De komst van de “precisie”-geneeskunde wordt gekenmerkt door veel nieuwe verbeteringen in diagnostische, prognostische en therapeutische methoden en schema’s. Als onderdeel van dit initiatief is er een focus geweest op het minimaliseren van de hoeveelheid weefsel die nodig is voor testen via minder invasieve en veiligere procedures. Een methode die de laatste jaren sterk in de belangstelling is komen te staan, is de “vloeibare biopsie”. Hoewel de definities over de precieze betekenis van deze term uiteenlopen, kan hij in grote lijnen worden opgevat als het verzamelen van een lichaamsvloeistofmonster om te testen op relevante biomarkers die informatie kunnen verschaffen over het beheer van de patiënt. De term wordt meestal toegepast op de inzameling van perifeer bloed voor de analyse van celvrije circulerende tumor desoxyribonucleïnezuren (DNA).

De eerste beschrijving van circulerend DNA vrij van cellen in menselijk bloed dateert van 1948, maar dit kreeg weinig aandacht in de bredere wetenschappelijke gemeenschap 2. In 1977 stelden wetenschappers de aanwezigheid vast van abnormaal hoge niveaus van celvrij DNA (cfDNA) in het plasma en het serum van kankerpatiënten in vergelijking met patiënten in de controlegroep, en er werd aangenomen dat dit cfDNA hoofdzakelijk circulerend tumor-DNA (ctDNA) vertegenwoordigde1,5. Sinds deze oorspronkelijke beschrijving is uit ander onderzoek gebleken dat een toename van cfDNA in het algemeen een weerspiegeling is van een groot aantal pathologische processen, waaronder maligne en goedaardige neoplastische aandoeningen, ontstekingsziekten, beroerte, trauma en sepsis. Tijdens deze processen kunnen nucleïnezuren in het bloed terechtkomen door apoptotische en necrotische cellen of door gecontroleerde afscheiding door levende cellen2,11. Hoewel celvrij DNA vaak synoniem wordt gebruikt met circulerend tumor-DNA, mag niet worden vergeten dat circulerend niet-tumor en niet-menselijk DNA ook in een monster aanwezig kan zijn.

Hoewel de huidige focus wordt gedomineerd door DNA, omvatten aanvullende componenten van een vloeibaar biopsie ribonucleïnezuren (RNA), circulerende tumorcellen (CTC’s), extracellulaire vesikels (EV’s), en tumoropgevoede bloedplaatjes (TEP’s). De laatste componenten zijn vooral van belang voor het onderzoek. Naarmate meer translationeel onderzoek wordt verricht, kunnen deze bijkomende componenten van een liquid biopsie in de toekomst in toenemende mate klinisch worden gebruikt. Een bespreking van deze elementen valt buiten het bestek van dit artikel en de lezer wordt verwezen naar het artikel van Batth et al voor verdere lectuur.

Technologische overwegingen

Tot voor kort was de beschikbare technologie niet gevoelig genoeg om ctDNA op te sporen en zinvol te gebruiken. In tegenstelling tot moleculaire assays die worden uitgevoerd op lichaamsvloeistoffen voor de detectie van nucleïnezuren van virussen en andere micro-organismen, die baat hebben bij relatief grote hoeveelheden nucleïnezuren, zijn circulerende tumornucleïnezuurfragmenten aanwezig bij een fractie van het normale niet-tumor cfDNA. ctDNA zijn gewoonlijk kleine DNA-fragmenten in het bereik van 140-170 basenparen (bp)3, en tumortype, progressie, belasting, proliferatiesnelheden en therapie zijn allemaal van invloed op de hoeveelheid ctDNA in een monster. Bovendien wordt ctDNA, hoewel het relatief stabiel is in plasma en serum, door de lever en de nieren binnen enkele uren uit de circulatie verwijderd 3,4. Niettemin hebben vorderingen in pre-analytische processen en zuiveringsmethoden succesvolle vangst, amplificatie en sequencing van ctDNA mogelijk gemaakt.

Methoden die momenteel worden gebruikt om ctDNA op te sporen of te meten, kunnen grofweg in twee categorieën worden verdeeld: op basis van polymerasekettingreactie (PCR) en op basis van next-generation sequencing (NGS). Assays op basis van PCR hebben in het algemeen een snellere doorlooptijd en zijn minder duur, maar kunnen in de regel slechts één of enkele specifieke mutaties tegelijk beoordelen (beperkte multiplexing-mogelijkheid). Benaderingen op basis van PCR kunnen verder worden onderverdeeld in methoden waarbij mutantsequenties worden verrijkt ten opzichte van wild-type (niet-mutant) en methoden waarbij kwantificering door compartimentering wordt bereikt. Een voorbeeld van de laatste groep is “digitale PCR”, die op grote schaal wordt gebruikt voor het opsporen en kwantificeren van specifieke, bekende mutaties in ctDNA. De PCR wordt gecompartimenteerd in duizenden kleine afzonderlijke reactievolumes, hetzij op een chip, hetzij door water-in-olie-druppeltjes te maken. Elk compartiment of druppeltje bevat al dan niet een beoogd sjabloonfragment en produceert een fluorescerend signaal indien een geschikt sjabloonfragment in dat volume aanwezig is. Door de afzonderlijke fluorescente volumes te tellen, kan het aantal specifiek gerichte sjabloonmoleculen in het monster worden geschat. Voor meerdere tegelijk geteste targets (multiplexing) kunnen verschillende fluorescentiesignalen worden toegewezen aan specifieke variantsequenties.

Benaderingen op basis van sequencing van de volgende generatie maken beoordeling van een veel breder scala van mogelijke mutaties mogelijk, omdat sequencing mutaties kan detecteren die zich overal binnen de bestreken regio’s voordoen. Om zich op mutatiegevoelige delen van het genoom te richten, kunnen NGS-bibliotheken uit plasma-DNA worden bereid met ligatie/hybride capture-methoden of gerichte PCR-verrijkingsmethoden. Variante allelfracties zijn over het algemeen veel lager in vloeibare biopsieën dan in weefselbiopsieën, vaak <1%, zodat interessante regio’s diepgaander moeten worden gesequeneerd dan bij NGS van primair tumorweefsel. Bovendien moeten de pre-analytische en analytische processen uitgebreid worden geoptimaliseerd om het inputmonster te maximaliseren en PCR- en sequencingfouten te beperken. NGS-benaderingen hebben het belangrijke voordeel dat een veel bredere mutatiedekking kan worden bereikt (gelijktijdige analyse van duizenden mogelijke mutaties). Voorafgaande kennis van de specifieke mutaties van de tumor is dus niet nodig. In vergelijking met eenvoudiger PCR-gebaseerde methoden zijn NGS-technieken echter duurder, tijdrovender en technisch uitdagender.

Voordelen en nadelen

De voordelen van liquid biopsies liggen vooral in de veel minder invasieve aard van de procedures om ze te verkrijgen in vergelijking met standaard tumorbiopsies. Neem bijvoorbeeld de biopsieprocedure voor een longmassa. Indien de massa zich bevindt op een plaats die toegankelijk is via interventieradiologie of chirurgische biopsie, bestaat er een risico van pneumothorax of bloeding, nog afgezien van de kosten van het in stand houden van een operatiekamer waarin de operatie kan worden uitgevoerd. Vloeibare biopsieën maken ook frequentere en seriële monsternemingen in de loop van de tijd mogelijk om meer inzicht te krijgen in het gedrag van tumoren en hun reactie op therapie. In één studie bijvoorbeeld vertoonden dikkedarmkankerpatiënten die later radiografisch een goede reactie op de behandeling vertoonden, een daling van >90% van de ctDNA-niveaus na de eerste 2 weken van de behandeling 9. Hiervan is aangetoond dat het het risico van recidief na resectie met curatieve intentie kan stratificeren. In een andere studie hadden borstkankerpatiënten met aantoonbaar ctDNA na resectie een 25-voudig hoger risico op herval 10. Deze concepten zijn analoog aan de tests die momenteel worden uitgevoerd voor hematologische maligniteiten, zoals chronische myeloïde leukemie (CML) en seriële tests op de aanwezigheid van BCR-ABL-fusietranscripties. Ten slotte kan in gevallen waarin geen weefselbiopsie beschikbaar is, toch een moleculaire profilering van tumoren worden uitgevoerd via vloeistofbiopsie.

Belangrijke nadelen van vloeistofbiopsie zijn onder meer de noodzaak van een initiële histologische diagnose die moet worden verkregen door middel van een weefselbiopsie. Laboratoria die deze tests uitvoeren, moeten zich bewust zijn van het juiste gebruik van de test en de mogelijkheid van “overinterpretatie” in de klinische context. De lage variantfrequentie binnen het perifere bloed kan leiden tot hogere vals-negatieve percentages en vereisen aanzienlijk meer technische inspanningen en expertise om betrouwbare resultaten te verkrijgen.

Huidige en opkomende toepassingen

Het klinische gebruik van de vloeibare biopsie is aanzienlijk toegenomen sinds 2014, toen het eerste commercieel beschikbare multigene vloeibare biopsieplatform beschikbaar kwam. Verschillende assays zijn commercieel beschikbaar en FDA-goedgekeurd, en sommige worden door verzekeringsmaatschappijen als voldoende beschouwd om in aanmerking te komen voor behandeling. Bijvoorbeeld, in 2016 keurde de FDA de cobas® EGFR Mutatie Test v2 goed om te bepalen of patiënten met niet-kleincellige longkanker in aanmerking komen voor bepaalde EGFR tyrosinekinaseremmers . De toepassing van vloeibare biopsie om patiënten uit te sluiten van doelgerichte therapie heeft een veel tragere klinische toepassing gekend, vooral door bezorgdheid over vals-negatieve resultaten en algemeen toegankelijk tumorweefsel 3. Een toenemend klinisch gebruik is ook ingegeven door patiënten en artsen die doelgerichte mutaties willen identificeren voor off-label gebruik of voor inschrijving voor klinische proeven.

Tot de opkomende toepassingen van vloeibare biopsieën behoren het gebruik ervan als aanvulling op mutatieprofilering van weefselbiopsieën, beoordeling van de respons op behandeling, bewaking van residuele ziekte, detectie van ziekteherval en bewaking van het ontstaan van resistentiemutaties 3.

Toekomstige richtingen

De verwachte kankerspecificiteit van mutaties maakt ctDNA tot een aantrekkelijke biomarker voor de vroege opsporing van kanker, die een enorme impact op de patiëntenzorg zou kunnen hebben. Aangezien echter bekend is dat tumoren in een vroeg stadium zeer weinig DNA afgeven, zijn er veel technische uitdagingen die moeten worden overwonnen. Hoewel vloeibare biopsie een aantrekkelijk instrument kan zijn voor kankerscreening bij asymptomatische patiënten, moeten dergelijke toepassingen zorgvuldig en weloverwogen worden overwogen om buitensporig lijden van patiënten en kosten als gevolg van vals-positieve resultaten te voorkomen. Op korte termijn kunnen vloeibare biopsieën nuttiger zijn om maligniteit te bevestigen bij patiënten met reeds klinisch of radiografisch zichtbare laesies.

Conclusie

De literatuur die zich richt op ctDNA-tests breidt zich snel uit en ontwikkelt zich. Lopende gebieden van onderzoek omvatten pre-analytische processen, factoren die ctDNA detectiegraad, en prospectieve klinische studies beïnvloeden. We zullen waarschijnlijk een meer overheersende rol van ctDNA in de klinische zorg zien, aangezien voortgezet onderzoek naar CTC’s, cfDNA/RNA, en extracellulaire blaasjes een grotere resolutie zal verschaffen voor de momentopname van de tumorstatus die wordt verkregen door vloeibare biopsieën 4.