Human participants

スペインでの実験は大学病院ラ・フェ・バレンシアの倫理委員会による審査および承認を得て、ヘルシンキ宣言およびさらなる審査の信条を順守しています。 ベルリンでの実験は，Charité-Universitätsmedizin, Berlinの倫理委員会の承認を得た（EA4/012/05）。 1つは65人の健康な成人ボランティアからなり、もう1つはUSH2Aに異なる切断変異を持つアッシャー症候群（II型）患者16人からなるコホートであった。 2名は糖尿病の既往があり、1名は手根管症候群で、心理物理学的閾値に影響を与える可能性があるため、3名の患者のデータは本研究から省かれた。 試験参加者は、9つの心理物理テストからなるバッテリーを皮膚に貼付してテストを受けた。 参加者は全員、研究参加前に書面と口頭で説明を受け、書面による同意を得た。 研究参加者の中に、8809>20歳でない者はいなかった。 以下の参加者情報が記録された：年齢、性別、手の大きさ、聴覚デバイス（補聴器、人工内耳）、聴覚障害と失明症状の重症度、併存疾患。

ヒト定量感覚検査

神経障害性疼痛に関するドイツ研究ネットワーク44の定量感覚検査の標準的検査プロトコルに従って心理物理検査が実施された。 異なる周波数における振動触覚の知覚閾値は、二者択一のアッセイを使用して決定された1,2。 装置は、リニアピエゾアクチュエータ (Physik Instrumente, カタログ番号 P-602.1 L) で構成され、その変位はアンプ/コントローラ (Physik Instrumente, カタログ番号 E-665) で駆動・制御された。 信号はPowerLab（PowerLab 4/35，ADInstruments）データ収集システムで処理された。 振動刺激は1.8秒の長さで、試験周波数や振幅に依存せず、オンセットとオフセットでの立ち上がり時間と立ち下がり時間はそれぞれ500msと600msであった。 オンフェーズとオフセットフェーズの間の刺激時間は700msであった。 振動刺激のセットは、18nmから45μmの間で対数的にスケーリングされたものを採用した。 10Hz と 125Hz の振動試験では、開始振幅をそれぞれ 7.18μm と 2.84μm に設定した。 なお、今回使用した試験条件では、プローブの動きを直接測定することはしていない。 このピエゾアクチュエータは高い忠実度を示すが、アクチュエータの最大移動量（35μm）付近の大きな振幅の変位では、理論上、振幅の減衰が起こる可能性がある。 しかし、すべての実験参加者は、テストしたすべての周波数で35μmを大きく下回る心理物理学的閾値を示した（Fig.1c）。 なお、健常者とアッシャー症候群の被験者の測定には、全く同じ装置を使用した。 機械的な振動刺激は、爪床と小指の第一関節の間の皮膚に与えた。 プローブはガラス製で、直径5mmの平らな円形の接触部を持ち、すべての参加者に同じ程度の保持力がかかるように、真鍮製のカウンターウェイトを使用した。 利き手の小指は2つの周波数（10Hzと125Hz，1.8秒持続）で検査した。 参加者は、2つの時間窓のうち1つの時間窓で振動刺激を検出すると、ボタンを押して合図した。 プロトコルは、課題の成功率に応じて、刺激の振幅（18nmから45μmの間）を増減させるアップダウンデザインで構成されていた。 各患者の平均的な知覚閾値を作成するために、知覚閾値付近で8回のアップダウン振幅反転（1セッションあたり合計〜40〜80回の個別試行）が行われた。 ピエゾ素子で駆動する振動刺激の振幅は、顕微鏡下でプローブの変位振幅をステップ電圧増分に測定することで較正した。

また、指先（正中神経支配）の空間分解能の限界を調べるために、幅の異なるグレーティング（0.75, 1.25, 1.75, 3.0, 4.5, 6.0 mm）の6面からなる触覚視力キューブを用いて2区間の強制選択型触覚格子配向テストを行った1，2，3。 参加者は目隠しされ、立方体は指先に垂直または水平に当てられた。 2ダウンと1アップの手順が採用され、縞模様の大きさの転換点は10-15であった。 閾値（正答率71%）は、15ターニングポイントのうち最後の10ターニングポイントからの中央値として算出された2。 機械的検出閾値は、0.25～265mNの力で23本のvFhフィラメントの標準化セット（Optihair3-Set）を用いて決定された。 VFhは手の甲側（橈骨神経）に昇順に、参加者が触感を感じるまで1秒間印加された。 その後、被験者が触感を感じなくなるまで順位を逆転させた。 5回の反転の平均力を閾値とした。 機械的痛覚閾値は、先端が0.25mm、力が8～512mNの7個の加重ピンスティック刺激装置（MRC Systems社製）を用いて検査された。 単純階段法（ワンアップとワンダウンのルール）を行い、患者に刺激が刺すような痛みを感じさせる鋭さとして知覚されるかどうかを尋ねた。 刺激はvFh検出タスクの後、手背に適用した。 閾値は5回の反転の平均値から算出した。 熱的温冷感閾値と熱的痛覚閾値は、TSA II熱感覚分析器（MEDOC社製）を用いて検査した。 サーモードの面積は9cm2、カットオフ温度は0〜50℃、温度変化速度は1℃s-1であった。 サーモードは前腕中央部の掌側に設置した（内側前腕神経）。 各温熱試験において、冷感検出、温感検出、冷痛覚・温痛覚閾値の順に3回連続して試行を行った。 試験参加者には、どの時点で冷感、温感、冷痛、温痛を感じるようになったかを記入してもらった。 閾値は各試験の3試行の平均温度とした。

マウス

すべての実験は、ベルリン動物倫理委員会（Landesamt für Gesundheit und Soziales）の承認を受け、ヨーロッパの動物福祉法に従って実施された。 10週齢から30週齢のCBA/CaJ背景のUsh2a-/-マウスと野生型の同腹の雌雄（Ush2a+/+）が用いられた11。 すべての解剖学的および電気生理学的実験は、ほぼ同数の雌または雄マウスで行われた。 振動検出課題では雌マウスのみを用いた。 すべてのマウスは12時間明：12時間暗のサイクルで維持した。

マウス組織解剖と免疫組織化学

皮膚の免疫組織化学のために、マウスをCO2吸入で2-4分後に頸部脱臼させ、足皮膚組織を剥離し皮下組織、じん帯および付着筋組織を除去した。 皮膚サンプルは虫ピンを使って伸ばし、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で45分間固定した。 ゼラチンビブラトーム切片は、組織サンプルを埋込型（Polysciences, T-8）に入れ、温ゼラチン（20%, 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS) に溶解）を充填し、4℃、一晩4% PFAで後固定してからビブラトーム (Leica, VT100S) で120μm 切断を行った。 ホールマウント染色では，皮膚試料をPFAで2時間伸展した後，20%ジメチルスルホキシドと80%メタノールで4℃，24時間後固定した． 切断または後固定後、組織サンプルをPBS（0.1M）で3回洗浄し、ブロッキング溶液と一次抗体中で4℃、72時間インキュベートした。 その後、サンプルをPBSで3回洗浄してから、ブロッキング溶液で希釈した2次抗体で24時間インキュベート（4 ℃）した。 その後、組織を再び3回洗浄し、2，2′-チオジエタノール（TDE、Sigma-Aldrich）を用いて組織清澄化のために処理した。 切片は2時間ごとに10%から25%、50%、97%と濃度の上がるTDEに入れ、その中でサンプルを保存し、スライドにマウントしてカバースリップさせた。

Ush2Aを標的とするポリクローナル抗体はEurogentecによってウサギで作成された。 Ush2AのN末端とC末端の異なる結合エピトープに結合する4種類の抗体（N末端：抗体1、CSPLYNDKPFRSGDNV、抗体2、C+SWEKPAENFTRGEII、C末端：抗体1、C+ADTRLPRSGTPMSIR、抗体2、CIRERPPLVPLQKRMT）を作成し、使用前に抗血清より精製した。 ニワトリ抗NF200（Millipore、1：1，000）、ウサギ抗S100（Dako、1：1，000）またはモルモット抗CK20（Origen Tech、1：200）で順次染色する染色プロトコルに、4つの抗体すべてを一緒に使用した（1：200）。 二次抗体は、抗ウサギAlexa Fluor 488 (Invitrogen,1:800), 抗ニワトリAlexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), 抗マウスAlexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), 抗ウサギAlexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) および抗ギニーピッグAlexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) が使用された。 Zen2009ソフトウェアを用いて、共焦点顕微鏡（Carl-Zeiss、カタログ番号LSM700）でタイル状のz-stack画像を取得した。 NF200+およびS100+神経線維が神経支配するマイスナー小体および毛包は、Fiji/ImageJを用いて可視化および計数された。 坐骨神経の電子顕微鏡画像については、動物を灌流し、坐骨神経を解剖して4％PFAと2.5％グルタルアルデヒドで固定し、四酸化オスミウムで造影してからTechnovit 7100樹脂（Heraeus Kulzer）に包埋した。 超薄切片は5,600倍の倍率で撮影した。 有髄神経線維と無髄神経線維はFiji/ImageJソフトウェアを用いて計数・測定した。

再現性

すべての免疫組織化学実験と撮影画像は、異なる日に複数のマウスコホートで繰り返し行い、再現できない単体からの撮影画像は存在しない。

マウス皮膚神経調製と感覚求心性記録

皮膚感覚線維記録はex vivo皮膚神経調製を用いて実施した。 マウスはCO2吸入で2-4分後、頸椎脱臼で安楽死させた。 後肢の毛深い皮膚を支配する伏在神経21、後肢のglabrous皮膚を支配する脛骨神経、前肢のglabrous皮膚を支配する内側神経と尺骨神経20の3種類の調製を、異なる足部を使って別々の実験で実施した。 すべての準備において、四肢の有毛皮膚を剃毛し、皮膚と神経を自由に剥離して記録室に移し、記録品質を向上させるために皮膚から筋肉、骨、腱の組織を除去した。 記録室には32℃の合成間質液：123 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.7 mM NaH2PO4, 2.0 mM CaCl2, 9.5 mM gluconate sodium, 5.5 mM glucose, 7.5 mM sucrose and 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (Hepes), pH 7.4 を注入して灌流させた。 皮膚はピンアウトして伸ばし、刺激用プローブを用いて皮膚の外側を刺激できるようにした。 末梢神経は鉱油に浸した隣の部屋に送られ、そこで神経から細いフィラメントを引き出し、銀線記録電極上に置いた。

個々の機械受容器の受容野は、鈍いガラス棒または鈍い鉗子で皮膚の表面を機械的に探ることによって特定した。 Neurologアンプからのアナログ出力は、Powerlab 4/30システムとLabchart 7.1ソフトウェア（ADinstruments）を使用してフィルタリングされ、デジタル化された。 Labchart 7.1のスパイクヒストグラムエクステンションは、個々のユニットのスパイクをソートするために使用された。 電気刺激（1Hz，50-500msの矩形パルス）を単一ユニットの受容野に与え，伝導速度を測定し，C線維（速度 <1.2 m s-1），Aδ線維（同 1.2-10 m s-1）またはAβ線維（>10 m s-1）として分類できるようにした。 ピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente, カタログ番号 P-841.60）および力測定装置（Kleindiek Nanotechnik, カタログ番号 PL-FMS-LS）に接続したダブルエンド型ナノモータ（Kleindiek Nanotechnik, カタログ番号 MM-NM3108）でニューロンの受容野に機械刺激を与えた。 較正された力測定値は、実験中にPowerlabシステムとLabchartソフトウェアを使用して同時に取得した（拡張データ図10）。

異なる繊維タイプは異なる刺激同調特性を有するため、ユニットタイプに基づいて異なる機械的刺激プロトコルを使用した。 低閾値Aβ線維（RAMおよびSAM）およびAδ線維D毛は、6ステップにわたって振幅を増加させる3つの振動刺激（5Hz、25Hzおよび50Hz、直列力センサによってもたらされる歪みは、周波数>50Hzを使用できない）でピエゾアクチュエーターを使用して刺激した（ピーク-ピーク振幅は〜6-65 mNであった。 20サイクル/ステップ）、およびプローブのたわみ速度を変化させた4つのランプアンドホールド波形による動的刺激シーケンス（3秒持続；0.075, 0.15, 0.45, 1.5 mm s-1；平均振幅100 mN）。 Aβ線維SAMとRAMは、それぞれランプアンドホールド刺激の静止期における発火の有無によって分類した（既出20,21）。 さらに、振幅が増加するランプ・アンド・ホールド波形（3秒持続、〜10mNから260mNまで）を持つ5回の静的機械刺激で単一ユニットを刺激した。 また、低閾値SAM、高閾値Aδ線維、C線維は、ナノモーターを用いて、振幅を増大させた5回のランプアンドホールド刺激で刺激した20。 その後、マウスでは遠位半分が癒合している腓骨と脛骨を、骨間神経とともに動物から取り出し、カスタマイズした臓器槽に移し、カスタマイズしたミニバイスを使用してマウントした。 解剖手順全体は、108 mM N-メチル-d-グルカミン、20 mM Hepes、3.5 mM KCl、10 mM MgSO4、26 mM NaHCO3, 1.7 mM NaH2PO4, 9.5 mM gluconate sodium、5.5 mM glucose、 18.5 mM sucrose および 0.5 mM CaCl2 (NaOH で pH7.4 に調整)が入った氷冷解剖バッファ内で実施された。 10分間の回復期間の後、調製物を108 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.5mMの酸素添加記録緩衝液（35℃）で灌流した。7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.7 mM NaH2PO4, 9.5 mM グルコン酸ナトリウム, 5.5 mM グルコース, 7.5 mM ショ糖および 1.5 mM CaCl2 (NaOH で pH 7.4 に調整) を入れ、骨間神経近位端はオルガンバス室と隣の記録室とをつなぐ小さな穴（～直径1 mm）に通して油入り記録室に移し替えた。 ペリニューレを除去した後、単一フィラメントを自由に切り離し、活動電位記録用の記録電極に取り付けた。 記録はNeurologシステム（Digitimer Ltd、カタログ番号NL100AKおよびNL104A）およびLabChart 7.1（AD Instruments）で制御されるPowerLab 4SPを用いて行った。 Pacinian求心性神経の機械的活性化閾値と周波数同調を決定するため，ピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente GmbH，カタログ番号：NL100AK） に取り付けた金属棒（先端直径1mm）で，周波数（40～480Hz）が増加する一連の正弦波機械刺激（期間1秒，直線的に増加する振幅 damp/dt = 30μm s-1， 最大振幅30μm）を腓骨遠位端に印加した． P-840.2）。

マウス振動知覚学習課題

まず、頭部拘束具を埋め込むために、マウスをイソフルラン（O2中1.5〜2％）で麻酔し、メタミゾール（体重1kgあたり200mg）を皮下に注射した。 接着剤（UHUデント）と歯科用セメント（パラデュール）で軽金属支持体を頭蓋骨に植え付けた． マウスの体温は直腸プローブでモニターし、ヒーティングパッドを用いて37℃に保った。 その後、マウスはメタミゾール（200 mg ml-1）を飲料水に入れ、ホームケージに入れた。 手術後3-5日で移植マウスを頭部拘束に馴化させた。 マウスは、行動設定において頭部固定に徐々に慣らした。 次に、水制限開始1日後に2回のペアリングを連日行った。

ペアリングでは、前肢のglabrous skinに振動刺激（3秒持続、5Hz、60mN）を与え、刺激と報酬の関連性を構築しながら、水飲み口から水報酬を付与した。 振動刺激はピエゾアクチュエータ(Physik Instrumente社製PICMA、カタログ番号PL127.11)に取り付けた2mm2のクッション付きガラス棒を介して肉球に与えた。 各実験後にピエゾ素子によって印加された正弦波状の力プロファイルを力測定システム（Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific）を用いて測定し、電圧-力関係を較正した。 使用した曲げピエゾアクチュエータは、他の積層型ピエゾシステムと比較して、若干の高調波ノイズを付加している可能性がある。

ペアリング後、毎日のトレーニングセッションを開始し、刺激の開始時(3.5秒)の機会ウィンドウに正しく舐めたマウスには、注ぎ口から小さな水の報酬(4-7μl)を与えた。 キャッチ試行(刺激が提示されず、舐めた回数が誤報とみなされる試行)は全試行の50%として挟み込まれた。 試行の開始は3秒から30秒の間でランダムとした。刺激開始前の2秒間にマウスが舐めた場合は、3秒から30秒の遅延を与えて刺激-水報酬連関を促進した。 1回のトレーニングは約60回の試行（30×刺激＋30×キャッチ）で構成された。 訓練セッション中のパフォーマンスを評価するため、ヒット率と誤警報率を比較した。 前肢の振動刺激に反応してマウスが舐めることを確認するため、トレーニングの最後に刺激装置を前肢の下3-5 mmに移動し、皮膚接触をしないセッションを1回行った。 マウスが課題を学習した後の実験日において、振幅と周波数を変えた振動刺激を与えた。 5Hzの振動では、48 mN、36 mN、24 mN、12 mN、6 mNの力を用いて前肢を刺激し、各日中に2種類の振幅でキャッチトライアルを挟み込んだ。 例えば、48mNと24mNの刺激とキャッチ試行を1セッションにインターリーブし、約100回の試行を行った（33×48mN刺激＋33×24mN刺激＋34×キャッチ）。 6-mN 刺激は 2 回にわたって試行された。 25Hzと125Hzの振動については、同じ周波数の60mNと12mNの力を2回の試験セッションで同じようにキャッチ試行にインターリーブした。

マウス対パルス抑制行動アッセイ

マウスの驚愕反応は、スタートル応答システム (SR-LAB, San Diego Instruments) を用いて評価された。 マウスは試験前に3日間、毎日30分間、装置に馴化させた。 パルス単独試行45（40ms、129dB）とプレパルス＋パルス試行（20ms、69、73、81dB）を合計48回行い、マウスの驚愕反応を測定した。 プリパルス試行はパルス試行の200ms前に行った。 各プレパルス強度に対する％paired-pulse inhibition（％PPI）は、％PPI＝100×（（パルス単独）-（プレパルス＋パルス））／パルス単独として算出した。 実験日、マウスは昇降式メッシュプラットフォーム上の個々のプレキシグラスキュービクルに入れられた。 ブラシアッセイでは、左後肢を頭部2mmのペイントブラシで踵からつま先まで10回、ランダムな間隔でなでた。 引き抜き率を算出した。 その後の試験日において、vFhsを用いて機械的侵害性引出閾値を測定した。 簡単に言えば、左後肢足底面をvFhフィラメントで刺激し、アップダウン法46を用いて反射閾値を決定した。 動物の反応に応じて、より強いまたは弱いvFhを後肢に適用し、6～9回の正または負の一連の反射撤回を確立した。 8118>

ヒトの心理物理学データの解析

データの正規性を検定し、各テストにおける対照者とアッシャー症候群患者の心理物理学パフォーマンスの差を、対応のないスチューデントのt検定またはマン-ホイットニーのU検定を用いて比較した。 z変換は、単一の個人データプロファイルを健常対照の平均値およびs.d.と比較するために使用された。 zスコアは、z = (患者スコア – グループ平均のs.d.当たり)の式に基づいて、Excelスプレッドシートを使用して計算された。 z値＜4582＞0は、機能の獲得を示し、参加者が健常対照と比較してテストされた刺激に対してより敏感であることを意味する。 健常対照データセットの95％信頼区間の外側にある個々のzスコア（つまり、zスコア＜8809＞1.96または＜4582＞1.96 s.d.）は、識別することができる。 各テストにおけるパフォーマンスは、Mann-Whitney U-testを用いて一対比較で検定し、P < 0.01を統計的に有意とみなした。

マウス振動行動のデータ解析

リックは水報酬注ぎ口の先端のセンサーで記録された。 刺激試行では、刺激開始後3.5秒の機会ウィンドウ内に舐めがあった場合にヒットとカウントした。 行動データの収集にはLab Viewを用い，サンプリングレートは1kHz，解析にはカスタマイズしたPythonスクリプトを用いた． キャッチ試行では、同様に長い機会ウィンドウの間に舐めがあった場合に誤報が発生した。 マウスが検出課題をうまく学習できたかどうかを評価するために、二元配置反復測定分散分析（ANOVA）を用いて、同じトレーニングセッション内のヒット率と誤報率を比較し、ボンフェローニのポストホック検定を行った。

検出課題におけるパフォーマンスを定量化するために、舐め基準47における偏りを考慮し、正試行の割合の代わりにd’（感度指数）を使用した。 d’の算出には次の式を用いた：d’＝z（h）-z（fa）、ここでz（h）とz（fa）はそれぞれヒット率と誤報率の累積分布関数の正規逆数である。 d’の値が無限大にならないように、すべての試行が報告された場合（率＝1）、または報告されなかった場合（率＝0）、率はそれぞれ（1½N）または（½N）（Nは刺激が提示された試行の数48）に置き換わった。 ヒット率と誤報率のzスコアはOpenOffice Calc (Apache Software Foundation)のNORMINVという関数で計算した。 遺伝子型の少なくとも1つがd’ > 1.0を示し、これらのマウスが刺激を報告したことを示すデータのみに対して統計的検定を行った。 行動データはLab Viewのカスタマイズされたルーチンを用いて1kHzのサンプリングレートで収集し、解析にはカスタマイズされたPythonスクリプトを使用した。 カスタマイズしたコードとスクリプトはリクエストに応じて提供する。詳細はこの原稿に関連するNature Research Reporting Summaryに記載されている。

Lick behaviors were calculated and plotted as lick probability, first lick frequency (Hz) or mean first lick latency (s)． これらの指標は以下のように計算された：lick probabilityは刺激またはキャッチトライアルにおける機会ウィンドウの間にマウスが少なくとも1回舐める確率（少なくとも1回舐めたトライアル/全トライアル）である。 初回舐めのPSTHでは、刺激試行または捕獲試行における初回舐めの潜時の分布をビン分けして示している。 これらのデータをマウス間で正規化するために、初回舐めの回数を全試行数で割った。 初回リックの値をビン幅で割ることで、ヘルツ単位の値（licks per s）を算出した。 各ヒット試行の初回舐めの潜時を加算し、総試行数で割ることにより、平均初回舐めの潜時（s）を算出した。

皮膚神経準備記録のデータ解析

前足と後足の皮膚単位は伝導速度と機械刺激に対する応答に基づいて分類された。 機械的閾値は、最初の活動電位を誘発するのに必要な温度または機械的振幅として計算された。 すべての統計解析はGraphPad Prism 6.0とPythonを用いて行った。 統計学的検定には，二元配置反復測定ANOVAとボンフェローニのポストホック検定，Studentのt検定，Mann-Whitney U検定，Wilcoxonのマッチドペア検定が含まれる． データの正規性の評価にはKolmogorov-Smirnov検定を使用した。 図中のアスタリスクは統計的有意性を示す。 *8118>

マウス神経電子顕微鏡のデータ解析

マウス坐骨神経電子顕微鏡写真の解析では、1神経あたり12切片で有髄線維と無髄線維の数を数えた。 8118＞＜312＞報告概要＜8467＞＜7703＞研究デザインに関する詳細な情報は、本論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryに掲載されています。