Dieren

Alle muizen waren 3-11-maanden oude C57BL/6 mannetjes op het moment van testen. Muizen werden gekocht van Jackson laboratoria, gehuisvest in een temperatuur (22 ° C) en licht-gecontroleerde faciliteit, en kregen vrije toegang tot voedsel en water. Muizen werden geëuthanaseerd met een overdosis isofluraan. Alle dierprocedures en het gebruik ervan werden goedgekeurd door de Institutional Review Committee aan de East Carolina University. Animal zorg in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, Institute of Laboratory Animal Resources, Commissie voor biowetenschappen, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996).

FDB dissectie

Kritisch voor elke procedure met behulp van de FDB is zorgvuldig dissectie die schade aan de spier (de spier is omgeven door een gebied van dicht bindweefsel) voorkomt (zie Fig. 1). Om de dissectie te vergemakkelijken, werden de tenen vastgepind op een kurkplaat, waarbij de voet op zijn plaats werd gehouden met de zool van de voet naar boven gericht. Vervolgens werd de huid aan het proximale uiteinde van de voet (boven de calcaneus) afgekneld, zodat met een microschaar insnijdingen konden worden gemaakt langs de laterale randen van de voet tot aan de tenen. Terwijl de huid boven de calcaneus nog steeds werd samengeknepen, werd met een microschaar de huid van de onderliggende musculatuur gescheiden. De resterende huidflap werd teruggetrokken en verwijderd om de FDB en de pezen van de tenen bloot te leggen. De proximale pees werd doorgesneden, en terwijl de pees met een tang werd vastgehouden, werd de FDB van de onderliggende fascia weggesneden. De pezen van de tenen werden vervolgens doorgesneden om de FDB vrij te maken van de voet.

Myofiber isolatie

Na dissectie van de FDB, werden de spieren geplaatst in verse cultuur media (DMEM met glutamine, 2% steriel gefilterd FBS, 0.1% gentamycine) aangevuld met 4 mg/ml collagenase A (Roche – 11088793001) gedurende 90-120 min bij 37 °C in 5% CO2 zoals eerder beschreven . De FDB spier werd geplaatst in 2 mL van cultuur media zonder collagenase en voorzichtig triturated tegen de wand van de schotel aan de vezels vrij te geven uit de bundel met behulp van het afgesneden uiteinde van een P1000 pipetpunt. Geïsoleerde myofibers werden vastgehecht aan glazen bodem gerechten die waren gecoat met entactine-collageen-laminine (ECL-celhechtmatrix, # 08110 Millipore). Vezels werden teruggebracht naar 37 ° C in 5% CO2 gedurende enkele uren en vervolgens afgebeeld zoals hieronder beschreven.

FDB spiervezel lengte

De FDB spieren van mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6 muizen werden gebonden aan de proximale pees en drie mediale teen pezen met zijden hechtdraad en vastgemaakt aan een metalen clip om rustspanning te behouden. Myofibers werden geïsoleerd zoals hierboven beschreven, maar werden niet vastgekleefd aan glas bodemplaten. Myofibers werden afgebeeld met behulp van een × 4 objectief en een EVOS XL kernmicroscoop en bijbehorende software (Life Technologies, Bothell, WA). De lengtes van ongeveer 1000 myofibers werden gemeten in ImageJ (versie 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Wanneer geïsoleerd, de myofibers waren niet langer op spanning en daarom niet vertegenwoordigen optimale lengte. Om rekening te houden voor deze verandering in myofiber lengte, werd een conversiefactor gebruikt met behulp van sarcomeer lengte, zoals eerder beschreven door Dr Richard Lieber . Wanneer op optimale lengte, de veronderstelde muis spieren optimale sarcomeer lengte van een myofiber is 2,5 pm over . Om myofiber lengtes te normaliseren naar sarcomeer lengte, hebben we gemeten sarcomeer lengte in een subset van 30 myofibers. De afstand tussen 10 sarcomeren van elke myofiber werd gemeten, en een gemiddelde sarcomeer lengte werd berekend over alle 30 myofibers. De optimale sarcomeer lengte (2,5 pm) gedeeld door de gemiddelde gemeten sarcomeer lengte produceerde een conversiefactor van 1,14, die werd gebruikt om alle gemeten myofiber lengtes te normaliseren tot optimale sarcomeer length.

Individuele vezeltype en vezel size

Spiervezeltype analyse van de FDB werd uitgevoerd op monsters van C57BL / 6 muizen, zoals eerder beschreven. Secties werden gesondeerd met primaire antilichamen tegen myosine zware keten type I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa), en anti-dystrofine (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), vervolgens belicht met behulp van een EVOS FL auto microscoop en bijbehorende software (Life Technologies, Bothell, WA). Vezeltype en vezeldoorsnede (CSA) werden beoordeeld met ImageJ, zoals eerder beschreven.

Isometrische krachtproductie

Isometrische krachtproductie en vermoeidheid werd beoordeeld in EDL (n = 5), soleus (n = 4), en FDB (n = 6) spieren van C57BL / 6 muizen, zoals eerder beschreven met kleine wijzigingen. De FDB werd blootgesteld en de proximale pees werd beveiligd met zijden hechtdraad. Fine-tip tang werden geplaatst onder de drie mediale teen pezen en voorzichtig naar beneden getrokken in de richting van de tenen voordat de drie pezen (afb. 1) werden beveiligd met zijden hechtdraad. We bonden de drie mediale pezen, omdat het niet mogelijk is om een van de tenen te binden als gevolg van anatomische locatie, en het binden van de vierde pees niet, in onze ervaring, resulteert in een andere absolute kracht (gegevens niet weergegeven). Elke pees werd vervolgens net boven de knoop doorgesneden, en de FDB werd voorzichtig van de voet weggetild. Microscharen werden gebruikt om eventueel resterend bindweefsel te verwijderen en los te maken van de voet. De spier werd vervolgens vastgebonden aan een krachtopnemer en opgehangen in zuurstofrijk Krebs Ringer Buffer (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) bij kamertemperatuur. De spierlengte werd vervolgens aangepast totdat de FDB produceerde een piek twitch kracht, op welk punt de optimale rustspanning (Lo) werd ingesteld en de spier werd toegestaan om te equilibreren gedurende 10 min. Soleus spieren werden voorbereid door het binden van een dubbele vierkante knoop aan de distale soleus pees. De pees werd gesneden boven de knoop en de achterste spieren werden voorzichtig weggetrokken uit de buurt van het been waaruit de proximale soleus pees, die werd gebonden met een dubbele vierkante knoop. De EDL werd ontleed en gebonden zoals eerder beschreven. EDL en soleus spieren werden geëquilibreerd in zuurstofrijke kamertemperatuur KRB bij rustspanning gedurende 10 minuten. Na evenwicht, werd de spierspanning geoptimaliseerd door het uitvoeren van maximale twitch stimulaties en het aanpassen van de spierlengte tot de piekkracht werd bereikt. Twitch stimulaties werden uitgevoerd 30 s uit elkaar om te voorkomen dat vermoeidheid van de spier. Vervolgens werden de spieren met een tussenpoos van 60 s gestimuleerd bij 10, 20, 40, 60, 80, 100 en 120 Hz om een krachtfrequentiecurve te genereren. Spieren werden rust gedurende een extra 1 min voor het invullen van een 10-min stimulatie protocol om vermoeidheid weerstand te bepalen. De vermoeidheid protocol gestimuleerd spieren bij 30 Hz om de 2 s voor een periode van 600 s voor een totaal van 300 contracties. Optimale spierlengte werd geregistreerd en spieren werden gevlokt om overtollige KRB verwijderen alvorens te worden gewogen. Een optimale spanning van 20 V werd vastgesteld voorafgaand aan de experimenten om maximale stimulatie van de FDB, EDL, en soleus (data niet weergegeven) te garanderen. Absolute spierkracht gegevens werden omgezet naar specifieke kracht (N / cm 2) met behulp van eerder beschreven vergelijkingen voor de wiskundige schatting van de spier CSA en fysiologische dwarsdoorsnede (PCSA) . Het belangrijkste verschil tussen CSA en PCSA is de opname van de spier vezel lengte tot spier lengte verhouding in de PCSA vergelijking. We gebruikten beide gecorrigeerde methoden om een bredere compatibiliteit met de literatuur te bieden.

Passieve contractiele eigenschappen

Passieve contractiele eigenschappen werden beoordeeld in EDL en FDB spieren van C57BL / 6 mannelijke muizen (n = 4), zoals eerder beschreven , met kleine wijzigingen. De EDL en FDB spieren ontleed en gebonden aan een krachtopnemer zoals hierboven beschreven. Spieren werden gedurende 10 minuten in zuurstofrijke KRB bij kamertemperatuur geëquilibreerd. Na equilibratie, werd de spierspanning geoptimaliseerd door het uitvoeren van maximale twitch stimulaties en het aanpassen van de spierlengte tot de piekkracht werd bereikt. De stimulaties werden met een tussenpoos van 30 s uitgevoerd om de spier niet te vermoeien. De referentielengte van de spier werd gemeten als Lo vóór het ondergaan van een passieve rek van 105, 110, 115, 120, 125, en 130% van Lo. De spieren werden gevlokt om overtollig KRB te verwijderen en vervolgens gewogen. Gegevens werden gecorrigeerd naar CSA en PCSA.

Cardiotoxine (CTX) letsel

Vergelijkingen werden gemaakt in C57BL/6 muizen tussen een CTX-behandelde FDB (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) en PBS-behandelde contralaterale FDB 4 dagen (n = 4) en 10 dagen na de behandeling (n = 2). Steriele 8-mm lange 31G spuiten werden bereid met 10 pi van 10 pM CTX of 10 pi van steriele 1 × PBS, zoals eerder beschreven. Na isofluraan geïnduceerde anesthesie, werd de basis van de voeten van vier muizen schoongemaakt met alcoholdoekjes. CTX werd geïnjecteerd in het proximale deel van de voet met de naald gepositioneerd onder de huid en in de richting van de tenen. PBS werd geïnjecteerd in de contralaterale voet. Muizen werden opgeofferd op het juiste moment, en FDB’s werden ontleed voor het meten van de kracht productie, zoals hierboven beschreven. Gegevens werden gecorrigeerd naar PCSA.

Hematoxyline en eosine kleuring

FDB spieren onderworpen aan 10 dagen CTX behandeling werden flash bevroren in een optimale snij temperatuur (OCT) oplossing voor het snijden en H &E kleuring, zoals eerder beschreven.

Skeletspier hoge-resolutie mitochondriale respirometrie

Voorbereiding van permeabilized gastrocnemius en FDB spiervezelbundels

Respirometrie werd uitgevoerd op geïsoleerde permeabilized gastrocnemius en FDB spierbundels uitgesneden uit dezelfde ledemaat van C57BL / 6 muizen (n = 4). Een deel van de rode gastrocnemius werd ontleed en gebruikt voor de bereiding van permeabilized vezelbundels, zoals eerder beschreven. Rode gastrocnemius spier werd gebruikt als de vergelijkende weefsel zoals het gewoonlijk wordt gebruikt om murine skeletspieren mitochondriale ademhaling te beoordelen. Het protocol voor de voorbereiding permeabilized FDB spiervezelbundels werd aangepast van eerder beschreven methoden op de permeabilisatie van rode gastrocnemius spierbundels en wordt hieronder geschetst. De FDB’s werden ontleed en onmiddellijk toegevoegd aan ijskoude buffer X (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazol, 20 taurine, 5,7 ATP, 14,3 fosfocreatine, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH 2O). Met behulp van een dissectiemicroscoop werden bindweefsel, vet en bloedvaten zorgvuldig verwijderd om spierverlies te voorkomen. FDB’s werden in bundels gesneden en verdeeld in groepen van drie tot vier bundels met een gewicht van 1,5-2,0 mg nat gewicht. Bundel groepen werden vervolgens permeabilized in buffer X met 22,5 ug / ml saponine met continue rotatie bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Spierbundels werden onmiddellijk overgebracht naar ijskoude buffer Z (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg / ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) en gewassen met continue rotatie bij 4 ° C gedurende 15 minuten.

Mitochondriale ademhaling

Metingen van hoge-resolutie O 2 verbruik werden gemaakt met behulp van de OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk) bij 37 ° C met een zuurstof startconcentratie van ~ 300-350 pM zoals eerder beschreven . Experimenten werden uitgevoerd in buffer Z met 20 mM creatinemonohydraat en 25 μM blebbistatine. Mitochondriale ademhaling werd beoordeeld door de opeenvolgende toevoeging van substraten in een eindconcentratie van pyruvaat 4 mM, malaat 0,5 mM, glutamaat 5 mM, ADP 2.5 mM, succinaat 5 mM, cytochroom c 5 μM, rotenon 10 μM, antimycine A 5 μM, ascorbinezuur 2 mM, en TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tetramethyl-p-fenyleendiamine dihydrochloride). De integriteit van de mitochondriale membraan werd bevestigd door het uitsluiten van gastrocnemius spierbundels en FDB spierbundels die een > 10 of > 20% toename van de ademhaling, respectievelijk, na exogene toevoeging van cytochroom c produceerden. Een andere uitsluitingscriteria werd gebruikt voor de gastrocnemius en FDB spierbundels als voorlopige testen aangegeven een grotere procentuele toename van de ademhaling was gebruikelijk in FDB vezelbundels in vergelijking met gastrocnemius vezelbundels, na de toevoeging van cytochroom c. Na voltooiing van het protocol, werden spierbundels gespoeld in gedestilleerd H 2 O, gevriesdroogd (Labconco, Kansas City, MO), en gewogen (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Ademhalingsfrequenties voor intacte gastrocnemius spierbundels worden gewoonlijk gecorrigeerd naar droog gewicht, echter, als gevolg van verschillen in bindweefsel inhoud van de twee spiergroepen, werden JO2 waarden ook gecorrigeerd naar totaal eiwit en citraat synthase (CS) activiteit. CS activiteit werd gemeten met behulp van kit CS0720. Chemicaliën en reagentia werden gekocht bij Sigma Aldrich.

Microscopie

In vitro

FDB spiervezels werden geïsoleerd uit C57BL / 6 muizen en bevestigd aan 35-mm glazen bodem schalen gecoat met ECL, zoals eerder besproken. Geïsoleerde myofibers werden gekleurd met mitotracker diep rood (M2246, Thermo Fisher) en NucBlue (R37605, Thermo Fisher) in DMEM gedurende 30 minuten. Vezels werden driemaal gewassen met 2 ml KRB. Vezels werden afgebeeld met behulp van een single photon confocale laser scanning microscoop met een × 60 olie-immersie objectief (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) en excitatie werd bereikt met behulp van de 405-en 488-nm lijnen van een multiline argon laser.

In vivo

Tweede harmonische generatie beschrijft het optisch effect geproduceerd uit de passage van laserpulsen door sterk gepolariseerde, niet-centro-symmetrische materialen zoals myosine. Wanneer deze materialen bij de juiste golflengte gepolariseerd zijn, zenden zij licht uit bij de helft van de golflengte van die golflengte, waardoor beelden met hoge resolutie worden verkregen zonder dat fluorescente sondes nodig zijn die onderhevig zijn aan fotobleaching en fototoxiciteit. Bovendien is de nabij infrarood golflengten gebruikt voor diepe weefselpenetratie zonder de noodzaak van invasieve procedures. C57BL / 6 muizen werden verdoofd voordat de huid die de FDB bedekt werd verwijderd, waardoor de FDB spier bloot kwam te liggen. Eenmaal blootgesteld, werd de FDB gehydrateerd met steriele KRB en de muis werd in buikligging op een glazen dekglaasje (# 1,5, Leica), zoals eerder beschreven (Fig. 1C). Myosine en nicotinamide-bevattende moleculen werden geëxciteerd bij 900 en 720 nm met behulp van een modus vergrendeld Ti: Sapphire gepulseerde laser (Mai Tai Deep See HP-serie, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), en emissie werd opgenomen met behulp van niet-ontspannen detectie met een FV10 MRV / G filter ingesteld op 450 en 420 nm, respectievelijk. Alle beelden werden gemaakt met behulp van een × 60 olie-immersie objectief (Plan Apochromat, NA 1,35) en een Olympus FV1000 LSM met FV10-ASW 4.2 acquisitiesoftware.

cDNA electroporatie en hoge-resolutie respirometrie van skeletspieren overexpressie van Pgc1α

Electroporatie van cDNA in FDBs werd uitgevoerd zoals eerder beschreven . Kort samengevat werden de voeten van zeven C57BL / 6 mannelijke en vrouwelijke verdoofde muizen schoongemaakt met een alcoholdoekje en de voetkussentjes werden geïnjecteerd met 10 ul van 2 mg / ml hyaluronidase gesuspendeerd in steriel gefilterde KRB met behulp van een 8-mm-lange 31 gauge steriele naald. Ongeveer 1 uur later werden de muizen voor een tweede maal verdoofd. Voeten werden opnieuw schoongemaakt met een alcoholdoekje en een voet kreeg 30 ug van groen fluorescent eiwit (GFP)-getagged PGC1α plasmide en de contralaterale voet werd geïnjecteerd met YFP cDNA. Na een volledig herstel van de anesthesie, werden muizen verdoofd voor een derde keer ~ 10 min later. Platina elektroden werden ingebracht onder de huid en loodrecht geplaatst op de FDB en evenwijdig aan elkaar op de hiel en voetzool onder de tenen. De FDB werd gestimuleerd met 20 pulsen van 20 ms bij 1 Hz en 100 V . Muizen werden 14 dagen later opgeofferd, en FDBs werden ontleed en afgebeeld onder een fluorescerende microscoop om plasmide expressie te bevestigen. Intact FDB spiermonsters werden vervolgens bereid en gemeten voor mitochondriale ademhaling zoals hierboven geschetst.

Statistieken

Data distributies werden beoordeeld en gegevens die niet voldeden aan een normale verdeling werden log base 10 getransformeerd. Kracht frequentie contractiele gegevens werden geanalyseerd via twee-weg ANOVA met Tukey meervoudige vergelijkingen. Spiermassa, vezeltype, tijd tot max en half-relaxatie, en vermoeidheidsgegevens werden geanalyseerd via een-weg ANOVA met Tukey meervoudige vergelijkingen. In gevallen waarin de gegevens niet naar een normale verdeling konden worden getransformeerd, werd een Kruskal-Wallis test met Dunn meervoudige vergelijkingen uitgevoerd. ANOVA’s werden voltooid met GraphPad Prism 7.03. Ademhalingsgegevens en CS activiteit werden geanalyseerd via gepaarde twee-tailed t-tests met een alfa-niveau van 0,05 met behulp van Microsoft Excel. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM.