Abstract

Cellulair metabolisme hangt af van de juiste concentratie van intracellulair anorganisch fosfaat (Pi). Op pi-hongersnood reagerende genen blijken betrokken te zijn bij meerdere metabole routes, wat wijst op een complex pi-regulatiesysteem in micro-organismen en planten. Een groep enzymen is nodig voor de opname en instandhouding van een adequaat fosfaatgehalte, dat vrijkomt uit fosfaatesters en anhydriden. Het fosfatase systeem is bijzonder geschikt voor de studie van regulatiemechanismen omdat de fosfatase activiteit gemakkelijk gemeten kan worden met specifieke methoden en het verschil tussen de onderdrukte en gederepresseerde niveaus van fosfatase activiteit gemakkelijk gedetecteerd kan worden. Dit artikel analyseert het proteïne fosfatase systeem dat geïnduceerd wordt tijdens fosfaatsterfte in verschillende organismen.

1. Inleiding

Regulatie van cellulaire processen, zoals cellulaire differentiatie, proliferatie, celdood, mobiliteit, metabolisme, overleving, en organisatie van het cytoskelet, in reactie op bepaalde stimuli is fundamenteel voor alle aspecten van het celleven . Eiwitfosforylering is een van de meest voorkomende mechanismen die worden gebruikt om deze processen te reguleren. Processen die reversibel worden gecontroleerd door eiwitfosforylering vereisen zowel een eiwitkinase als een eiwitfosfatase .

Traditioneel zijn eiwitkinasen intensiever bestudeerd dan eiwitfosfatasen, vanwege de vroegere opvatting dat eiwitkinasen de fosforylering van eiwitten nauwkeurig regelen, terwijl eiwitfosfatasen slechts fosfaatgroepen verwijderen. Pas in het laatste decennium is men gaan inzien dat eiwitfosfatasen ook door een verscheidenheid van mechanismen worden gereguleerd en voor de cellulaire fysiologie van niet minder belang zijn dan eiwitkinasen. Eiwitfosfatasen zijn in staat om fosfomonoestermetabolieten te hydrolyseren, waarbij anorganisch fosfaat (Pi) uit deze substraten vrijkomt.

Fosfor, in de vorm van anorganisch fosfaat (Pi), is een van de belangrijkste macronutriënten voor alle organismen. Het wordt niet alleen gebruikt in de biosynthese van cellulaire componenten, zoals ATP, nucleïnezuren, fosfolipiden en eiwitten, maar het is ook betrokken bij veel metabolische routes, met inbegrip van energie-overdracht, activering van eiwitten, en koolstof en aminozuur metabolische processen . Grote hoeveelheden fosfaat zijn nodig voor celoverleving. In planten is Pi essentieel voor groei en ontwikkeling. In schimmels reguleert de pi-signaaltransductieroute de expressie van vele fosfaatgevoelige genen die betrokken zijn bij het wegvangen en opnemen van pi- uit extracellulaire bronnen . In trypanosomatide parasieten beïnvloedt Pi hun vermogen om correct te groeien en te koloniseren in de ongewervelde gastheer .

Samenvattend, eiwit fosfatasen en kinasen zijn noodzakelijk voor Pi homeostase tijdens de verwerving, opslag, afgifte, en metabole integratie van Pi . Het doel van dit artikel is een samenvatting te geven van de regulatie van fosfatasen door anorganisch fosfaat, met de nadruk op de rol van deze enzymen in de celbiologie.

2. Terugkoppelingscontrole van fosfatasen door anorganisch fosfaat: The PHO Pathway

Saccharomyces cerevisiae heeft verschillende fosfatasen met verschillende specificiteiten, cellulaire locatie, en permeasen die gebruikt worden bij de Pi opname. De reeks genen verantwoordelijk voor deze activiteiten worden gecoördineerd onderdrukt door de pi-concentratie in het groeimedium. De celverwerving, opslag, afgifte en metabolische integratie van Pi vereist de deelname van vele essentiële enzymen zoals extracellulaire zure fosfatasen (APasen), fosfodiësterasen, pi-transporters, polyfosfaatkinasen, alkalische fosfatasen (ALPasen), en endopolyfosfatasen . De activiteiten van deze enzymen zijn intrinsiek verbonden met de pi-homeostase, en zij zijn onderhevig aan regulatie via de pi-signaaltransductieroute (PHO) in reactie op variërende pi-niveaus .

In één huidig model voor PHO-regulatie is de positieve regulator (of positieve factor) Pho4p, gecodeerd door het PH04-gen, onmisbaar voor transcriptionele activering van PHO-genen door zijn activiteit en locatie. In een hoog pi-medium remt een cycline-afhankelijk kinase (CDK) complex bestaande uit Pho80p en Pho85p de functie van Pho4p door hyperfosforylering. Hypergefosforyleerd Pho4p blijft in het cytoplasma en is niet in staat om de transcriptie van de PHO genen te activeren. Wanneer de pi-concentratie in het medium voldoende laag is, remt Pho81p de functie van het Pho80p-Pho85p complex, waardoor Pho4p zich naar de kern kan verplaatsen en de transcriptie van de PHO genen kan activeren. Deze genen coderen voor de hoog-affiniteit transporters Pho84p en Pho89p; gesecreteerde zure fosfatases Pho5p, Pho11p, en Pho12p; andere verwante proteïnen die de pi-terugwinning uit extracellulaire bronnen verhogen .

Deze PHO pathway is beschreven in verschillende organismen zoals planten , bacteriën , en schimmels .

3. The Phosphatase System in Yeast

Initially, it was observed that a several phosphatase genes are modulated by the Pi concentration in the culture medium; thus, the PHO pathway was initially characterized by differentially expressed phosphatases .

In S. cerevisiae, the transcription of genes encoding acid and alkaline phosphatases and the Pi transporter is coordinately repressed and derepressed depending on the Pi concentration in the culture medium . De meeste fosfatasen die onder Pi-beperkende omstandigheden worden gesynthetiseerd, zijn extracellulair gelokaliseerd of geassocieerd met het plasmamembraan of de celwand.

De Pi-gereguleerde fosfatasegenen omvatten PHO5 , dat codeert voor de belangrijkste fractie van repressibele zure fosfatasen (rAPase; optimale pH 3-4; EC 3.1.3.2), en zijn isozymes PHO10 en PHO11 . Deze drie rAPasen zijn glycoproteïnen die zich in de celwand of de periplasmatische ruimte bevinden. Zij zijn verantwoordelijk voor het opvangen van fosfaat en werken samen met transporters met hoge affiniteit om fosfaat te verwerven wanneer de pi-concentratie in de omgeving laag is. Het rAPase dat wordt gecodeerd door het PHO5-gen wordt geglycosyleerd tijdens de secretie over het membraan en wordt gelokaliseerd in de periplasmatische ruimte. Pho5p is verantwoordelijk voor >90% van de APase-activiteit .

Omdat het PHO5-gen-product het leeuwendeel van de zure fosfatasen uitmaakt, is PHO5-regulatie de sleutel tot cellulaire fosfaathomeostase. Transcriptionele activatoren, Pho4p en Pho2p, zijn nodig om de actieve chromatinestructuur in de PHO5-promotor te genereren en transcriptie te stimuleren. Pho80p-Pho85p is een cycline/cycline-afhankelijk kinase complex dat Pho4p op meerdere plaatsen fosforyleert om de functie van Pho4p negatief te reguleren. Huang en O’Shea voerden een high-throughput, kwantitatieve, enzymatische screening uit van een gist-deletiecollectie, op zoek naar nieuwe mutanten die defect zijn in PHO5 expressie. Van de constitutieve mutanten vertoonden de pho80 en pho85 stammen de meest verhoogde niveaus van Pho5 fosfatase activiteit en PHO5 mRNA onder hoge fosfaat condities, consistent met hun centrale rol in de PHO pathway. Volledig verlies van de hoge kinase activiteit (Pho80p-Pho85) resulteert in volledige activering van de Pho4 transcriptiefactor, wat leidt tot volledige PHO5 expressie.

Een andere belangrijke klasse van fosfatasen in S. cerevisiae zijn de alkalische fosfatasen (ALPase; optimale pH 8; EC 3.1.3.1). PHO8 codeert voor een niet-specifiek repressief alkalisch fosfatase (rALPase). Het is een vacuole gelokaliseerd glycoproteïne dat diverse substraten splitst om fosfaat te onttrekken aan intracellulaire producten. Pho8p is een Mg2+/Zn2+-afhankelijk dimeer eiwit, vergelijkbaar met het ALPase in Escherichia coli en in zoogdiercellen . Het enzymproduct van PHO13 is een monomeer eiwit en is specifiek voor p-nitrofenylfosfaat (pNPP) en histidinylfosfaat. Dit enzym werd sterk geactiveerd door Mg2+-ionen, met een pH-optimum van 8,2 en een hoge specifieke activiteit voor pNPP, met een gemiddelde waarde van 3,6 × 10-5 M .

4. Phosphorus Stress Modulates Acid Phosphatases in Plants

Zure fosfatases (APases) kunnen actief zijn tegen een breed scala van organische fosfaten die aanwezig zijn in de bodem. Deze enzymen zijn niet-specifieke orthofosfor monoester fosfohydrolasen (EC 3.1.3.2) die Pi splitsen van ester linkage sites. Afgescheiden plantaardige fosfatases behouden 50% activiteit over een breed pH-bereik (4,0-7,6), behouden 80% activiteit over een breed temperatuurbereik (22°C-48°C), en zijn stabiel bij temperaturen tot 60°C, waardoor ze ideale kandidaten zijn voor actieve bodemenzymen .

APases zijn overvloedig aanwezig in Arabidopsis en worden vertegenwoordigd door ten minste vier genfamilies. Een recent onderzoek van het geannoteerde Arabidopsis-genoom identificeerde sequenties voor 1 His APase, 4 fosfatidische APases, 10 vegetatieve opslagproteïne APases, en 29 paarse APases.

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke belangstelling geweest voor paarse APases (PAP’s). Vergelijkende analyse van de structuur van PAP’s van hogere planten en zoogdieren heeft de identificatie mogelijk gemaakt van geconserveerde sequentie- en structuurmotieven in dit type enzym van vele eukaryotische soorten.

Biochemisch functioneren planten-PAP’s als homodimereiwitten met een molecuulmassa van ~55 kDa per monomeer, terwijl zoogdier-PAP’s typisch monomere eiwitten zijn met een molecuulmassa van ~35 kDa . Veel PAP’s zijn glycoproteïnen die op de secretorische route worden gericht. Van één PAP van Spirodela oligorrhiza is vastgesteld dat het glycosylfosfatidylinositol verankerd is in de cel. Structureel hebben plantaardige PAP’s twee domeinen. Het NH2-domein heeft geen katalytische functie. Het COOH-domein bevat het metaalcentrum en is het katalytische domein van het enzym. Een andere PAP van Lupinus albus bevat mogelijk een derde domein, met een structuur die lijkt op die van sterol desaturases, aan zijn carboxyl terminus . Het is niet bekend hoe vaak deze laatste twee vormen van posttranslationele modificatie voorkomen bij PAP’s van andere soorten. PAP’s zijn metalloenzymen die een binucleair metaalionencomplex in hun actieve zone hebben. Hun karakteristieke roze tot paarse kleur is het gevolg van een ladingsoverdracht door een tyrosineresidu dat een ferri-ion coördineert. Dit enzym kan fosforzure esters en anhydriden hydrolyseren .

PAP’s zijn geïsoleerd uit Phaseolus vulgaris (gewone boon) , Glycine max (sojaboon) , Lupinus albus (witte lupine) , Lycopersicon esculentum (tomaat) , Triticum aestivum (tarwe) , Hordeum vulgare (gerst) , Zea maïs (maïs) , en Oryza sativa (rijst) .

De reactie van de plant op Pi-honger kan in twee categorieën worden verdeeld: de specifieke respons en de algemene respons. De specifieke reacties bevorderen een efficiënte mobilisatie en verwerving van Pi uit groeimedium en intracellulaire voorraden. De algemene reacties maken overleving op lange termijn mogelijk door het celmetabolisme te coördineren met de beschikbaarheid van voedingsstoffen en het groeipotentieel. De uitvoering van deze strategieën vereist veranderingen in de expressieprofielen van honderden genen, zoals aangetoond door de transcriptoomanalyses van Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

Tijdens Pi hongersnood, verhogen planten fosfatase expressie als een algemene reactie . Fosfatase productie is gekoppeld aan Pi deficiëntie, en een positieve correlatie tussen zure fosfatase productie en Pi voeding is voorgesteld . Bijvoorbeeld, planten zoals lupinen, die efficiënter zijn in het verwerven van Pi uit de bodem, produceren aanzienlijk meer fosfatase in vergelijking met granen .

Wu et al. analyseerden de regulatie van eiwitfosfatasen in Arabidopsis en ontdekten dat drie genen voor PAP werden geïnduceerd door pi-honger. Bovendien werd het gen At1g25230 meer dan 2-voudig geïnduceerd, waaruit blijkt dat dit gen reageert op pi-verhongering.

In het rijstgenoom werden in totaal 26 putatieve PAP-genen geïdentificeerd, en pi-sterfte induceerde de expressie van 10 rijst PAP-genen, wat suggereert dat deze een belangrijke rol spelen bij de acclimatisatie van rijst aan lage pi-omstandigheden.

In Lycopersicon esculentum (tomaat) wordt LePS2 geïnduceerd door pi-sterfte. Er wordt opgemerkt dat LePS2 fosfatases de eerste cytoplasmatische fosfatases vertegenwoordigen die componenten zijn van de Pi starvation respons . Het suspenderen van tomatencellen in een Pi-arm medium leidde tot een ongeveer 4-voudige toename van de PAP-specifieke activiteit, maar de PAP-specifieke activiteit bleef laag en constant in cellen die in een hoog Pi-medium werden gehouden. De toename van de PAP-activiteit in cellen die groeien in een Pi-arm medium toont aan dat PAP een rol zou kunnen spelen in het verbeteren van de beschikbaarheid en het gebruik van Pi en een centrale rol zou kunnen spelen in het mobiliseren van intracellulair Pi door het detecteren van een tekort aan Pi in tomaat. Ectofosfatasen als pi-sensoren

Het plasmamembraan van cellen kan enzymen bevatten waarvan de actieve sites naar het externe medium zijn gericht in plaats van naar het cytoplasma. De activiteiten van deze enzymen, die ectoenzymen worden genoemd, kunnen worden gemeten met intacte cellen. Ectofosfatases en ectokinases zijn gedetecteerd in verschillende micro-organismen, waaronder protozoa , bacteriën , en schimmels .

Vele studies hebben aangetoond dat ectofosfatases een rol spelen bij het verkrijgen van Pi voor gebruik in de groei van verschillende celtypen . In schimmelcellen (Fonsecae pedrosoi) induceert de depletie van Pi uit het kweekmedium blijkbaar de expressie van verschillende ectofosfatase-activiteiten . Het kweken van deze schimmels in afwezigheid van exogeen Pi blijkt te resulteren in het genereren van schimmelcellen die een ectofosfatase-activiteit tot expressie brengen die 130 maal hoger is dan die welke tot expressie komt door schimmels die in aanwezigheid van Pi worden gekweekt . Trypanosomatide cellen bezitten ectofosfatases die Pi leveren door hydrolyse van fosfomonoester metabolieten . In T. rangeli bijvoorbeeld induceert een lage Pi-concentratie in het groeimedium de expressie van een andere ectofosfatase-activiteit , wat suggereert dat dit enzym leidt tot hydrolyse van gefosforyleerde verbindingen die aanwezig zijn in het extracellulaire medium. Deze hydrolyse zou kunnen bijdragen tot de verwerving van Pi tijdens de ontwikkeling van T. rangeli epimastigoten.

Onder omstandigheden van pi-beperking brengen fluorescerende bacteriën Pseudomona een reeks fosfaathongergenen tot expressie. Bijvoorbeeld, ten minste 56 pi-honger eiwitten worden geïnduceerd in de P. putida stam KT2442 , en, in de P. fluorescens stam DF57, inductie van verschillende fosfaathonger genen is gemeld.

In veel eukaryoten, de nucleotide pyrofosfatase/fosfodiesterase (E-NPP) familie van eiwitten is direct verantwoordelijk voor fosfaat hydrolyse van extracellulaire nucleotiden. NPP1 tot en met -3 worden in vrijwel alle menselijke weefseltypen aangetroffen, en deze enzymen bevatten een alkalisch ectonucleotidepyrofosfatase/fosfodiësterase type 1 domein. In S. cerevisiae worden NPP1 en NPP2 geüpreguleerd via Pi-gereguleerde transcriptie .

6. Slotopmerkingen

Pi is een verbinding die groeibeperkend is in verschillende organismen wanneer de beschikbaarheid ervan laag is in vele ecosystemen . De inductie van fosfatase-activiteit als reactie op pi-hongersnood is een veel voorkomend verschijnsel bij organismen die Pi uit de omgeving opnemen. Deze enzymen zijn in staat gefosforyleerde substraten te hydrolyseren om een bron van Pi te leveren tijdens een tekort aan voedingsstoffen. In Saccharomyces cerevisiae veroorzaakt het pi-hongersignaal een verhoogde productie van ten minste vier typen fosfatasen: (1) de zure fosfatasen Pho5, Pho11, en Pho12, die gelokaliseerd zijn in de periplasmatische ruimte; (2) het alkalische fosfatase Pho8, dat gelokaliseerd is in de vacuole; (3) het glycerolfosfatase Hor2; (4) het vermeende polyfosfatase Phm5, dat gelokaliseerd is in de vacuole. Al deze enzymen kunnen bijdragen tot verhoogde niveaus van vrij Pi . Aan deze enzymen kunnen echter andere functies worden toegeschreven.

Del Pozo et al. zuiverden een zuur fosfatase, AtACP5, dat wordt geïnduceerd door pi-honger in Arabidopsis thaliana. Dit enzym heeft twee activiteiten, hydrolyse van gefosforyleerde substraten en peroxidevorming. De fosfatase-activiteit weerspiegelt waarschijnlijk een rol in de pi-mobilisatie; de peroxidatie-activiteit suggereert dat AtACP5 ook een rol zou kunnen spelen in het metabolisme van reactieve zuurstofspecies.

Alles bij elkaar spelen door pi-hongersnood geïnduceerde fosfatasen een rol in de aanpassing van een organisme aan stress, hoewel er ook andere rollen gevonden kunnen worden.

Aankondigingen

De auteurs erkennen de financiële steun gegeven door de Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), en Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick en A. L. A. Dos-Santos hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.