Figuur 12.2.

Microbiële EPS’s worden gewoonlijk geproduceerd in aerobe, ondergedompelde fermentatiesystemen. Fermentatieomstandigheden, zoals beluchting, agitatie, pH, opgeloste zuurstofconcentratie, temperatuur, mediumsamenstelling en bioreactorontwerp, kunnen bepalend zijn voor de kenmerken van het product en het productierendement. Vandaar dat om een hoge productiekwaliteit en -opbrengst te bereiken uitgebreide optimalisatie van deze parameters moet worden uitgevoerd voor elk organisme (Öner et al., 2016). Srikanth et al. (2015) onderzochten bijvoorbeeld de effecten van fermentatieparameters, waaronder initiële pH, levan-suppletie, sucroseconcentratie, stikstofbron, inoculumconcentratie en kweektijd op de levan-synthese met Acetobacter xylinum NCIM2526 als de productiestam. De optimale condities werden bepaald op respectievelijk 10, 50-60 en 1,49 g/L voor stikstof, sacharose en inoculum. De levanopbrengst nam aanzienlijk toe na de eerste 24 uur en de maximale levanproductiviteit werd verkregen na 122 uur wanneer de aanvankelijke pH werd ingesteld op 6,8. Verhoging van de aanvankelijke toevoeging van levan van 0,1 tot 0,4 g/L verhoogde de opbrengst van levan van 1,22 tot 1,65 g/L; alles boven 0,4 g/L had geen verdere toename van de opbrengst tot gevolg. Inoculumconcentraties tussen 5% (v/v) en 10% (v/v) leidden tot een verandering in de levanopbrengst zoals verwacht en een maximumopbrengst (1,46 g/L) werd bereikt bij 7% (v/v). Sucroseconcentraties van 20 tot 80 g/L beïnvloedden de levanopbrengst. In het 40-50 g/L bereik werd de productieopbrengst verhoogd, in het 70-80 g/L bereik werd deze verlaagd, en in het 20-40 g/L bereik werd deze niet veranderd.

Sarilmiser et al. (2015) onderzochten de productie van levan in een halofiel micro-organisme (Halomonas smyrnensis AAD6T) met behulp van verschillende stimulerende factoren. Zo werden verschillende voedingsstrategieën toegepast met verschillende tijdsintervallen in een batch-bioreactorsysteem, en werden meerdere initiële condities getest in shakeculturen. Onder de verschillende geteste pH- en sacharoseconcentraties werd de maximale levanopbrengst bereikt bij pH 7 (1,345 g/L levan) en 50 g/L sacharose (1,320 g/L levan). Wanneer stikstof- en fosforbeperkingen werden toegepast, daalden zowel de levanconcentratie als de biomassa, terwijl de Yp/x-waarden stegen. Stikstofpulsstrategieën verminderden de levan-synthese als gevolg van de verlengde groeiperiode, sucrosepulsstrategieën verbeterden de celgroei en de levan-productie aanzienlijk, en NaCl-puls had geen invloed op de groei. Interessant is dat culturen gekweekt in de aanwezigheid van boorzuur de hoogste concentraties levan (8,84 g/L) produceerden in gecontroleerde bioreactoromstandigheden. Deze verbetering werd verklaard door het biologische fenomeen bekend als quorum sensing (QS), waarbij booratomen betrokken zijn; een van de signaalmoleculen betrokken bij QS in H. smyrnensis AAD6T werd later geïdentificeerd als een C16-acylhomoserinelacton (Abbamondi et al., 2016).

Het molecuulgewicht van levan is een beslissende factor voor de toepasbaarheid ervan in verschillende industrieën, waaronder de voedingsmiddelen-, cosmetische en medische industrie (Belghith et al., 1996). Het bepalen van de geoptimaliseerde omstandigheden voor de productie van levan is van vitaal belang voor het verkrijgen van de gewenste verbinding met moleculair gewicht (Porras-Domínguez et al., 2015). Wu et al. (2013) evalueerden bijvoorbeeld subtiele wijzigingen in het productieproces om verschillende molecuulgewichten van levan te verkrijgen in batch- en fed-batchsystemen, met Bacillus subtilis (natto) Takahashi als de productiestam. Wanneer hoge (400 g/L) en lage (20 g/L) concentraties sacharose werden toegepast, werden respectievelijk lagere en hogere molecuulgewichten van levan verkregen. Dit lineaire verband werd toegeschreven aan het effect van sucrose op het levansucrase-enzym. De auteurs concludeerden dat het molecuulgewicht van levan afhing van de reactieomstandigheden, zoals pH, temperatuur, agitatiesnelheid en sucrose, waarbij de laatste de meest effectieve factor was die het molecuulgewicht van levan bepaalde.

Levanproductie in geïmmobiliseerde celsystemen is ook voordelig omdat dergelijke systemen profiteren van relatief gemakkelijke downstreamprocessen, hoge volumetrische productiviteit, geavanceerde procescontrole en verminderd besmettingsrisico bij EPS-productie (Ürküt et al., 2007). Implementatie van deze gunstige methode voor levan productie kan worden gebruikt een alternatief voor batch, fed-batch, en continue processen (Öner et al., 2016). Bijvoorbeeld, Silbir et al. (2014) testten de levanproductie in batch- en continue fermentatiesystemen met behulp van Zymomonas mobilis B-14023. Continue fermentatie producties werden uitgevoerd in een packed-bed bioreactor met behulp van Ca-alginaat geïmmobiliseerde cellen. Incubatietijd, initiële pH en substraatconcentratie waren de drie belangrijkste procesvariabelen voor de productie van levan in batch-systemen. De hoogste hoeveelheid levan (40.2 g/L) werd geproduceerd wanneer gistextract gebruikt werd als de organische stikstofbron in shake-flask culturen. Bovendien werden geïmmobiliseerde Z. mobilis-cellen in het continue fermentatiesysteem met succes toegepast voor de productie van levan. Oncontroleerbare dalingen in de systeemdruk en verstoring van Ca-alginaat gelkorrels waren de voornaamste beperkingen voor langere fermentatietijden.

Ondanks de diversiteit van levan-producerende micro-organismen blijven de productiekosten voor levan polysaccharide hoog. Dit is waarschijnlijk het grootste knelpunt in de commercialisering ervan (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Fermentatiemedia vertegenwoordigen ongeveer 50% van de productiekosten voor een microbieel proces (Van Hoek et al., 2003); eerder werden echter goedkope koolstofbronnen, zoals siropen en melasse, gebruikt voor microbiële levanproductie (Özcan en Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) onderzochten suikerbietmelasse en zetmeelmelasse als sucrosevervangers in Halomonas-culturen. Klaring, pH, zwavelzuur, tricalciumfosfaat en actieve kool voorbehandelingen werden in verschillende combinaties gebruikt om de chemische beschikbaarheid voor de productie van levan aan te passen. Er werd geconcludeerd dat de maximale levan-opbrengst werd bereikt bij een TCPHAC-concentratie van 10 g/L, respectievelijk 4,19 en 3,68 g/L. Bij gebruik van 30 g/L TCPHAC en HAC werden levanopbrengsten van 7,56 en 4,44 g/L bereikt. Het verwijderen van zware metalen en het verhogen van de ijzerconcentratie resulteerden in deze studie in een afname van de celintegriteit en de levanopbrengst. In andere studies werden zwarte stroop suikerrietmelasse in Bacillus lentus V8-culturen (Abou-Taleb et al., 2015), dadelstroop in Mycobacterium levaniformis 1406-culturen (Moosavi-Nasab et al, 2010), suikerbietmelasse in Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475-culturen (Han en Watson, 1992), en suikerrietmelasse en -stroop in Z. mobilis ATCC 31821-culturen (De Oliveira et al, 2007) werden onderzocht als goedkope koolstofbronnen voor de productie van levans.

Levan biosynthese in ondergedompelde fermentatiesystemen worden beperkt door de eis van cellulaire groei die mogelijk niet voldoet aan de optimale omstandigheden voor een hoge levansucrase activiteit (Santos-Moriano et al., 2015). Celvrije systemen nemen deze beperking echter weg en bieden extra voordelen, zoals gemakkelijke bereiding, herbruikbaarheid en controle over veranderingen in de micro-omgeving (Jang et al., 2001). Om deze reden, het aanbieden van een optimale omgeving voor levansucrase is van cruciaal belang. Lu et al. (2014) onderzochten bijvoorbeeld de invloed van verschillende factoren, zoals substraatconcentratie, reactietijd, temperatuur en pH op de productie van levansucrase met behulp van recombinant levansucrase in een celvrij systeem. Zij observeerden een maximale opbrengst van levan (7,1 g/L) met behulp van 0,8 M sucrose, pH 6,5 en 40°C gedurende 24 uur. De opbrengst van levan nam parallel toe met een toename van de sucroseconcentratie van 0 tot 0,8 M. Hun studie toonde aan dat het recombinante enzym vergelijkbare biochemische eigenschappen vertoont als het natieve enzym.