Charles V moest op zoek naar een ander portret, uit Oostenrijk het portret dat Isabella van Portugal aan Margret had gestuurd voordat zij stierf. Zijn zuster stuurde het portret in november, Karel was zeer teleurgesteld dat het er niet uitzag als een portret voor zijn vrouw. Omdat hij niet tevreden was met het portret moest hij Titiaan vragen een kunstwerk te vinden dat op zijn vrouw leek.
Titianus schilderde het portret van Isabella in 1545, Titiaan richtte het in en Karels vrouw had een zwarte jurk aan en op haar schoot had ze bloemen, achter haar had ze een prachtige kroon. In het EI Pardo paleis werd deze kunst vernietigd door een brand dit verhaal is in prenten en verschillende kopieën. Het portret was de neus kwijt en daarom bracht Karel het naar Augsburg zodat de kunstenaar eraan kon werken om de neus opnieuw te schilderen. In september 1548 gebruikte de kunstenaar het oude model om het huidige model te maken en ook dit werd in Augsburg geschilderd. Karel en Isabella hadden een portret samen en een duplicaat in de Fundacion Casa de Alba Collection in Madrid dit was de beste en de eerste combinatie van Isabella van Portugal en Karel V.
De kunst van Titiaan bracht herinneringen aan Isabella van Portugal en het portret dat hen beiden had herinnerde aan Karel zijn vrouw. Karel vroeg om kunst en hij wilde geen exacte schilderijen, maar hij wilde de schilderijen die hij in zijn hoofd had, visualiseren. Karel wilde dat Titiaan het verloren neusportret zou schilderen omdat hij het kon schilderen zoals de neus eruitzag. De portretten die tijdens haar leven werden gemaakt, zagen er echt uit en lieten zien hoe Isabella van Portugal een aquiline neus had, een unieke eigenschap die door velen werd opgemerkt. Titiaan moest dezelfde correctie maken van een klassieke rechte neus naar een gebogen neus zoals Isabella van Portugal had. De kleine dingen in de portretten die herinneringen opriepen aan Isabella zorgden ervoor dat Charles de kunst dicht bij zich hield en dit alles is bewaard gebleven in documenten als Yuste en Brussel, waar de laatste werd gedocumenteerd in 1556 en de eerste in 1558.
De portretten die Titiaan maakte lagen dicht bij die van Giulio Romano. Die van Eleonora Gonzaga een hertogin uit Urbino is waar Titiaan naar keek en de vaardigheden in de schilderijen gebruikte om portretten van Isabella te maken. De afbeeldingen van Isabella van Portugal waren op de een of andere manier een uitdaging, omdat het geen werkelijkheid was, maar slechts een om herinneringen op te halen. De portretten van Isabella van Portugal waren geweldig werk van Titiaan, maar als je goed keek, bleek dat het gebruikte doek eerder een vrouwenkunstwerk was. Het beschilderde doek Isabella van Portugal werd geschonken aan Maria, zuster van Filips de tweede. Het was voor een klooster genaamd Descalzas Reales. In 1636 werd het naar Madrid gebracht, naar het Alcazar, en bleef daar tot de brand in 1734.