Kwal genoomassemblage en annotatie

Hier presenteren we de eerste de novo genoomassemblage van de Nomura’s kwal (Nemopilema nomurai; Fig. 1b). Het resulteerde in een 213-Mb genoom bestaande uit 255 scaffolds en een N50 lengte van 2,71 Mb, met slechts 1,48% hiaten (Additional file 1: tabellen S2 en S3). De Nemopilema hybride assemblage werd gemaakt met behulp van een combinatie van korte en lange lees sequencing technologieën, bestaande uit 38,2 Gb Pacific Biosciences (PacBio) single-molecule real-time sequencing (SMRT) leest, samen met 98,6 Gb van Illumina korte-insert, mate-paar, en TruSeq synthetische lange leest (Additional file 1: figuren S3-S5; tabellen S4-S7). De resulterende montage toont de langste continuïteit onder cnidarian genomen (Additional file 1: tabel S9). We voorspelden 18.962 eiwit-coderende kwallengenen door een combinatie van de novo (met behulp van medusa bell en tentakel weefsel transcriptomen) en homologe genvoorspellingsmethoden (Additional file 1: Tabellen S10 en S11, Additional files 2 en 3). Dit proces herstelde het hoogste aantal single-copy orthologe genen van alle gepubliceerde niet-bilateraal metazoan genoom assemblies tot nu toe (Additional file 1: Tabel S12). In totaal bleek 21,07% van het kwallengenoom uit transponeerbare elementen te bestaan, vergeleken met die van Acropora digitifera (9,45%), Nematostella vectensis (33,63%), en Hydra vulgaris (42,87%) (Additional file 1: Tabel S13).

We vergeleken het Nemopilema genoom met andere cnidarian genomen, waaronder de recent gepubliceerde Aurelia aurita en Clytia hemisphaerica genomen , die allemaal van overwegend sessiele taxa zijn, om unieke Scyphozoa functie (actieve mobiliteit), fysieke structuur (medusa bel), en chemie (gif) te detecteren. We hebben ook transcriptoomanalyses uitgevoerd van zowel de Nemopilema nomurai als de Sanderia malayensis kwal over drie medusa weefseltypen en vier ontwikkelingsstadia.

Evolutionaire analyse van de kwal

Om kwallenspecifieke evolutionaire eigenschappen te identificeren, hebben we genfamilie-uitbreidingen en -inkrimpingen onderzocht bij één eencellige holozoa en 13 metazoanen met behulp van 18.458 orthologe genfamilies (zie Additional file 1: Sectie 4.1). Hiervan werden er 10.434 gevonden in Nemopilema en 6764 werden gedeeld door alle drie beschikbare cnidarian klassen (Scyphozoa: Nemopilema nomurai en Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera en Nematostella vectensis ; Fig. 2a). Een fylogenie geconstrueerd met behulp van deze orthologs onthulde een monofyletische cnidarian clade die divergeerde van de metazoan stam voorafgaand aan de evolutie van de bilaterians (Fig. 2b; Additional file 1: Figuur S7). Om te bepalen hoeveel genen er in elk evolutionair tijdperk in het genoom van Nomura’s kwallen voorkwamen, hebben we ook de evolutionaire leeftijd van de eiwit-coderende genen geëvalueerd. Door de genen van kwallen te groeperen in drie brede evolutionaire tijdperken, zagen we dat terwijl de meerderheid (80%) van de genen oud zijn (ouder dan 741 Mya), een paar (~ 3%) van een intermediaire leeftijd zijn (741-239 Mya), en sommige (17%) jong zijn (239 Mya tot heden; Fig. 2c; Additional file 1: Figure S10). Interessant is dat normalisatie van het aantal genen naar leeftijd en lengte van het evolutionaire tijdperk suggereert dat de genomzet het hoogst is in de buurt van de huidige tijd. In totaal bevatte het Nemopilema genoom 123 uitgebreide en 164 gekrompen genfamilies vergeleken met de gemeenschappelijke voorouder van Nemopilema en Aurelia (Fig. 2b; zie Additional file 1: Paragraaf 4.2). Gene Ontology (GO) termen gerelateerd aan zintuiglijke waarneming waren ondervertegenwoordigd in de Cnidaria lineage in vergelijking met Bilateria, nauwkeurig weerspiegelen cnidarian minder complex zintuiglijk systeem (Additional file 1: tabellen S14 en S15). Neurotransmitter transport (GO:0006836, P = 6.01E- 10) was echter significant verrijkt in Scyphozoa lineage vergeleken met de gemeenschappelijke voorouder van Scyphozoa en Hydrozoa (Additional file 1: Tabellen S16 en S17), waarschijnlijk als gevolg van het evenwicht en visuele structuren, zoals de statocyst en ocelli, die uitgebreider zijn in de mobiele medusa dan in sessiele poliepen. Vergeleken met de gemeenschappelijke voorouder van Nemopilema en Aurelia, vertoonde Nemopilema uitgebreide genfamilies geassocieerd met metallopeptidase activiteiten (GO:0008237, P = 2.86E- 14; Additional file 1: Tabellen S18 en S19). Bovendien vonden we 1589 orthologe genfamilies die specifiek zijn voor Scyphozoa. Verrijkingstesten van scyphozoa-specifieke genen toonden de termen van natrium ion transport, ionkanaal activiteit, en neurotransmitter receptor activiteit (Additional file 1: Tabel S20).

Genomic context and muscle-associated genes

Kwallen hebben twee primaire spiertypes: de epitheliomusculaire cellen, die de belangrijkste spiercellen zijn bij sessiele cnidaria, en de gestreepte spiercellen die zich in de medusa-klok bevinden en essentieel zijn voor het zwemmen. Om de evolutie van actief-zwemmen bij kwallen te begrijpen, onderzochten we hun codon bias in vergelijking met andere metazoötische dieren door het berekenen van het guanine- en cytosinegehalte op de derde codonpositie (GC3) (Additional file 1: figuur S13). Er is gesuggereerd dat genen met een hoog GC3 gehalte zich beter kunnen aanpassen aan externe stress (b.v. veranderingen in het milieu). Onder de hoog scorende top 100 GC3 bevooroordeelde genen, de regulatie van spiercontractie, en neuropeptide signaalwegen, waren GO termen specifiek voor Nemopilema (Additional file 4: Tables S25 en S26). Calcium speelt een sleutelrol bij de contractie van de dwarsgestreepte spieren in kwallen, en de calcium signaleringsroute (GO:0004020, P = 5.60E- 10) vertoonde een hoog niveau van GC3 biases specifiek voor Nemopilema. Nemopilema en Aurelia top 500 GC3 genen waren verrijkt in GO termen geassocieerd met homeostase (bijv, cellulaire chemische homeostase en natrium ion transport), waarvan wij speculeren dat het essentieel is voor de activering van spiercontracties die de mobiele predatie van de kwal aandrijven (Additional file 1: Sectie 5.1; Additional file 4: Tabellen S27 en S28).

Aangezien cnidarianen titine en troponine complexen missen, die kritische componenten zijn van bilaterian gestreepte spieren, is gesuggereerd dat de twee clades onafhankelijk van elkaar gestreepte spieren ontwikkelden. Een overzicht van genen die coderen voor spierstructurele en regulerende eiwitten in cnidaria toonde een geconserveerde eumetazoan kern actine-myosine contractiel machinerie gedeeld met bilaterianen (Additional file 1: Tabel S32). Net als bij andere cnidaria ontbreken bij Nemopilema echter titine- en troponinecomplexen, die belangrijke componenten zijn van bilateriaans gestreepte spieren. Ook γ-syntrofine, een onderdeel van het dystroglycaancomplex, ontbrak in Nemopilema, Aurelia en Hydra. Nemopilema en Aurelia bezitten echter wel α/β-Dystrobrevin en α/ε-Sarcoglycan dystroglycan-geassocieerde costamereiwitten, wat erop wijst dat verschillende componenten van het dystroglycancomplex verloren gingen na de splitsing Scyphozoa-Hydrozoa. Er werd gesuggereerd dat Hydra secundaire vereenvoudigingen onderging ten opzichte van Nematostella, die een grotere mate van specialisatie in spierceltypes heeft. Vergeleken met Hydra en Nematostella, Nemopilema en Aurelia tonen een intermediaire complexiteit van spier structurele en regulerende eiwitten tussen Hydra en Nematostella.

Medusa bel en tentakel transcriptoom profilering

Jellyfish medusa bel en tentakels zijn morfologisch verschillend en voeren afzonderlijke fysiologische functies . We genereerden transcriptomen van de klok en tentakels van Nemopilema en de kleinere Sanderia malayensis, die in het laboratorium kunnen worden gekweekt, om de regulatie van de ontwikkeling te beoordelen (Additional file 1: Tabel S29). Verrijkingstesten van hoog-geëxpresseerde genen toonden aan dat spier-geassocieerde functionele categorieën (b.v. spier myosine complex en spierweefsel morfogenese) verrijkt waren in de bel (Fig. 3a; Additional file 5: Tables S30-S33). Myosines vormen een superfamilie van motoreiwitten en spelen een cruciale rol bij spiercontractie en zijn betrokken bij een breed scala van motiliteitsprocessen bij Eukaryoten. De eiwitten van de Myosine II-familie, die worden aangetroffen in cellen van zowel gestreept als glad spierweefsel, zijn verantwoordelijk voor het samentrekken van spiercellen. Cnidaria bezitten zowel epitheliomusculaire cellen als dwarsgestreepte spiercellen. De gestreepte spieren vormen een essentieel onderdeel van de subumbrella van de medusa-klok, waar hun snelle contracties het unieke voortbewegingszwemmen van de kwal mogelijk maken. Wij vonden dat de genfamilies type II Myosine zware keten (MYH) en Myosine lichte keten (MYL) in hoge mate tot expressie kwamen in de klok en nauw geassocieerd zijn met gestreepte en gladde spiercellen. Interessant is dat Nemopilema en Aurelia de grootste aantallen kopieën van MYH- en MYL-genen vertoonden onder de niet-bilaterale metazoanen (Fig. 3c; Additional file 1: Figures S14-S17; Tables S38-40), en zes van de zeven MYH-genen en 12 van de 21 MYL-genen in Nemopilema vertoonden een hogere expressie in de bel dan de tentakels met een zeer hoge ~ 8,8 en ~ 17-voudige toename gemiddeld, respectievelijk (Fig. 3d). Deze resultaten suggereren dat de combinaties van kopie-aantal uitbreiding van type II Myosine genfamilies en hoge expressie van spier-geassocieerde genen bevestigen dat spieren in de medusa bel een belangrijke determinant zijn van de motiliteit van kwallen.

Omgekeerd toonden genexpressieanalyses van de tentakels hoge RNA expressieniveaus van neurotransmitter-geassocieerde functionele categorieën (ionkanaalcomplex, postsynaps, en neurotransmitterreceptoractiviteit; Fig. 3b; Additional file 5: Tabellen S34-S37); consistent met de anatomie van de kwallen tentakels, die de sensorische cellen en een losse plexus van de neuronale subpopulatie aan de basis van het ectoderm bevatten.

Lichaamspatroon in de kwal

Er is veel discussie geweest over de vroege evolutie van de lichaamspatronen in de metazoan gemeenschappelijke voorouder, met name over de oorsprong en uitbreiding van de Hox en Wnt genfamilies. In totaal werden 83 homeodomeinen gevonden in Nemopilema, terwijl 82, 41, 120, en 148 homeodomeinen werden gevonden van Aurelia, Hydra, Acropora, en Nematostella, respectievelijk (Additional file 1: Tabel S41). Vijf van de acht Hox genen in Nemopilema zijn van het posterior type die geassocieerd zijn met aborale as ontwikkeling en geclusterd met Nematostella’s posterior Hox genen, HOXE en HOXF (Additional file 1: Figuren S18-S20). Aurelia heeft zes posterior type Hox genen, maar heeft niet het HOXB, C, en D type (HOX2 bij de mens). Hoewel afwezig in Hydra en Acropora, tonen synteny-analyses van ParaHox genen in Nemopilema aan dat het XLOX/CDX gen zich onmiddellijk stroomafwaarts van GSX bevindt in dezelfde tandemoriëntatie als die in Nematostella, wat suggereert dat XLOX/CDX aanwezig was in de gemeenschappelijke voorouder van de cnidaria en vervolgens verloren ging in sommige lineages (Additional file 1: Figuur S21). Hox-gerelateerde genen, EVX en EMX, zijn ook aanwezig in Nemopilema en Aurelia, hoewel ze afwezig zijn in Hydra. Gezien de grote hoeveelheid voorouderlijke diversiteit in de Wnt genen, is voorgesteld dat Wnt signalering de ontwikkeling van het lichaamsplan in de vroege metazoötische organismen controleerde. Nemopilema bezit 13 Wnt orthologs die 10 Wnt subfamilies vertegenwoordigen (Additional file1: Figuur S22; Tabel S42). Wnt9 is afwezig in alle cnidaria, waarschijnlijk een verlies in de gemeenschappelijke voorouder van de cnidaria. Cnidaria hebben dynamische lineage-specifieke Wnt subfamilie duplicaties ondergaan, zoals Wnt8 (Nematostella, Acropora, en Aurelia), Wnt10 (Hydra), en Wnt11, en Wnt16 (Nemopilema en Aurelia). Er is voorgesteld dat een gemeenschappelijke cluster van Wnt genen (Wnt1-Wnt6-Wnt10) bestond in de laatste gemeenschappelijke voorouder van arthropoden en deuterostomen. Onze analyses van de genomen van cnidaria en bilateria onthulden dat Acropora ook deze cluster bezit, terwijl Nemopilema, Aurelia, en Hydra Wnt6 missen, wat duidt op verlies van het Wnt6 gen in de gemeenschappelijke voorouder van de Medusozoa (Additional file 1: figuur S23). Alles bij elkaar hebben kwallen een vergelijkbaar aantal Hox en Wnt genen als andere cnidaria, maar het dynamische repertoire van deze genfamilies suggereert dat cnidaria onafhankelijk van elkaar zijn geëvolueerd om hun fysiologische eigenschappen en levenscyclus aan te passen.

Poliep naar medusa overgang bij kwallen

De poliep naar medusa overgang is prominent bij kwallen in vergelijking met de andere sessiele cnidaria. Om de genetische basis van de medusa structuurvorming bij kwallen te begrijpen, vergeleken we de transcriptieregulatie tussen cnidarians en tussen kwallen onderling (zie Additional file 1: Secties 7.1 en 7.2). We hebben de Sanderia transcripten geassembleerd met behulp van zes gepoolde monsters van transcriptomen (Additional file 1: Tabel S43). De geassembleerde transcripten hadden een totale lengte van 61 Mb en resulteerden in 58.290 transcript isovormen en 43.541 unieke transcripten, met een N50 van 2325 bp. Gemiddeld 87% van het RNA gelezen werden uitgelijnd tot in de geassembleerde transcripten (Additional file 1: tabel S44), wat aangeeft dat het transcript assemblage de meerderheid van de gesequenced leest vertegenwoordigd. Bovendien was de samenstelling van de eiwitdomeinen in de top 20 vrijwel gelijk tussen Nemopilema en Sanderia (Additional file 1: Tabel S45). Om differentieel tot expressie komende genen voor elk stadium te verkrijgen, vergeleken we elk stadium met het vorige of volgende stadium in de levenscyclus van de kwal. Het poliepstadium, dat een sessiele fase in de levenscyclus van de kwal vertegenwoordigt, vertoonde verrijkte termen gerelateerd aan ionkanaal activiteit en energiemetabolisme (regulatie van metabolisch proces, en amino-suikermetabolisch proces; Additional file 1: Tabel S46). Actief voeden in de poliep stimuleert ongeslachtelijke proliferatie in meer poliepen of metamorfose tot strobila. Aangezien anthozoën geen medusa vormen, is het asexuele voortplantingsstadium van de strobila een belangrijk stadium om de metamorfose van poliep tot medusa te bestuderen. In dit stadium kwamen GO-termen die gerelateerd zijn aan amide biosynthese en metabolische processen tot expressie in vergelijking met het poliepstadium (Additional file 1: Table S47). Er is gerapporteerd dat RF-amide en LW-amide neuropeptiden geassocieerd zijn met metamorfose bij cnidarianen. Wij konden deze bevinding echter niet bevestigen in onze vergelijkingen van de strobila en ephyra stadia. In ons systeem zijn de genexpressiepatronen van de twee stadia vrij gelijkaardig. In de ephyra, het vrijgekomen mobiele stadium, kwamen GO-termen met betrekking tot amide biosynthese en metabolische processen ook hoog tot expressie in vergelijking met het samengevoegde medusa stadium (Additional file 1: Tabel S48). In de medusa waren extracellulaire matrix, metallopeptidase activiteit, en immuunsysteem proces termen verrijkt (Additional file 1: Tabel S49), consistent met de fysiologie van hun bel, tentakels, en orale arm weefseltypes.

Polyp-to-medusa metamorfose werd eerder aangetoond sterk geassocieerd te zijn met CL390 en retinoïde X receptor (RXR) genen in de Aurelia aurita kwal . Interessant genoeg werd CL390 niet gevonden in Nemopilema of andere gepubliceerde cnidaria, wat suggereert dat het een Aurelia-specifiek strobilisatie-inducerend gen zou kunnen zijn. Wij bevestigen echter dat RXR aanwezig is in Nemopilema en afwezig van cnidarians zonder een medusa stadium (Additional file 1: figuur S24). Retinoïnezuur (RA) signalering speelt een centrale rol tijdens de groei en ontwikkeling van vertebraten, waar het transcriptie reguleert door interactie met de RA-receptor (RAR) gebonden aan RA-respons-elementen (RAREs) van nabijgelegen doelgenen. Van de genen in de RA-signaleringsroute bezit Nemopilema ADH- en RALDH-enzymen die retinol tot RA metaboliseren, en RXR- en RARE-elementen om de transcriptie van het doelgen te activeren (Fig. 4a). We ontdekten 1630 Nemopilema RARE regio’s met een gemiddelde afstand van 13 Kbp tot het dichtstbijzijnde gen (Fig. 4b; Additional file 1: Tabellen S50 en S51). Interessant is dat vier posterieure Hox genen van Nemopilema en twee Hox genen van Aurelia zich binnen ± 10 Kbp van RAREs bevonden, hetgeen uniek is onder de niet-bilaterale metazoanen (Fig. 4c; Additional file 1: Tabel S52). Samen suggereren deze bevindingen dat retinoïnezuur signalering aanwezig was in vroege metazoans voor het reguleren van doelgenen met RXR en RAREs en dat RXR en RAREs een kritieke rol kunnen spelen voor poliep-naar-medusa metamorfose .

Identificatie van toxine-gerelateerde domeinen in kwallen

Kwallen produceren complexe mengsels van eiwitachtige giffen voor actieve prooi te vangen en te verdedigen . We identificeerden overvloedige toxine-domeinen in Nemopilema in vergelijking met de niet-bilaterale metazoan genensets in de Tox-Prot database . In totaal kwamen 67 van de 136 toxine-domeinen overeen met niet-bilaterale metazoötische organismen; van deze 67 toxine-domeinen werden er 52 gevonden in Nemopilema (Additional file 1: tabel S53). Verwacht werd dat het Nemopilema-genoom het grootste aantal gif- of toxine-geassocieerde domeinen van de geïncludeerde niet-bilaterale metazoötische organismen bevat. Deze domeinen omvatten zinkmetalloprotease van de familie Reprolysin (M12B) (PF01421), fosfolipase A2 (PF05826), en Prokineticine (PF06607) domeinen (Fig. 5). Ook Nemopilema en Aurelia bezitten respectievelijk 8 en 11 ShK-domein-achtige (PF01549) domeinen, die bij deze soorten het talrijkst zijn in vergelijking met andere niet-bilaterianen. Met name de zinkmetalloproteasen van de Reprolysine (M12B)-familie zijn enzymen die peptiden splitsen en de meeste slangengif-endopeptidasen omvatten. Verder is gemeld dat serine protease inhibitor en ShK domeinen overvloedig werden aangetroffen in de transcriptomen van zowel de kanonskogelkwal (Stomolophus meleagris) als de dooskwal (Chironex fleckeri) , en fosfolipase A2 is een goed gekarakteriseerd toxine-gerelateerd enzym, dat cruciaal is voor de productie van gifcomponenten, gevonden in de klasse Scyphozoa .