Bacteriestammen en groeiomstandigheden

Bacteriestammen worden vermeld in aanvullende tabel 2. Escherichia coli werden gekweekt op Luria Bouth (LB) platen of in vloeibaar LB-medium, aangevuld met 200 µg ml-1 erytromycine bij 37 ° C. Transformatie van E. coli met plasmide DNA werd uitgevoerd met chemisch competente cellen. S. pneumoniae serotype 2 D39 en serotype 4 TIGR4 en hun isogene mutanten werden gekweekt op Columbia bloed agar platen (Oxoid) met erytromycine (5 µg ml-1) en / of chlooramfenicol (5 µg ml-1), of gekweekt in Todd-Hewitt bouillon aangevuld met 0,5% gistextract (THY; Roth) of chemisch gedefinieerde medium (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences), respectievelijk. Cultivatie van pneumokokken op bloed agar of in vloeibare culturen werd uitgevoerd bij 37 ° C en 5% CO2 zonder agitatie.

Mutant constructie

Voor de bouw van de pneumokokken tacL mutanten in D39 en TIGR4, een DNA-fragment bestaande uit de S. pneumoniae D39 spd_1672-gen en de up- en downstream flankerende regio’s werden geamplificeerd door PCR van genomisch DNA met primer SPD1672_OLup_for en SPD1672_OLdwn_rev (primers zijn opgenomen in aanvullende tabel 2). De gezuiverde PCR-producten werden gekloond in pUC18 en E. coli DH5α chemisch competente cellen werden getransformeerd met het resulterende plasmide. Het recombinante plasmide pNH1 met de gewenste DNA insert werd gezuiverd en gebruikt als sjabloon voor een inverse PCR-reactie met primer InvrevKpnISPD1672 en InvforPstISPD1672. De geschrapte gensequentie werd vervangen door een ermB-gen, geamplificeerd door PCR van vector pTP1 met primer InvrevKpnIErm en InforPstIErm. De uiteindelijke recombinant plasmide werd gebruikt om te transformeren en pneumococci mutageniseren. De transformatie-efficiëntie werd geëvalueerd met behulp van het uiteindelijke recombinante plasmide vs. een ander gen-deletieplasmide (voor de deletie van het cbpL-gen) in S. pneumoniae D39Δcps 44. Opmerkelijk was dat de transformatie-efficiëntie daarbij aanzienlijk werd verhoogd voor de tacL-deletie (2,8 kolonies per ng plasmide voor cbpL vs. 29,8 kolonies per ng plasmide voor tacL).

Isogene mutanten werden aangevuld met een in trans-systeem op basis van pBAV1CpE; pBAV1CpE werd gemodificeerd uit pBAV1K-T5-gfp45, door het kanamycine-resistentiegen te vervangen door een chlooramfenicol-resistentiegen en de T5-promotor te vervangen door een erytromycine-promotorgebied (pE), dat de ribosomale bindingsplaats en het startcodon omvat. Het volledige spd_1672-gen werd geamplificeerd door PCR met gebruikmaking van primer 1672_com_for en Spd1672_com_rev en het gezuiverde fragment werd gekloond in pBAV1CpE. Het resulterende plasmide pBAV-tacL werd gebruikt om isogene tacL-mutanten te transformeren. De deletie van tacL en de in trans complementatie werden geverifieerd met qRT-PCR (supplementaire fig. 3).

Real-time kwantitatieve PCR (qRT-PCR)

Ingekapselde en niet-ingekapselde D39 wild-type stam, tacL-deficiënte mutant, en aangevuld mutant werden gekweekt in THY tot mid-log fase (A 600 = 0,35-0,45) en geoogst voor RNA-isolatie met behulp van EURx GeneMatrix Universal RNA zuivering kit (roboklon). De kwaliteit van het RNA werd gecontroleerd door agarose gelelektroforese en standaard PCR met primer EnoRT_F en EnoRT_R (zie aanvullende tabel 2). De synthese van cDNA werd uitgevoerd met behulp van SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) en hexameric_random primers (GE Healthcare) volgens de instructies van de fabrikant. De kwaliteit van het cDNA werd gecontroleerd door PCR met gebruikmaking van de primers EnoRT_F en EnoRT_R en de concentratie werd gemeten met nanodrop. cDNA werd bewaard bij -20 °C tot verdere tests. Voor de qRT-PCR-experimenten werden StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) en SYBR® Green Master Mix (Biorad) gebruikt in combinatie met tacL-specifieke primers alsook enolase-primers als controle (zie supplementaire tabel 2). De StepOne-software (v. 2.3, Life Technologies) werd gebruikt voor de gegevensanalyse. De eindresultaten worden weergegeven als grootte van de fluorescentie (ΔRn) uitgezet tegen PCR-cyclusnummers.

Sequencing en bioinformatica-analyse

Sequencing: 1 ng gezuiverd chromosomaal DNA van S. pneumoniae-stammen D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), en TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) werd gebruikt om individuele bibliotheken te bereiden met behulp van en volgens de Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kit. Een Agilent Technology 2100 Bioanalyzer diende om tagmentatie en de uiteindelijke bibliotheek fragment grootteverdeling op een hoge gevoeligheid DNA-chip te controleren. AMPure XP-korrels werden gebruikt voor de opzuivering van de DNA-bibliotheek. De uiteindelijke gepoolde bibliotheek werd toegepast op een MiSeq Reagent v3 600-cyclus kit en gesequeneerd op een MiSeq-systeem als 300-cyclus paired-end run. De uiteindelijke bibliotheekpool werd bespijkerd met 5% PhiX-controlebibliotheek. Een cluster dichtheid van 847 ± 25 (K mm-2) werd bereikt met 96.46 ± 1.48% van de clusters passeren filter specificaties. 20.3 Mio leest (94.7%) van 21.1 Mio totale leest filter specificaties doorgegeven, wat leidt tot 12.52 Gbp van sequentie data. Index leest waren gelijkmatig verdeeld over de zes individuele monsters. Gegenereerde FASTQ-bestanden werden onderworpen aan verdere bioinformatica-analyse zoals hieronder beschreven.

SNP-detectie en annotatie: SNP-detectie werd uitgevoerd voor S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL afzonderlijk met behulp van “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parameter: minimumdeel voor variantbewijs: 60%; minimale dekking van variant site: ≥5 sequenties leest). Als referentiegenoom werd Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) of Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) gebruikt.

De resulterende SNP’s voor elke groep mutanten (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) en (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) werden samengevoegd en vergeleken. Genoom dekking werd geschat met qualimap46 met behulp van dezelfde referentie-genen als voor SNP detection.

Osolatie van pneumokokken teichoïnezuren

Extractie en isolatie van LTA: LTA zuivering werd uitgevoerd in principe zoals elders beschreven 7, maar om de opbrengst van pnLTA te optimaliseren, een specifiek detail is gewijzigd. Pneumokokken cellen werden geresuspendeerd in citraatbuffer (50 mM, pH 4,7) en onderbroken driemaal door de Franse pers (Constant Cell Disruption System, serienummer 1020) bij 10 ° C bij een druk van 20 kPSI. Aan de gecombineerde supernatanten werd SDS toegevoegd tot een eindconcentratie van 4%. De oplossing werd gedurende 30 minuten bij 100 °C geïncubeerd en daarna gedurende één nacht bij kamertemperatuur geroerd. De oplossing werd bij 30.000×g gedurende 15 min. bij 4 °C gecentrifugeerd. De pellet werd viermaal gewassen met citraatbuffer onder de centrifugeervoorwaarden zoals hierboven beschreven. De gecombineerde LTA-bevattende supernatanten en het resulterende sediment, dat het ruwe PGN-WTA-complex bevat, werden afzonderlijk gevriesdroogd. De resulterende vaste stoffen werden beide vijfmaal gewassen met ethanol (centrifugeren: 20 min, 20 °C, 10 650×g) om SDS te verwijderen en gevriesdroogd (resulterend in pellet A met LTA en pellet B met het PGN-WTA-complex). Voor de isolatie van LTA werd pellet A geresuspendeerd in citraatbuffer en geëxtraheerd met een gelijk volume butaan-1-ol (Merck) bij kamertemperatuur onder krachtig roeren. De fasen werden gescheiden door centrifugeren bij 2.100×g gedurende 15 min bij 4 °C. De waterige fase (die LTA bevat) werd opgevangen en de extractieprocedure werd tweemaal herhaald met de organische fase plus interfase. De gecombineerde waterige fasen werden gevriesdroogd en vervolgens gedurende 5 dagen bij 4 °C gedialyseerd met 50 mM ammoniumacetaatbuffer (pH 4,7; membraan met een cut-off van 3,5 kDa); de buffer werd om de 24 uur ververst. De resulterende ruwe LTA werd verder gezuiverd door hydrofobe interactiechromatografie (HIC) op een HiPrep Octyl-Sepharose kolom (GE Healthcare; 16 × 100 mm, bedvolume 20 ml). Het ruwe LTA-materiaal werd opgelost in zo weinig mogelijk startbuffer (15% propaan-1-ol (Roth) in 0,1 M ammoniumacetaat (pH 4,7)) en bij 13.000×g gedurende 5 min bij kamertemperatuur gecentrifugeerd; het resulterende supernatant werd gevriesdroogd. De LTA-bevattende pellet werd opgelost in de HIC-startbuffer in een concentratie van 30 mg ml-1 en gezuiverd door HIC met behulp van een lineaire gradiënt van 15 tot 60% propaan-1-ol (Roth) in 0,1 M ammoniumacetaat (pH 4,7). LTA-bevattende fracties werden geïdentificeerd met een fotometrische fosfaattest47. De fosfaathoudende fracties werden gecombineerd, gevriesdroogd en na het vriesdrogen met water gewassen om resterende buffer te verwijderen.

Extractie en isolatie van WTA: De isolatie en extractie van WTA werd uitgevoerd zoals elders beschreven11 , maar met kleine wijzigingen. Pellet B (met de ruwe PGN-WTA complex), die ontstond tijdens LTA isolatie, werd geresuspendeerd in een concentratie van 10 mg ml-1 in 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) met 20 mM MgSO4. DNase A en RNase I werden toegevoegd tot eindconcentraties van respectievelijk 10 en 50 µg ml-1. De suspensie werd gedurende 2 uur bij 37 °C geroerd. Vervolgens werden 10 mM CaCl2 en trypsine (100 µg ml-1) toegevoegd en werd het roeren een nacht bij 37 °C voortgezet. SDS in een eindconcentratie van 1% werd toegevoegd en het mengsel werd gedurende 15 minuten bij 80 °C geïncubeerd om de enzymen te inactiveren. De celwand werd teruggewonnen door centrifugatie gedurende 45 minuten bij 130.000×g bij 25 °C. De resulterende pellet werd geresuspendeerd in 0,8 ml 8 M LiCl per 1 ml oorspronkelijk gebruikte Tris-HCl-oplossing en gedurende 15 min bij 37 °C geïncubeerd. Na nog een centrifugatie onder dezelfde omstandigheden als hierboven werd de pellet geresuspendeerd in 1 ml 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, pH 7,0) per ml van de oorspronkelijk gebruikte Tris-HCl-oplossing en werd dit monster gedurende 15 min. bij 37 °C geïncubeerd. De pellet werd tweemaal met water gewassen. Tenslotte werd de pellet geresuspendeerd in 2-4 ml water en gevriesdroogd, waardoor het gezuiverde PGN-WTA complex werd verkregen. Afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag werden vervolgens verdere chemische of enzymatische behandelingen uitgevoerd.

Chemische en enzymatische behandelingen

Hydrazinebehandeling van LTA: Gezuiverd LTA werd in een concentratie van 5 µg µl-1 opgelost in watervrij hydrazine (N2H4; ICN Biomedicals) voor incubatie gedurende 1 uur bij 37 °C terwijl werd geroerd. De reactie werd geblust door toevoeging van hetzelfde volume aceton en gedroogd onder een stikstofstroom; de droogstap werd tweemaal herhaald. Vervolgens werd het ruwe gede-O-geacyleerde LTA gezuiverd door gelpermeatiechromatografie (GPC) op een Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; kolomgrootte: 1,5 × 120 cm; buffer: 150 mM ammoniumacetaat (pH 4,7)) kolom.

Enzymatische digestie van het PGN-WTA complex: Om alle aminozuren uit het PGN te verwijderen, werd het PGN-WTA complex opgelost in 50 mM Tris-HCl (pH 7,0; 10 mg ml-1) en behandeld met de pneumokokken LytA amidase zoals elders beschreven11. Recombinant His-tagged LytA amidase (10 µg LytA per mg) werd toegevoegd in drie aliquots na 0, 24, en 48 uur voor een totale incubatieperiode van 72 uur bij 37 ° C. Vervolgens werd het enzym geïnactiveerd door het gedurende 5 min bij 100 °C te koken. Na centrifugatie (25.000×g, 15 min, 20 °C) werd het supernatant verzameld en gevriesdroogd. Het ruwe LytA-behandelde PGN-WTA-complex werd verder gezuiverd door GPC op een Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; kolomgrootte: 1,5 × 120 cm; buffer: 150 mM ammoniumacetaat (pH 4,7)). Het verkregen materiaal met een hoog molecuulgewicht (~12 mg) werd verder gedigesteerd met lysozym (200 µg; Sigma) en mutanolysine (200 µg; Sigma) in een reactiemengsel van 800 µl dat natriumfosfaat (20 mM; pH 4,8) en natriumazide (0,02%) bevatte, gedurende een nacht bij 37 °C. De enzymen werden geïnactiveerd door verhitting bij 100 °C gedurende 5 minuten. Het oplosbare materiaal werd teruggewonnen door centrifugeren (18.000×g, 10 min, 20 °C) en gelyofiliseerd. Isolatie van de pnWTA gebonden aan kleine PGN fragmenten werd bereikt door een laatste GPC met behulp van de hierboven genoemde voorwaarden.

NMR spectroscopie

NMR spectroscopische metingen werden uitgevoerd in D2O bij 300 K op een Bruker AvanceIII 700 MHz (uitgerust met een inverse 5 mm quadruple-resonantie Z-grad cryoprobe). De geuteriseerde oplosmiddelen werden aangekocht bij Deutero GmbH (Kastellaun, Duitsland). Aceton is gebruikt als externe standaard voor het ijken van 1H (δH 2,225) en 13C (δC 30,89) NMR spectra. 31P NMR spectra (δP 0,0) werden gekalibreerd met 85% fosforzuur in D2O als een externe standaard. 1H NMR toewijzingen werden bevestigd door tweedimensionale 1H, 1H COSY en TOCSY experimenten, en 13C NMR toewijzingen werden aangegeven door tweedimensionale 1H, 13C HSQC, gebaseerd op de 1H NMR toewijzingen. Interresiduele connectiviteit en verder bewijs voor 13C toewijzing werden verkregen uit twee-dimensionale 1H, 13C HMBC en 1H, 13C HSQC-TOCSY experimenten. Fosfaatgroep connectiviteit werd toegewezen door twee-dimensionale 1H, 31P HMQC en 1H, 31P HMQC-TOCSY. Alle gegevens werden verkregen en verwerkt met behulp van Bruker TOPSIN V 3.0 of hoger.

Massaspectrometrie

Om de pnWTA gebonden aan kleine PGN fragmenten te analyseren, electrospray ionisatie fourier-transformatie ion cyclotron resonantie massaspectrometrie (ESI-FT-ICR-MS) werd uitgevoerd op een 7 Tesla APEX Qe instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Duitsland) met behulp van negatieve-ion mode en een water/propaan-2-ol/7 M triethylamine/azijnzuur mengsel (50:50:0.06:0.02 v/v/v) als oplosmiddel, zoals eerder beschreven6. MS-analyse van met hydrazine behandeld LTA werd uitgevoerd op een Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Duitsland) in negatieve-ionen-modus met gebruikmaking van hetzelfde oplosmiddel. Een Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) ionenbron werd gebruikt met een sproeispanning ingesteld op -1,1 kV. De massaschaal werd extern gekalibreerd met glycolipiden van bekende structuur, en alle spectra werden gedeconvolueerd. De gegeven massagetallen verwijzen naar de monoisotopische massa van de neutrale moleculen.

Elektronenmicroscopie

Veldemissie-scanning-elektronenmicroscopie: bacteriën werden gefixeerd in het groeimedium met 5% formaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde gedurende 1 uur op ijs en gewassen met HEPES-buffer (HEPES 0,1 M, 0,09 M sucrose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Een aliquot van 50 µl van de gefixeerde bacteriële oplossing werd op met poly-l-lysine gecoate dekglaasjes geplaatst en gedurende 10 min. tot rust laten komen. Na fixatie met 2% glutaaraldehyde in PBS gedurende 5 min bij kamertemperatuur, werden de dekglaasjes gewassen met TE-buffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9) alvorens te ontwateren in een trapsgewijze reeks aceton (10, 30, 50, 70, 90, en 100%) op ijs gedurende 10 min voor elke stap. Monsters in de 100% aceton stap werden toegestaan om kamertemperatuur te bereiken voordat een andere verandering in 100% aceton vóór kritische-punt drogen met vloeibare CO2 (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Gedroogde monsters werden bedekt met een palladium-goud film door sputter coating (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) voor onderzoek in een veldemissie scanning elektronenmicroscoop Zeiss Merlin (Oberkochen, Duitsland) met behulp van de HESE2 Everhart Thornley SE detector en de in-lens SE detector in een 25:75 verhouding bij een versnelspanning van 5 kV.

Transmissie-elektronenmicroscopie: bacteriën werden gefixeerd zoals hierboven en verder gefixeerd met osmiumtetroxide (1% in HEPES-buffer) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na het wassen met HEPES-buffer werden de monsters gedehydrateerd met 10, 30 en 50% aceton op ijs alvorens te worden geïncubeerd in 70% aceton met 2% uranylacetaat gedurende een nacht bij 7 °C. De monsters werden verder gedehydrateerd met 90 en 100% aceton op ijs, op kamertemperatuur gebracht en verder gedehydrateerd met 100% aceton, en vervolgens overgebracht in 100% ethanol. Vervolgens werden de monsters geïnfiltreerd met de aromatische acrylaathars LRWhite. Na polymerisatie gedurende 2 dagen bij 50 °C werden ultradunne coupes gesneden met een diamanten mes, verzameld op butvar-gecoate 3000 mesh roosters, en gedurende 3 minuten tegengekleurd met 4% waterig uranylacetaat. Monsters werden afgebeeld in een Zeiss TEM 910 bij een versnelspanning van 80 kV en bij gekalibreerde vergrotingen.

Contrast en helderheid werden aangepast met Adobe Photoshop CS3.

Generatie van antilichamen

Polyclonale antilichamen tegen geanalyseerde CBP’s werden opgewekt bij muizen met behulp van routinematige immunisatie protocollen. CD-1 muizen werden intraperitoneaal geïmmuniseerd met 20 µg recombinant eiwit en Freund’s incomplete adjuvans (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) (50:50 v/v). Op dag 14 en 28 werden de muizen versterkt met 20 µg eiwit en Freund’s incomplete adjuvans (50:50 v/v). Op dag 42 werden de muizen gebloed en polyklonale IgG werden gezuiverd uit serum met behulp van proteïne A-Sefarose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland). Antilichamen zijn vermeld in aanvullende tabel 2.

Flowcytometrie

S. pneumoniae D39 wild type, zijn isogene tacL mutant, en de aangevulde mutant werden gekweekt in THY medium tot mid-log fase, geoogst bij 3.275×g gedurende 6 min, en gewassen met PBS (pH 7,4). Voor kwantificering van het capsulegehalte werd een 100 µl suspensie met 4 × 108 bacteriën geïncubeerd met anti-capsule polysaccharide antisera (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 in PBS) gedurende 30-45 min bij 37 °C en 5% CO2 in 96-well platen (U-bodem, Greiner Bio-One). Na het wassen werden de monsters geïncubeerd met een secundair geit anti-rabbit IgG-gekoppeld Alexa488-gelabeld antilichaam (Invitrogen) (1:500 in PBS, 30-45 min, 37 ° C). Na het wassen met PBS, werden bacteriën gefixeerd met 1% formaldehyde overnacht bij 4 ° C.

De overvloed van CBP’s, alsmede de hoeveelheid teichoïnezuren in niet-ingekapselde D39 wild-type, mutant en aangevuld stammen werden gemeten door flowcytometrie na fixatie met 1% formaldehyde gedurende 1 uur bij 4 ° C. Tweehonderd µl suspensies met 8 × 108 bacteriën werden geïncubeerd met specifieke polyklonale antilichamen tegen verschillende CBP’s (1:500 in PBS), of voor de kwantificering van TA’s met antilichamen tegen P-Cho (TEPC-15) of Forssman-antigeen (15 min. bij 37 °C en 5% CO2) in 96-wells-platen (U-bodem, Greiner Bio-One). Na het wassen werden de monsters geïncubeerd met een secundair geit anti-IgG-gekoppeld Alexa488-gelabeld antilichaam (Invitrogen) (15 min., 37 °C). Fluorescentie werd bepaald met behulp van een FACS Calibur ™ (BD Biosciences).

Immunoblot analyse

S. pneumoniae D39, de isogene tacL-mutant, en de aangevulde mutant werden gekweekt in THY-medium tot een A 600 van 0,35-0,45 werd bereikt, geoogst door centrifugatie bij 3270×g bij 4 ° C gedurende 6 min, en geresuspendeerd in 1 ml PBS-buffer bij pH 7,4. In totaal werden 2 × 108 cellen per well geladen en op een 12% SDS-PAGE gerund alvorens te worden overgebracht op een nitrocellulosemembraan door middel van semidry blotting. De membranen werden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk (Roth) en Tris gebufferde zoutoplossing (TBS; pH 7,4) en ’s nachts bij 4 °C geïncubeerd met muis-polyklonale antilichamen tegen verschillende CBP’s (1:500 in 5% magere melk + TBS 0,01% Tween (T-TBS)). Een konijn-polyklonaal antilichaam tegen enolase (1:25.000 in 5% afgeroomde melk + T-TBS) werd gebruikt als laadcontrole. De membranen werden gewassen met T-TBS, CBP’s werden gedetecteerd met de secundaire, met fluorescentie gelabelde IRDye® 800CW. Geit α-muis IgG en enolase werden gedetecteerd met de met fluorescentie gelabelde IRDye® 680RD. Geit α-rabbit IgG-antilichaam werd gedetecteerd door incubatie met het juiste antilichaam (1:15.000 in 5% afgeroomde melk in T-TBS) gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur; de membranen werden gewassen met T-TBS en ten slotte eenmaal met TBS. Het scannen van de membranen werd uitgevoerd met een Odyssey® CLx (LI-COR) scanner.

Triton X-100-geïnduceerde autolyse assay

S. pneumoniae D39 wild-type, mutant, en gecomplementeerde stam werden gekweekt in THY medium tot mid-log fase, geoogst bij 3275×g gedurende 6 min, en gewassen met PBS (pH 7,4). Een 1 ml suspensie met 1 × 109 bacteriën werd geïncubeerd met een eindconcentratie van 0,01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) en bij 37 °C geïncubeerd. De lysis van bacteriële cellen werd gecontroleerd door meting van de absorptie bij 600 nm op vooraf bepaalde tijdstippen.

Epitheliale adhesiebepaling

Pneumokokkenadhesie aan epitheelcellen werd geanalyseerd met menselijke A549-cellen (ATCC® CCl-185TM) zoals beschreven48. Kortom, confluente epitheelcellen, gekweekt op glas dekglaasjes (Hartenstein, in 24-well platen, ~ 1 × 105 cellen per putje) werden geïnoculeerd met 5 × 106 mid-exponentieel gegroeid pneumokokken en geïncubeerd in infectie medium (DMEM (HyClone ™) + 1% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS)) bij 37 ° C en 5% CO 2. Vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing die 1% FBS (Gibco) bevat om ongebonden bacteriën te verwijderen. Daarna werden bacteriën gefixeerd met PBS met 1% para-formaldehyde (PFA, Roth).

Immunofluorescentiemicroscopie

Gevixeerde pneumokokken, gebonden aan A549 cellen werden driemaal gewassen met PBS en geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met PBS + 10% FBS. Na het wassen werden de monsters geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een polyklonaal antilichaam (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) tegen pneumokokken (gegenereerd in konijn tegen warmte-geïnactiveerde S. pneumoniae TIGR4 en D39). Als secundair antilichaam werd fluorescentie-gelabeld Alexa-Fluor488 geit anti-rabbit antilichaam (Abcam) gebruikt (1:500, 1 uur, kamertemperatuur). Bacteriële hechting werd gecontroleerd voor ten minste 20 cellen per klasse dekglaasje met behulp van fluorescentiemicroscopie. Elk experiment werd driemaal in duplo herhaald. Alle gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde ± s.d. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de ongepaarde twee-tailed Student’s t-test. In alle analyses werd een p-waarde van <0,05 als statistisch significant beschouwd.

Phagocytose-experimenten

Antibiotische bescherming assay: Een confluente laag monocytische THP-1-cellen (ATCC® TIB-202TM), gekweekt in 24-wellsplaten (3 × 105 cellen per well in RPMI-1640 (HyClone™), aangevuld met 10% warmtegeïnactiveerd foetaal runderserum (FBS, Gibco)), werd gedifferentieerd tot fagocyten door toevoeging van 200 nmol ml-1 forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA, Sigma-Aldrich) en gedurende 48 uur geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2. Daarna werden THP-1-cellen gewassen met RPMI-1640 aangevuld met 10% warmtegeïnactiveerde FBS en geïncubeerd gedurende nog eens 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Voorafgaand aan infectie pneumokokken werden gekweekt in THY tot mid-log fase (A 600 = 0,35-0,45), gecentrifugeerd, en gewassen met infectie medium (RPMI-1640 aangevuld met 1% warmte-geïnactiveerd FBS). THP-1-cellen werden gewassen en geïnfecteerd met pneumokokken in 500 µl infectie medium. Infectie werd gesynchroniseerd door centrifugatie (2 min, 300×g) om een gelijktijdig contact tussen bacteriën en fagocyten te initiëren. Daarna werden de cellen gedurende verschillende perioden geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2. Na infectie werden de cellen gewassen met infectiemedium en geïncubeerd met penicilline G (100 eenheid ml-1, Sigma-Aldrich) en gentamicine (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2 om de extracellulaire bacteriën te doden. Vervolgens werden de fagocyten gewassen en gelyseerd met 1% saponine (Sigma-Aldrich) om intracellulaire pneumokokken vrij te geven. Kolonievormende eenheden (kve) van intracellulaire bacteriën werden bepaald door uitplating bacteriën in de juiste verdunningen op bloed agar platen (Oxoid) 49. Tijdsafhankelijke doden van intracellulaire pneumokokken werd geëvalueerd door het doden van extracellulaire pneumokokken met antibiotica zoals hierboven beschreven. Daarna werden fagocyten verder geïncubeerd in infectie medium voor verschillende tijdsperiodes (0-3 h). Intracellulaire bacteriële kve werden gecontroleerd zoals hierboven beschreven. Alle experimenten werden viermaal herhaald als duplicaten. Gegevens werden genormaliseerd in de antibiotica bescherming assays om de multipliciteit van infectie (MOI) of in de tijd-afhankelijke doden om herstelde bacteriën op tijdstip 0 h. Alle assays werden geanalyseerd met behulp van een-weg ANOVA met Bonferroni correctie.

Double immunofluorescentiekleuring en microscopie

PMA-gedifferentieerde THP-1-cellen (3 × 105 cellen per putje) werden gekweekt op steriele glazen dekglaasjes (12 mm, Hartenstein) en geïnfecteerd met pneumokokken zoals hierboven beschreven. Na infectie werden THP-1-cellen gewassen met infectie medium en gefixeerd met 4% para-formaldehyde (Roth) gedurende de nacht bij 4 ° C. Glazen dekglaasjes werden gewassen met PBS en geblokkeerd met PBS + 10% warmte-geïnactiveerde FBS gedurende 1 uur. Na het wassen werden extracellulaire bacteriën gekleurd met behulp van een polyklonale α-pneumokokken IgG (1:500) en een Alexa-Fluor488 gelabelde secundaire geit α-rabbit IgG (1:500, Abcam) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Glazen dekglaasjes werden driemaal gewassen met PBS na permeabilisatie van THP-1 cellen met 0,1% Triton X-100 in PBS (10 min, kamertemperatuur). Na het wassen werden intracellulaire pneumokokken gekleurd met behulp van een polyklonale α-pneumokokken IgG (1:500) en een secundaire Alexa-Fluor568 gelabelde geit α-rabbit IgG (1:500, Abcam) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Experimenten werden driemaal herhaald als duplicaten. Voor statistische analyse werden 50 cellen per glazen dekglaasje geanalyseerd op het aantal intracellulaire bacteriën. De gegevens werden genormaliseerd naar de MOI. Alle assays werden geanalyseerd met behulp van een-weg ANOVA met Bonferroni correctie. In alle analyses werd een p-waarde van <0,05 als statistisch significant beschouwd.

Cellijnen

Alle cellijnen die in deze studie werden gebruikt, werden aangekocht bij ATCC (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202) en zijn getest om mycoplasma-negatief te zijn door PCR en scanning-elektronenmicroscopie.

Acute longontsteking in muizen en systemische infectiemodel

Echte tot 10 weken oude vrouwelijke CD-1 muizen (outbred, Charles River, Sulzfeld, Duitsland) werden intranasaal geïnfecteerd met bioluminescente pneumokokken zoals onlangs beschreven50. Kort gezegd werden pneumokokken gekweekt tot mid-exponentiële fase (A 600 = 0,35) in THY medium met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum. Na centrifugatie werd de infectie dosis (20 µl) aangepast tot ~ 2,5 x 107 kve in PBS (pH 7,4). Voor nasale infectie, werden muizen verdoofd door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Duitsland; Rompun, Provet AG, Lyssach, Duitsland), en bacteriën werden druppelsgewijs toegediend in de neusgaten. De kve van de infectiedosis werd bevestigd door uitplating van seriële verdunningen van het inoculum op bloedagarplaten. Muizen werden gecontroleerd op overleving en belicht voor bioluminescentie op vooraf gekozen intervallen met behulp van de IVIS ® Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA). Voor het systemische infectiemodel werd een infectiedosis van 3 × 103 kve intraperitoneaal toegediend in een volume van 200 µl PBS (pH 7,4). Alle dierexperimenten werden uitgevoerd volgens de Duitse voorschriften van de Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) en de Europese Gezondheidswet van de Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Alle experimenten werden goedgekeurd door het Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Duitsland, vergunning nr. 7221.3-1-056/16-1).

Beschikbaarheid van gegevens

Gewone FASTQ-bestanden met S. pneumoniae genomische sequentiegegevens werden ingediend bij het EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) en opgeslagen in het Short Read Archive (SRA) onder het studietoetredingsnummer RJEB18558. Alle andere relevante gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van de studie zijn beschikbaar in dit artikel en de aanvullende informatie bestanden, of van de corresponderende auteurs op aanvraag.