Terpinen-4-ol, het belangrijkste bioactieve bestanddeel in TTO, versterkte sterk de fluconazoolactiviteit tegen fluconazoolresistente C. albicans-stammen. De terpinen-4-ol MIC’s voor klinische C. albicans-stammen varieerden van 0,06% tot 0,25% (gemiddelde = 0,11 ± 0,09%). Voor C. albicans ATCC 10231 standaardstam was de terpinen-4-ol MIC 0,06%. De geteste C. albicans-stammen vertoonden geen kruisresistentie tegen terpinen-4-ol en fluconazol. Blootstelling van fluconazol-resistente klinische en standaard C. albicans-stammen gedurende 24 uur aan fluconazol en subletale doses (1/4 MIC) van terpinen-4-ol versterkte de fluconazol-activiteit tegen deze stammen sterk, en alle C. albicans-isolaten werden als vatbaar geclassificeerd (fluconazol-MIC daalde tot 0,125 μg/mL). We vatten de resultaten van deze studie samen, en de belangrijkste gegevens worden in tabelvorm weergegeven (Tabel 4).

4. Discussie

TTO is de meest gebruikte essentiële olie voor zijn antibacteriële en antischimmel eigenschappen . In deze studie evalueerden we de verandering in fluconazol activiteit in vitro tegen fluconazol resistente klinische Candida albicans stammen blootgesteld aan de subletale concentraties van TTO of terpinen-4-ol, het belangrijkste bioactieve bestanddeel van TTO. De eerdere in vitro studies van de gevoeligheid van Candida spp. voor TTO hebben aangetoond dat TTO zeer actief is tegen deze microben, evenals azol-resistente stammen, waarvoor de TTO MIC’s varieerden van 0,25% tot 0,5% . Voor de C. albicans-stammen die resistent waren tegen zowel fluconazool als itraconazool varieerden de TTO-MIC’s van 0,25 tot 1,0%, de TTO-MIC50 was 0,5%, en de TTO-MIC90 was 1% . Een andere studie toonde aan dat drie fluconazool-resistente klinische C. albicans-stammen zeer lage TTO MIC’s hadden (0,15% voor twee stammen en 0,07% voor de derde stam) .

De in deze studie uitgevoerde experimenten bevestigen de resultaten van eerder gepubliceerde studies in die zin dat alle geteste fluconazool-resistente C. albicans-stammen gevoelig waren voor TTO . De vastgestelde TTO MIC’s waren laag, variërend van 0,06% tot 0,5%. De antimicrobiële activiteit van TTO wordt voornamelijk toegeschreven aan terpinen-4-ol, het belangrijkste bioactieve bestanddeel van TTO. De vastgestelde MIC-waarden voor terpinen-4-ol waren zeer laag, variërend van 0,06% tot 0,25%. Onze studie en andere studies tonen aan dat C. albicans geen kruisresistentie vertoont tegen TTO en azole middelen. Klinische resistentie tegen TTO is niet gerapporteerd. De multicomponent aard van TTO kan de mogelijkheid voor het spontaan optreden van resistentie verminderen, en meerdere gelijktijdige mutaties kunnen nodig zijn om alle antimicrobiële acties van elk van de componenten te overwinnen. TTO kan dus worden gebruikt als een uitwendig antisepticum voor de effectieve behandeling van oppervlakkige mycosen veroorzaakt door Candida spp. die resistent is tegen fluconazol en andere azol-resistente gisten. Helaas kan TTO potentieel toxisch zijn wanneer het in hoge doses wordt ingenomen, en daarom mag TTO niet oraal worden toegediend. De acute orale toxiciteit van TTO is vergelijkbaar met de orale toxiciteit van andere gangbare etherische oliën, bijvoorbeeld eucalyptusolie . De lipofiele aard van TTO, waardoor het in de buitenste lagen van de huid kan doordringen, versterkt niet alleen de antiseptische werking, maar ook de mogelijkheid van toxiciteit van TTO door absorptie door de huid. TTO kan bij hogere concentraties huidirritatie veroorzaken en kan bij daarvoor vatbare personen allergische reacties teweegbrengen. Zhang en Robertson hebben een ototoxisch effect van 100% TTO waargenomen. De toxiciteit van TTO is dosisafhankelijk, en de meeste ongewenste voorvallen kunnen worden vermeden door TTO in verdunde vorm te gebruiken. TTO is niet mutageen of genotoxisch .

Er is toenemende belangstelling, niet alleen voor de activiteit van natuurlijke stoffen tegen resistente microben, maar ook voor de synergistische interacties tussen deze stoffen en conventionele geneesmiddelen . Fluconazol is een van de azole antischimmelmiddelen die op grote schaal worden gebruikt voor zowel profylaxe als therapie van Candida-infecties . In deze studie onderzochten we veranderingen in de activiteit van fluconazol tegen fluconazol-resistente C. albicans stammen na blootstelling aan subletale concentraties van TTO of terpinen-4-ol. We gebruikten uitsluitend fluconazol-resistente stammen omdat het identificeren van synergetische behandelingen voor deze stammen bijzonder belangrijk zou zijn. We testten subletale concentraties van TTO en terpinen-4-ol omdat we verwachtten dat concentraties lager dan de MIC de celstructuur zouden verzwakken zonder de cellen te doden, wat de activiteit van fluconazol zou vergemakkelijken en bijgevolg de resistentie van C. albicans tegen fluconazol zou afremmen. Uit onze resultaten blijkt dat korte blootstelling (0,5 uur) van fluconazolresistente C. albicans-stammen aan een subletale concentratie TTO (1/4 MIC TTO) geen invloed had op de antifungale activiteit van fluconazol. Blootstelling van C. albicans-cellen aan een subletale concentratie TTO en vervolgens behandeling met fluconazol remde echter de resistentie tegen fluconazol bij 87,5% van de geteste stammen. Deze resultaten suggereren dat er een synergetische interactie is tussen fluconazol en TTO tegen fluconazol-resistente C. albicans. TTO werd gebruikt om de celmembranen van de gist te permeabiliseren, waardoor de gevoeligheid voor fluconazool duidelijk wordt verhoogd. De TTO raakt ingebed in het lipide bilaagmembraan, waardoor de structuur ervan wordt verstoord, wat resulteert in een verhoogde permeabiliteit en een verminderde fysiologische functie. TTO remt ook de vorming van kiembuizen of de myceliale omzetting bij C. albicans en remt de ademhaling bij C. albicans op dosis-afhankelijke wijze. Schimmelcellen die aan TTO worden blootgesteld, zullen uiteindelijk scheuren. Subletale concentraties van TTO verzwakken ook de vitaliteit van Candida spp. cellen. Het mechanisme van de antischimmelwerking van fluconazol is anders. Aangetoond werd dat fluconazol interfereert met het cytochroom P-450-afhankelijke enzym C-14α-demethylase, dat verantwoordelijk is voor de productie van ergosterol. De verstoring van de ergosterolsynthese veroorzaakt structurele en functionele veranderingen in het schimmelcelmembraan, waardoor de schimmelcellen aan beschadiging worden blootgesteld. Remming van cytochrome oxidatieve en peroxidatieve enzymen is een bijkomende antischimmelwerking van fluconazol . Er zijn verschillende mechanismen beschreven voor de resistentie van C. albicans-isolaten tegen fluconazool: een verhoogde productie van lanosterol 14α-demethylase, gecodeerd door het ERG11-gen, en een verminderde affiniteit van lanosterol 14α-demethylase voor fluconazool als gevolg van mutaties in het ERG11-gen en een defect in Δ5-6 desaturase, gecodeerd door het ERG3-gen, waardoor de functie in de ergosterolroute verloren gaat. Het andere mechanisme van fluconazoolresistentie bij C. albicans is het actieve transport van geneesmiddelen over het plasmamembraan door “efflux pompen”, waarvoor expressie van de CDR1/2- en MDR1-genen nodig is. Door TTO veroorzaakte beschadiging van het celmembraan kan de functie van “efflux pompen” verstoren, waardoor de schimmelcel gevoeliger wordt voor fluconazool.

Uw gegevens tonen aan dat er in vitro een synergistisch effect is van subletale concentraties van TTO en fluconazool tegen fluconazool-resistente C. albicans stammen. De fluconazool-resistente C. albicans ATCC 10231 standaardstam en vier klinische C. albicans stammen verhoogden echter niet de gevoeligheid voor fluconazool. De verschillen in mechanismen van resistentie van deze stammen tegen fluconazol waren waarschijnlijk de oorzaak van dit effect. In onze in vitro studie was het hoofdbestanddeel van TTO, terpinen-4-ol, actiever dan TTO en versterkte sterk de fluconazool activiteit tegen alle bestudeerde fluconazool resistente C. albicans stammen. Mondello et al. en Ninomiya et al. stelden vast dat in vivo TTO en terpinen-4-ol even doeltreffend waren tegen candidiasis veroorzaakt door azol-resistente C. albicans. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de synergie tussen fluconazol en TTO werden niet opgehelderd. Yu et al. bevestigden het synergisme tussen fluconazol en triclosan tegen klinische isolaten van fluconazol-resistente C. albicans. Liu et al. constateerden een synergistisch effect tussen fluconazol en glabridine tegen C. albicans dat verband houdt met het effect van glabridine op de celomhulling. Ahmad et al. beschreven synergetische activiteit van thymol en carvacrol met fluconazol tegen Candida-isolaten. Beide monoterpenen remden de efflux met 70-90%, wat aantoont dat ze een groot vermogen hebben om de pompen van de drugtransporter te blokkeren.

Eerdere studies hebben ook de activiteit van TTO tegen verschillende micro-organismen in combinatie met andere antimicrobiële stoffen geëvalueerd. Er is een synergetisch effect waargenomen voor itraconazol en TTO in een thermogevoelige gel die wordt gebruikt voor de behandeling van vaginale candidiasis. Synergistische effecten zijn ook waargenomen tussen essentiële oliën en ciprofloxacine, gentamicine, cefixime, en pristinamycine . Bij een diffusietest met C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii en C. parapsilosis traden grotere groeiremmingszones op rond schijven die met TTO en amfotericine B waren geïmpregneerd dan rond schijven die alleen TTO bevatten. In een studie van Staphylococcus aureus kwamen grotere zones van groeiremming voor rond schijven die waren geïmpregneerd met TTO en andere etherische oliën in vergelijking met schijven die alleen met TTO waren geïmpregneerd. De korte voorbehandeling van Pseudomonas aeruginosa met een stof die het cytoplasmamembraan verstoort (carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazone, polymyxine B nonapeptide, of ethyleendiaminetetraazijnzuur) versterkte de bactericide activiteit van TTO, zoals blijkt uit de verhoogde snelheid van het doden van de microbe in de time-kill curves . In een studie waarbij gebruik werd gemaakt van de E-test methode, vertoonden Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, en coagulase-negatieve stafylokokken (CoNS) die gedurende 72 uur aan subletale concentraties van TTO werden blootgesteld echter een verhoogde resistentie tegen gentamicine, streptomycine, chlooramfenicol, tetracycline, erytromycine, trimethoprim, ampicilline, fusidinezuur, mupirocine, linezolid en vancomycine. Verhoogde antimicrobiële activiteit werd waargenomen wanneer essentiële oliën werden gecombineerd met hun geïsoleerde componenten (bijv. terpinen-4-ol uit Melaleuca alternifolia) en wanneer TTO werd gecombineerd met zilverionen .

De fractionele remmingsconcentratie (FIC) index, ook wel de FICI genoemd, wordt gebruikt om te bepalen of twee stoffen synergistisch of antagonistisch zijn. FIC-waarden kunnen verschillend worden geïnterpreteerd, maar in het algemeen duidt een FIC-index lager dan 0,5 op synergisme en een FIC-index hoger dan 4 op antagonisme . De FIC-indexwaarde voor TTO en tobramycine was 0,37 voor Escherichia coli en 0,62 voor Staphylococcus aureus, wat erop wijst dat deze twee stoffen synergistisch zijn. Een gering synergistisch effect werd waargenomen bij de behandeling van Candida albicans met TTO en amfotericine B en Klebsiella pneumoniae met TTO en ciprofloxacine. TTO en ciprofloxacine vertonen antagonistische effecten tegen Staphylococcus aureus. Er is geen synergistisch effect tussen TTO en lysostafine, mupirocine, gentamicine, of vancomycine tegen meticillineresistente Staphylococcus aureus-stammen. In feite gaf de FIC-index aan dat TTO en vancomycine antagonistisch zijn.

De resultaten van deze studie en andere eerdere studies tonen aan dat het combineren van natuurlijke stoffen zoals TTO en conventionele geneesmiddelen zoals fluconazol kan helpen bij de behandeling van moeilijke schimmelinfecties. Aanvullende in-vitro studies zijn echter nodig om de antimicrobiële activiteit van natuurlijke medicinale stoffen te identificeren en synergetische interacties met veelgebruikte antimicrobiële middelen te detecteren.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Aankondigingen

De auteurs willen graag het bedrijf MELALEUCA in Gliwice (Polen) bedanken voor het vriendelijk schenken van de Australische theeboomolie verkregen uit Melaleuca alternifolia, het bedrijf Polfarmex in Kutno (Polen) voor het vriendelijk schenken van de fluconazol, en het LABOMED Microbiologisch Laboratorium in Gliwice (Polen) voor het vriendelijk schenken van de klinische Candida albicans-stammen die in deze studie zijn gebruikt.