:1-verhouding omdat de Krebs-cyclus symmetrisch succinaat en fumaraat doorloopt (zie ook fig. 1).

Figuur 4b toont een representatieve 1D plak uit HSQC spectra afkomstig van 24 h BaP-behandelde glucose-gelabelde cellen en toont duidelijk drug-geïnduceerde generatie van een sterke malonaat signaal. In de overeenkomstige HSQC-spectra afkomstig van 24 uur met BaP behandelde glucose-gelabelde cellen, zagen we een duidelijk doublet (Fig. 4c weergegeven als rode pieken) met een splitsing van 58 Hz, indicatief voor een gelabelde CH2-groep gekoppeld aan een carbonzuurkoolstof. Dit is een duidelijke aanwijzing voor een C1,C2 (of C2,C3)-gelabeld malonaat met label in slechts één van de twee carbonzuurgroepen. Malonaat dat op alle drie posities gelabeld is en dat afkomstig zou kunnen zijn van meerdere passages door de Krebs-cyclus, zou naar verwachting een triplet bij C2 in de 13C-dimensie van HSQC-spectra laten zien, aangezien ten minste een bepaald percentage in beide COO-groepen gelabeld zou zijn (AX2-koppelpatroon). Daarom is de afwezigheid van een centraal signaal in HSQC een sterke aanwijzing dat malonaat afkomstig is van PC-activiteit stroomopwaarts. De afwezigheid van malonaat afkomstig van meervoudige Krebs-cycli en PDH-activiteit wordt ook ondersteund door het feit dat malonaat afkomstig van 24 uur labelen van met BaP behandelde cellen met glucose slechts een singlet vertoonde (Fig. 4c weergegeven als blauwe piek).

Om verder te bewijzen dat geneesmiddel-geïnduceerd malonaat stroomafwaarts van PC-activiteit wordt afgeleid, verwierven we 13C-1D-spectra waarin we de COO-resonanties van malonaat direct konden waarnemen (Fig. 4d). Een referentiespectrum van 10 mM malonzuur in dezelfde (pH 7) buffer als gebruikt voor celextracten bevestigde de frequentie van de COO-resonantie (fig. 4d).

PC-gemedieerde labeling zal naar verwachting een doublet bij C1 (afkomstig van malonaat) opleveren, terwijl PDH-gemedieerde labeling naar verwachting een 50:50 mengsel van een doublet afkomstig van malonaat en een singlet afkomstig van malonaat zal opleveren (fig. 4a). Hoewel de verkregen spectra zelfs na 24 uur acquisitie ruis vertonen, vertonen ze een duidelijk doublet zonder restsignaal in het midden (fig. 4d), wat bevestigt dat het van PC afkomstige etiketteringsproduct dominant is. Hieruit concluderen wij dat malonaat inderdaad afkomstig is van ROS-gemedieerde omzetting van oxaloacetaat, geheel of ten minste voor het grootste deel afkomstig van de PC-activiteit, en geen bijdrage vertoont van een mogelijk PDH-product, zelfs niet na een etiketteringsperiode van 24 uur. Controle-experimenten waarbij glutamine als koolstofbron werd gebruikt, lieten slechts een minimale labelintegratie in malonaat zien. Het uit glucose geproduceerde malonaat bleek overwegend via PC te worden gelabeld. Samen suggereren deze twee feiten sterk dat malonaat voornamelijk wordt geproduceerd uit glucose via glycolyse en PC-gemedieerde invoer van pyruvaat in de TCA-cyclus.

Aanwijzingen voor parallelle PDH-activiteit

Tabel 1 vergelijkt 1 J CC-koppelconstanten en multiplet intensiteitspatronen gezien in de 3- en 24-uurs gelabelde datasets. In zowel de 3 als de 24 uur datasets is de labeling bij glutamaat C4 veel groter dan de labeling bij C4 en de splitsing gezien bij C4 wijst op koppeling met C5. Dit wijst er sterk op dat PDH-gemedieerde labeling dominant is voor glutamaat op beide tijdstippen. Het citraat C2 wordt gesplitst door een grote koppeling aan C1, wat er opnieuw sterk op wijst dat PDH-gemedieerde labeling dominant is. Deze etiketteringspatronen wijzen op een duidelijke dominantie van PDH-producten voor de rechtertak van de Krebs-cyclus, die leidt van citraat naar glutamaat.

Computationele multipletanalyse

Slices van de 1H-13C-HSQC werden ook kwantitatief geanalyseerd door 13C-NMR spectra te simuleren voor een mengsel van verschillende isotopomeren met behulp van de pyGamma software van binnen de NMRLab software . Voor glutamaat bevestigde de multiplet-analyse dat PDH-gemedieerde labeling dominant was bij zowel 3 als 24 uur, ongeacht de BaP-behandeling. Voor aspartaat, de multiplet analyse bevestigd dat er een verschuiving van PC-gemedieerde labeling op 3 uur naar PDH-gemedieerde labeling op 24 uur. De gesimuleerde spectra worden getoond in Additional file 5: Figuur S4, en tabel 2 bevestigt kwalitatieve resultaten voor aspartaat en glutamaat.