Biological Assays of Bradykinin and Related Kinins
Kinines zijn krachtige bloeddrukverlagende middelen in alle onderzochte diersoorten (54). De meest gebruikte in vivo test voor deze peptiden is de bloeddruk in ratten, die eerder is beschreven. De vasodilaterende effecten van kinines worden gemeten in geïsoleerde geperfundeerde organen met intact endotheel, volgens de in Sectie IV beschreven procedure. De relaxerende werking van kinines in arteriële vaten wordt in vitro beoordeeld in de halsslagader van de hond (57) volgens de methode die is beschreven door Regoli en Barabé (34). Het venoconstrictor effect wordt in vitro gemeten in de halsader van een konijn (42), volgens de hieronder beschreven procedure.
De aders, afkomstig van konijnen (1,0-2,0 kg), worden in spiraalvormige stroken van 2 mm breed en 2 cm lang gesneden en opgehangen in Krebs-oplossing (zuurstofrijk bij 37°C) met een inhibitor van het omzettingsenzym (Captopril, 10 μM) om de afbraak van kinine te voorkomen (34). De samentrekkingen van het weefsel als reactie op kinines worden geregistreerd zoals eerder beschreven en meestal worden volledige concentratie-respons curven gemeten om de affiniteit van kinines en hun antagonisten te evalueren. Aangetoond is dat de halsader van het konijn een B2-receptorsubtype (B2A) bevat (tabel V).
Het meest gebruikte niet-vasculaire preparaat is het ileum van de cavia, dat wordt genomen bij cavia’s van 250-350 g en geprepareerd als een longitudinale gladde spierstrook, volgens Rang (37). Het weefsel wordt in vitro gesuspendeerd in Krebs-oplossing (zuurstofgehalte 37 °C) en de spanningsveranderingen worden gemeten zoals hierboven beschreven voor de geïsoleerde vaten (zie deel I). Het ileum van het cavia is het preparaat dat wordt gebruikt om het B2B-receptorsubtype te karakteriseren (tabel V).
B1-receptoren worden bestudeerd met behulp van de strook aorta van het konijn, die op dezelfde wijze wordt geprepareerd en behandeld als voor angiotensine. Het weefsel is vrijwel ongevoelig voor kinines, in het bijzonder voor desArg9BK, de Bt-receptor agonist, aan het begin van het experiment. De gevoeligheid van het weefsel neemt toe na enkele uren (tot 6-10 uur) incubatie, wanneer de B1-receptoren de novo worden gevormd (55). De contractiele effecten van de kinines worden geregistreerd en geanalyseerd met dezelfde instrumenten en benaderingen beschreven in deel I voor angiotensine. Weefsels van konijnen kunnen worden gesensibiliseerd voor desArg9BK door voorbehandeling van de dieren met lipopolysaccharide (LPS), die intraveneus wordt geïnjecteerd 5 uur voor het doden van het dier (56). Het mechanisme van B1 receptor generatie door LPS is onderzocht (60, 61). Aorta’s en andere weefsels afkomstig van met LPS behandelde konijnen reageren op desArg9BK vanaf het begin van de incubatie in vitro (56). Evenzo brengen hondennierslagaders spontaan B1-receptoren tot expressie en vertonen zij een hoge gevoeligheid voor desArg9BK (62).
Er zijn verschillende verbindingen gebruikt om kininereceptoren in geïsoleerde organen te karakteriseren aan de hand van de biologische reacties (contractiel) van drie preparaten (tabel V). Bradykininen en kallidine zijn krachtige stimulerende stoffen voor de jugulaire ader van het konijn (RJV) en het ileum van een cavia (GPI), terwijl desArg9BK en Lys,desArg9BK inactief zijn. De omgekeerde volgorde van werkzaamheid wordt waargenomen in de aorta (RA) van het konijn. desArg9BK is alleen in de RA een antagonist. Op deze basis stelden Regoli en Barabé (54) de hypothese van twee kininereceptoren voor, de B1 (RA) en de B2 (RJV, GPI en vele andere preparaten en tests), die aanvankelijk alleen met agonisten gekarakteriseerd werden (54) en later (zie hieronder) met antagonisten gekarakteriseerd werden. B2 receptor antagonisten werden geïdentificeerd door Vavrek en Stewart (63) en vervolgens verbeterd door verschillende onderzoekers (64-66) door de vervanging van Pro3 door hydroxyproline (Hyp), door de toevoeging van een d-Arg aan de N terminus, door de vervanging van Phe8 door Leu, en door de vervanging van de dipeptide Pro7-Phe8 door d-Tic-Oic (67-69). Een prototype van elke antagonistenserie is gerapporteerd in tabel V om aan te geven dat b-2-thienyl-elanine (Thi) niet nodig is op posities 5 en 9, terwijl Hyp3 en d-Arg0 belangrijk zijn voor de affiniteit, met name op de RJV. De substitutie van Phe8 door Leu, toegevoegd aan de andere modificaties, leidt tot d-ArgBK, dat (a) vrijwel geen agonistische activiteit heeft, en (b) actief is op de RJV, minder actief op de GPI, en tamelijk slecht op de RA (B1), en dus tamelijk selectief is voor de B2-site. Het verschil tussen de pA2-waarden (met twee log-eenheden) tussen de RJV en de GPI is een doorslaggevende bevinding voor de voorgestelde (Tabel V) onderverdeling van B2-receptoren in B2A (RJV) en B2B (GPI). D-ArgBK is een competitieve antagonist, snel omkeerbaar zowel in vivo als in vitro en verschilt van Hoe 140, die niet-competitief (niet-equilibrium) is, waarschijnlijk omdat het een langdurige interactie heeft met zowel de B2A als B2B sites (59, 67, 68, 70). Het onderscheid tussen B2A en B2B wordt ondersteund door de resultaten verkregen met de twee laatste verbindingen (Tabel V), die verschillen door het residu op de derde positie. De aanwezigheid van Hyp bevordert het antagonisme (pA2 7,6) op B2A en de gedeeltelijke agonistische activiteit op B2B, terwijl Tyr3 een krachtige agonist op B2A en een vrij goede antagonist (zuivere antagonist) op B2B geeft. Deze nieuwe classificatie is gepresenteerd in een overzichtsartikel (71). De functionele plaatsen van kinine zijn dus B, en B2 (twee subtypes worden overwogen). Verscheidene andere receptoren (B3, B4, en B5) zijn voorgesteld (72-74), maar hun bestaan is niet aangetoond met solide experimentele gegevens (zie kritisch overzicht in Ref. 59). De kinine-geïnduceerde histamine-afgifte door rattenperitoneale mastocyten is een niet-specifiek verschijnsel dat wordt toegeschreven aan het kationische karakter van de kinines (75, 76).